Optimierung der Renalorganoid- und Organotypischen Kultur für Vaskularisation, erweiterte Entwicklung und verbesserte Mikroskopie-Bildgebung

Zusammenfassung

Diese Arbeit beschreibt zwei Methoden zur Untersuchung der Organentwicklung, eine verbesserte Xenotransplantation auf chorioallantoischer Membran (CAM) aus Aviären Embryonen, die eine Vaskularisation kultivierter embryonaler Organe und Organoide ermöglicht, und eine neuartige feste Z-Richtung. Organkulturmethode mit modifizierten experimentellen Bedingungen, die eine hochauflösende Zeitraffer-Konfokalbildgebung ermöglicht.

Zusammenfassung

Embryonale Nierenorganotypische Kulturen, insbesondere pluripotente Stammzell-abgeleitete Nierenorganoide, sind ausgezeichnete Werkzeuge, um Entwicklungsprozesse zu verfolgen und Nierenerkrankungen zu modellieren. Die Modelle sind jedoch durch einen Mangel an Vaskularisation und Funktionalität eingeschränkt. Um diesem Problem zu begegnen, wurde ein verbessertes Protokoll für die Methode der Xenogtransplantation von Zellen und Geweben an die chorioallantoische Membran (CAM) eines Aviären Embryos entwickelt, um Vaskularisation und Wiederherstellung des Blutflusses zu erhalten. Die Transplantate sind mit maßgeschneiderten Minireservoirs überzogen, die die Proben am CAM fixieren und mit einem Kulturmedium versorgen, das die Transplantate vor dem Trocknen schützt. Die verbesserte Kulturmethode ermöglicht xenografts bis zu 9 Tage lang zu wachsen. Das Manuskript beschreibt auch, wie optimale Bedingungen für die langfristige konfokale Bildgebung von Renalorganoiden und organotypischen Kulturen mit der zuvor veröffentlichten Fixed Z-Direction (FiZD)-Methode zur Verfügung gestellt werden können. Diese Methode komprimiert sanft ein embryonales Organ oder Organoid zwischen einem Glasdeckel und einer Membran in einer großen Menge an Medium und bietet hervorragende Bedingungen für die Bildgebung für bis zu 12 Tage. Zusammen ermöglichen diese Methoden Vaskularisation und Blutfluss zu Nierenorganoiden und organotypischen Nierenkulturen mit verbesserter konfokaler Bildgebung. Die hier beschriebenen Methoden sind sehr vorteilhaft für die Untersuchung grundlegender und angewandter Funktionen der Nieren ex vivo. Beide Methoden sind auf verschiedene Arten von Geweben und Organoiden anwendbar.

Einleitung

Organotypische Kultur der embryonalen Nieren wurde ein wichtiges Modell zur Studie Nephrogenese vor Jahrzehnten^1,2,3. Nierenorganoide stellen ein fortschrittliches Modellsystem zur Untersuchung der Entwicklung gesunder und kranker Nieren^{dar 4}. Der Hauptnachteil für beide Methoden ist jedoch, dass keine der beiden Methoden die Hauptfunktion der Niere rekapituliert: Blutfiltration. Nephronen und Renalvaskulatur entwickeln sich in Renalorganoiden und organotypischen Kulturen ähnlich wie im frühen Stadium der In-vivo-Entwicklung; die in vitro gebildeten Glomeruli bleiben jedoch avaskulär⁵. Die Vaskularisation von ex vivo embryonalen Nieren und Nierenorganoiden wurde zuvor in Transplantationsexperimenten nur unter in vivo-Bedingungen nachgewiesen. Zum Beispiel ermöglicht die Transplantation von menschlichen pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Nierenorganoiden unter einer Mausnierenkapsel die Entwicklung der Nephone im Organoid zu einem funktionellen Stadium⁶.

Ein Zwischenansatz zwischen reinen In-vitro-Kulturen und In-vivo-Transplantationsmethoden ist die Xenotransplantation in das CAM von Vogelembryonen. Die Vaskularisation der intakten Mausnierenprimordie wurde zuvor mit diesem System^7,8demonstriert. Es wurde jedoch auch gezeigt, dass die Renalvaskulatur in der xenotransplantierten murinen Niere vom Wirtenendothel und nicht vom Transplantat⁹abgeleitet wurde. Diese Beobachtung reduzierte signifikant das Potenzial von chimären (avian-mammalian) Modellen der embryonalen Niere, die Entwicklung der Nierenvaskulatur zu untersuchen, da die experimentellen Bedingungen für das Überleben von spenderabgeleiteten Endothelzellen nicht freizügig waren.

