In situ Hybridisierung für Sipunculus nudus Coelomic Fluid

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt einen effektiven In-situ-Hybridisierungsansatz, um die mRNA-Expressionsniveaus und räumlichen Muster von Zielgenen in Sipunculus nudus coelomic Fluid zu erkennen.

Zusammenfassung

Die In-situ-Hybridisierung (ISH) ist eine sehr informative Technik, um zelluläre Verteilungsmuster bestimmter Gene (z. B. mRNA und ncRNA) in Geweben darzustellen. Der Sipunculid-Wurm Sipunculus nudus ist eine wichtige Fischereiressource, da er hohe nährwert- und medizinische Werte hat. Derzeit steckt die Erforschung der Molekularbiologie von Sipunculus nudus noch in den Kinderschuhen. Der Zweck dieses Artikels ist es, eine empfindliche Methode zur Lokalisierung spezifischer mRNA in Sipunculus nudus coelomic Fluid zu entwickeln. Das Protokoll enthält detaillierte Schritte der ISH, einschließlich Digoxigenin-markierter Antisense- und Sense-Riboprobe-Vorbereitung, coelomischer Flüssigkeitssammlung und Abschnittsvorbereitung, spezifischer Riboprobe-Hybridisierung, Antikörperinkubation, Färbung und Nachfärbungsbehandlungen. Die repräsentativen Ergebnisse eines erfolgreichen Experiments mit dieser Methode werden demonstriert. Das Protokoll sollte auch für andere Sipuncula-Arten gelten.

Einleitung

Die ISH ist mit Hilfe einer markierten Nukleinsäuresonde, um die spezifische DNA- oder RNA-Sequenz von Interesse zu erkennen, eine nützliche Methode, um das räumliche Expressionsmuster von Zielgenen in morphologisch konservierten Geweben^1,2,3zu beschreiben. Normalerweise wird die Zielsequenz durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) erzeugt und dann als Vorlage zur Synthese der antisense/sense RNA-Sonde mit Digoxigenin-Uridin-5'-Triphosphat verwendet. Die Proben werden vor der Inkubation mit Riboprobe fixiert und permeabilisiert. Nach dem Abwaschen der überschüssigen Sonde wird die Hybridisierung durch Immunhistochemie mit einem Anti-Digoxygenin-Antikörper visualisiert, der alkalische Phosphatase-konjugierte^3,4,5,6ist.

Sipunculus nudus (Phylum Sipuncula; Ordnung Sipunculida: Sipunculidae) ist ein unsegmentierter, koeloatischer und bilateral symmetrischer Meereswurm^7,8. Sipunculus nudus ist eine kosmopolitische Art, die in tropischen und gemäßigten Küstengewässern verbreitet ist. Es ist auch eine wichtige Meeresfischerei Ressource in Südchina wegen seiner hohen Nährwert und medizinische Werte^9,10. Sipunculus nudus in der Molekularbiologie steckt jedoch noch in den Kinderschuhen. Um die biologische Rolle von Genen vollständig zu verstehen, ist die Untersuchung von Genexpressionsmustern bei einer zellulären Auflösung von großem Interesse. Im Nichtmodellorganismus Sipunculus nudusist die ISH-Methode, die eine ideale Methode zum Nachweis der Genexpressionsmuster ist, noch nicht etabliert. Seine koelomische Flüssigkeit enthält mehrere Zelltypen, einschließlich Granulozyten, Urnenzellen, vesikuläre Zellen, Keimzellen, Erythrozyten, etc¹¹. Der Doppelsex/mab-3-bezogene Transkriptionsfaktor-1 (dmrt1), der als repräsentatives Gen bei dieser Methode verwendet wird, ist ein hochkonservierter Transkriptionsregulator für die Geschlechtsbestimmung und -differenzierung bei den meisten Arten, die von Wirbellosen bis zu Säugetieren reichen^12,13. In einer Reihe von Arten (z. B. schwarze Porgie, etc.) ¹⁴, dmrt1 wurde in den Sertoli-Zellen ausgedrückt, die die Keimzellen umgeben, deren Funktion den Trophoblastenzellen von Sipunculus nudusähnelt. Daher vermuteten wir, dass dmrt1 von Sipunculus nudus in Trophoblastenzellen von Spermatozeugmata exprimiert wird, und das Ergebnis der ISH-Methode bestätigte eindeutig die Hypothese.

Dieses Protokoll beschreibt zum ersten Mal die ISH mit digoxigenin-markierten Antisense/Sense mRNA-Sonden, um mRNA-Expressionsmuster in ihrem coelomischen Flüssigkeitsabstrich zu bestimmen. Es werden optimale Reaktionsbedingungen bereitgestellt, die eine sehr empfindliche Visualisierung der mRNA-Expression bei hoher Auflösung ermöglichen. Die entwickelte ISH-Methode könnte möglicherweise bei mehr Sipunculida-Arten außer Sipunculus nudus angewendet werden.