Im ersten Teil dieses Protokolls wird eine verbesserte Methode für die Kultivierung von Maus-Embryonalnieren auf CAM von Aviären Eiern vorgestellt, die mikroökologische Bedingungen der organotypischen Kultur und Xenotransplantation kombiniert. Die wichtigste Verbesserung gegenüber früheren Methoden ist, dass statt der Maus embryonale Nieren und Nierenorganoide direkt auf dem CAM, der Implantationsbereich mit durchlässigen Minireservoirs gefüllt mit Kulturmedium, die das transplantierte Gewebe liefern überlagert werden mit Nährstoffen und schützen Sie sie vor dem Trocknen. Die Erfolgsrate der Experimente steigt deutlich an und die Bedingungen für die Entwicklung der von Spendern abgeleiteten Vaskulatur verbessern sich. Die Anwendung dieser Methode auf Xenotransplant-Kulturen führt zur Entwicklung einer glomerulären Vaskulatur, die aus endogenen Endothelzellen aus Spendernieren besteht.

Die detaillierte Analyse der zellulären Morphogenese ist eine weitere wichtige Anwendung von Nierenkulturmodellen. Zuvor berichtete Methoden der Zeitraffer-Bildaufnahme von Nierenkulturen reichen nur für die Analyse der Gesamtmorphologie und DerMusterung der embryonalen Niere aus, nicht aber für die Verfolgung einzelner Zellen¹⁰. Kürzlich wurde eine neuartige Fixed Z-Direction (FiZD) Methode beschrieben, die auf eine hochauflösende konfokale 3D-Zeitraffer-Bildgebung von Renalorganoiden und organotypischen Kulturen abzielte¹¹. Bei diesem Verfahren werden die Organoide und embryonalen Organe sanft zwischen einem Glasdeckel und einer durchlässigen Membran eines Transwell-Einsatzes in einer kundenspezifischen Platte zusammengedrückt, bis die Dicke der Probe 70 m erreicht, was optimale optische Bedingungen für die Bildgebung bietet. Im zweiten Teil der Methoden wird ein detailliertes Protokoll zur Herstellung einer kundenspezifischen Platte und zur Einrichtung von FiZD-Experimenten für die langfristige organoide Bildgebung beschrieben.

Protokoll

Die Tierpflege und -verfahren entsprachen den finnischen rechtsvorschriften Vorschriften für die Verwendung von Labortieren, dem Europäischen Übereinkommen zum Schutz von Wirbeltieren, die für versuchs- und andere wissenschaftliche Zwecke verwendet werden (ETS 123), und der EU-Richtlinie 86/609/EWG.

1. Herstellung von Minireservoirs für die Kultivierung von mausembryonalen Nieren und Nierenorganoiden auf Hühner-CAM und Einrichtung von Xenotransplantationsexperimenten

1. Verwenden Sie Transwell-Zellkultureinsätze für 6 Well- oder 12-Well-Platten.
   HINWEIS: Je nach Experiment können große oder kleine Minireservoirs verwendet werden. Es ist am besten, kleine Minireservoirs für Xenografting bis zu acht embryonale Nieren oder wenn mehrere Minireservoirs auf demselben Hühnerembryon platziert werden (z. B. Experimentier- und Kontrollproben an demselben Hühner-CAM) zu verwenden.
2. Schneiden Sie die Seiten der Einsätze mit einem Rotierenden Multitool mit einem Kreissägeblatt oder einer Handsäge ab, um einen 2 mm hohen Kunststoffring mit einer durchlässigen Membran zu erzeugen.
3. Polieren Sie die Ränder dieser Minireservoirs mit einem Skalpell oder einem scharfen Messer.
4. Sterilisieren Sie die Minireservoirs in 70% Ethanol für mindestens 1 h.
5. Waschen Sie die Minireservoirs in autoklaviertem doppelt destilliertem Wasser und lassen Sie sie in einer laminaren Haube trocknen.
6. Spülen Sie die Minireservoirs in PBS und Kulturmedium (hochglucoseiert DMEM/10% FBS/1% Penicillin-Streptomycin).
7. Legen Sie das Reservoir in eine Petrischale, auf einem Tropfen (600 l/400 l) Kulturmedium mit der Membran nach oben.
8. Mit Hilfe einer Pipette oder eines Glaskapillarrohrs sezierte ex vivo embryonale Nieren oder Renalorganoide gleichmäßig auf der Membran anordnen. Vermeiden Sie es, viel Flüssigkeit um die Nieren zu lassen.
9. Lassen Sie die Proben für 2–24 h in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 °C und 5%_CO2an der Membran befestigen.
   HINWEIS: Bis zu acht E11.5 embryonale Mausnieren oder Nierenorganoide können auf dem kleinen Einsatz angeordnet werden. Der große Einsatz wird empfohlen, wenn entweder größere Stücke embryonalen Gewebes für Xenotransplantat oder ein Zell-Hydrogel-Gemisch auf einer größeren Fläche des CAM verwendet werden.
10. Nehmen Sie 8 Tage alte ex ovo kultivierte embryonale Hühner, die nach zuvor veröffentlichten Methoden aus dem Zellkultur-Inkubator^12,13hergestellt wurden.
11. Übertragen Sie die Minireservoirs auf das CAM, so dass die Transplantate dem CAM zugewandt sind und die Membran sie überlagert. Legen Sie die Minireservoirs in die Peripherie des CAM, damit sie den Hühnerembryon nicht abdecken.
    HINWEIS: Bei Verwendung der kleineren Minireservoirs, die aus Transwell-Einsätzen für 12 Well-Platten hergestellt werden, können bis zu drei Minireservoirs auf einem CAM platziert werden.
12. Fügen Sie den Minireservoirs 500 l (6 Well Insert) oder 300 l (12 Well insert) des Kulturmediums hinzu.
13. Kultivieren Sie die Proben auf Huhn CAM für maximal 9 Tage. Ersetzen Sie das Kulturmedium in den Minireservoirs täglich.
    HINWEIS: Die Vaskularisation der Proben kann bereits nach 24–48 h nach der Transplantation beobachtet werden.

2. Herstellung von kundenspezifischen Platten und Einrichten von FiZD-Kulturen

1. Bohren Sie Löcher mit 20 mm Durchmesser in den Boden einer 6-Well-Platte.
   HINWEIS: Für FiZD-Experimente verwenden Sie 6 Wellplatten mit einer Welltiefe von 16 mm (siehe Materialtabelle).
2. Polieren Sie die Felgen der Löcher (vor allem auf der Oberseite) mit einem elektrischen Bohrer mit einem Senkmittelbohrer, einem Skalpell oder einem scharfen Messer.
3. Sterilisieren Sie die Platten in 70% Ethanol für mindestens 1 h.
4. Waschen Sie die Platten in autoklaviertem doppeldestilliertem Wasser und lassen Sie sie unter sterilen Bedingungen trocknen.
5. 22 mm x 22 mm Glasabdeckungen mit 70% Ethanol gründlich waschen oder nach dem veröffentlichten Protokoll von Saarela et al.¹¹reinigen.
6. Kleben Sie die Abdeckungen an der Oberseite der Löcher in 6 Brunnenplatten mit einem ungiftigen Gewebekleber. Tragen Sie Kleber um das Loch auf und legen Sie den Deckel vorsichtig auf, um es zu bedecken. Lassen Sie den Kleber trocknen.
7. Prüfen Sie die Platten unter einem Stereomikroskop und entfernen Sie bei Bedarf überschüssigen getrockneten Kleber von der Oberfläche der Abdeckungen.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sich kein Kleber über dem Deckelbeleg befindet, um eine gleichmäßige Kompression der Proben zu gewährleisten.
8. Mischen Sie Polystyrolperlen (70 m Partikelgröße) mit einem gleichen Hydrogelvolumen. Ein Volumen von 50–100 l pro Brunnen ist ausreichend.
   HINWEIS: Halten Sie die Mischung aus Hydrogel und Polystyrol perlen auf Eis.
9. Legen Sie einen Transwell-Einsatz unter ein Sezierendes Mikroskop mit der Membran nach oben.
10. Ordnen Sie die Proben (z. B. ex vivo embryonale Nieren oder Renalorganoide) gleichmäßig auf der Membran an.
11. Fügen Sie das Hydrogel/Polystyrol-Perlengemisch neben den Proben sorgfältig hinzu, um Schäden an empfindlichen Geweben zu vermeiden.
12. Drehen Sie den Transwell-Einsatz so um, dass die Membran mit den darauf montierten Proben nach unten gerichtet ist.
13. Legen Sie den Einsatz vorsichtig in einen Brunnen der modifizierten 6 Well-Platte und drücken Sie ihn vorsichtig nach unten, so dass die Proben auf das Niveau der Perlen komprimiert werden.
    HINWEIS: Verfolgen Sie den Fortschritt der Kompression mit einem Mikroskop.
14. Halten Sie den Einsatz mit einer Hand leicht auf den Brunnen gedrückt und fixieren Sie ihn an der Platte, indem Sie Kunststoff mit einem Lötkolben an drei Stellen am Rand des Einsatzes schmelzen.
15. Wenn der Einsatz an der Platte befestigt ist, fügen Sie 2 ml Kulturmedium (DMEM/10% FBS/1% Penicillin-Streptomycin) in den Brunnen und setzen Sie die Montage der verbleibenden Brunnen in der Platte auf die gleiche Weise fort.
16. Übertragen Sie die fertige Platte auf einen inder Inkubator eines invertierten Mikroskops für die Zeitraffer-Bildgebung.
17. Führen Sie die Zeitraffer-Bildgebung der Proben mit den entsprechenden experimentellen Einstellungen durch.
    HINWEIS: Eine Änderung des Kulturmediums in den Blechen während Zeitrafferexperimenten ist nicht erforderlich, kann aber leicht durch die Löcher an den Seiten des Einsatzes durchgeführt werden.

Ergebnisse

Das hier vorgestellte CAM-Kulturprotokoll ermöglichte eine hocheffiziente Vaskularisation von Nierenorganoiden und embryonalen Nieren als Folge einer Xenotransplantation am Hühner-CAM (Abbildung 1, Film 1). Minireservoirs, die Kulturmedium enthalten, versorgten das Spendergewebe mit Nährstoffen und schützten es während des Zeitraums vor der eigentlichen Vaskularisation vor dem Trocknen. Diese Methode bot freizügige Bedingungen für Spender-abgeleitete Endothelzellen zu...

Diskussion

Es werden zwei detaillierte Protokolle vorgestellt, die die klassische renale organotypische Kulturmethode verfeinern und Vaskularisation, erweiterte Entwicklung und optimale 4D-Bild- und Zeitbildgebung von ex vivo embryonalen Nieren und Organoiden ermöglichen. In diesem Abschnitt werden die wichtigen Schritte in den Methoden erläutert und die Fehlerbehebung erläutert.

Der signifikante Unterschied zwischen anderen CAM-Kulturmethoden und dieser verbesserten Hühner-CAM-Kulturmethode ist die ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adjustable Spade Drill Bit	Bosch	2609255277	For drilling 20 mm diameter holes
Automatic Egg Turner	OLBA B.V., Netherlands	AT-42	For incubation of eggs before ex ovo setup.
Cell Incubator	Panasonic	13090543	Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2
Cell Incubator	SANYO	10070347	Chicken CAM-culture incubator. Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2
Cellstar 6-well Plate	Greiner	M9062	16 mm depth of wells to match with the inserts
Circular Saw Blade for Dremel Rotary Tool	Dremel	SC690
Confocal Microscope	Zeiss	LSM780
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polycarbonate Membrane Inserts	Corning	10301031	For 6-well plates. 40 µm pore size
Countersink Drill Bit	Craftomat, Bauhaus	22377902	For polishing (20.5 mm, 1/4", HSS)
Disposable Glass Capillary Tube	Blaubrand	7087 33
Disposable Scalpel	Swann-Morton	0501
Dissecting Microscope	Olympus	SZ61
Drilling Machine	Bosch	GSR 18 V-EC Professional
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma	D777	High glucose
Egg Incubator Compact S84	Grumbach, Germany	8012	For incubation of eggs before ex ovo setup. Temperature set at 38° C with relative humidity set above 60%
Ethanol (70%)	VWR
Fertilized Eggs	Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finland		Hy-Line White and Nick Chick
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH3007003HI Thermo Scientific
Forceps DUMONT #5	Dumont	#5SF
Glass Coverslips	Menzel-Gläser	Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0##	22x22 mm
Histoacryl Glue	Braun	1050052
Matrigel	Corning	356230
On-stage Incubator	Okolab		Boldline, custom made
PBS -/-	Corning	20-031-CV
PBS +/+	Biowest	X0520-500	Washing the mini reservoirs.
Penicillin and Streptomycin	Sigma	P4333
Polystyrene Beads	Corpuscular	1000263-10	70 µm in diameter
Rotary Multi Tool System	Dremel	4000
Soldering Iron	Weller	TCP S	Heated glass capillary can also be used
Thincert 12-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane	Greiner Bio-One	665641
Thincert 6-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane	Greiner Bio-One	657610