Protokoll

Das Tierverfahren wurde vom Animal Care and Welfare Committee der Huaqiao University genehmigt.

1. Riboprobe Vorbereitung

1. Primer-Design
   1. Öffnen Sie das Programm Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/). Kopieren Sie die dmrt1-Sequenz (GenBank: MK182259) in das Sequenzfenster.
   2. Grundierungslänge (23-25 bp), Schmelztemperatur (55-60 °C) und G/C-Gehalt (40-60%). Klicken Sie auf Primer auswählen.
      HINWEIS: Die für die RNA-Sonde erforderliche Mindestgröße beträgt ca. 500 bp. Längere Sonden haben normalerweise eine höhere Spezifität.
   3. Fügen Sie die T7-RNA-Polymerase-Promotorsequenz (5^, -TAATACGACTCACTATAGGG-3^,) zu einem der ausgewählten Primer hinzu. Die dmrt1 Primersequenzen für ISH sind in Tabelle 1dargestellt.
      HINWEIS: Bei Sinnessonden befindet sich der T7-RNA-Polymerase-Promotor am 5'-Ende der Vorwärtsprimer. Bei Antisense-Sonden befindet sich der T7-RNA-Polymerase-Promotor am 5'-Ende der Reverse-Primer.
2. PCR-Verstärkung
   1. Legen Sie die Mikrofugenrohre auf Eis und bereiten Sie den folgenden Reaktionsmix vor (für eine 50-L-Reaktion): 1x Taq-DNA-Polymerase-Mix, 1 g cDNA (die aus 100 l coelomischer Flüssigkeit hergestellt wird), 1 'M Vorwärtsprimer, 1 'M Reverse Primer und nukleasefreies Wasser.
   2. Mischen Sie die PCR-Reaktion durch Pipettieren und Zentrifugen kurz.
   3. Legen Sie das Reaktionsrohr in einen thermischen Cycler und führen Sie die PCR unter folgenden Bedingungen aus: anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 2 min, gefolgt von 36 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 30 s, Glühen bei 55-60 °C für 30 s, Verlängerung bei 72 °C für 30 s und Endverlängerung bei 72 °C für 7 min.
      HINWEIS: Die Glühtemperatur sollte entsprechend den Primern optimiert werden.
3. PCR-Produktreinigung und -verifizierung
   1. Laden Sie die 50 l PCR-Mischung direkt auf ein 1% Agarose-Gel. Führen Sie das Agarose-Gel bei 150-180 V für 10 min in 0.5x TBE. Isolieren Sie die spezifischen DNA-Fragmente aus dem 1% Agarose-Gel.
      HINWEIS: DNA sollte als einzelnes Band und nicht als Abstrich erscheinen.
   2. Reinigen Sie die DNA-Fragmente mit einem Gel-Extraktions-Kit gemäß dem Herstellerprotokoll. Quantifizieren Sie die gereinigten Produkte durch Spektrophotometrie bei einer Wellenlänge von 260 nm.
   3. Überprüfen Sie die Authentizität der PCR-Produkte durch Sequenzierung.
      HINWEIS: (Pausepunkt) Die gereinigten PCR-Produkte können mehrere Monate bei -20 °C gelagert werden.
4. Riboprobe-Synthese
   1. Legen Sie die RNase-freien Mikrofuge-Röhren auf Eis und fügen Sie dem Mikrofugenrohr Folgendes hinzu (für eine 10-L-Reaktion): 1x Digoxygenin RNA Labeling Mix, 1x Transkriptionspuffer, 0,5 l RNase-Inhibitoren, 1 L T7-RNA-Polymerasen, 1 g PCR-Produkt und RNase-freies Wasser. Mischen Sie die Reaktion durch Pipettieren und Zentrifugen kurz. 2 h bei 37 °C inkubieren.
   2. Fügen Sie 2 L RNase-freie DNase I hinzu. Mischen Sie die Reaktion durch Pipettieren und Zentrifugen kurz. 15 min bei 37 °C inkubieren.
   3. Fügen Sie 2 L 0,2 M EDTA (pH 8,0) hinzu. Mischen Sie die Reaktion durch Pipettieren und Zentrifugen kurz.
   4. Fügen Sie der obigen Reaktion 2,5 l 4 M LiCl und 75 l vorgekühltes Ethanol hinzu. Gut mischen. 30 min bei -70 °C lassen.
   5. Zentrifuge bei 12.000 x g für 10 min bei 4 °C. Decant das Ethanol. 1 ml vorgekühltes 70% Ethanol (v/v) hinzufügen und den Niederschlag durch sanftes Mischen waschen.
   6. Zentrifuge bei 12.000 x g für 5 min bei 4 °C. Das 70% Ethanol dekantieren und den Niederschlag kurz in der Nähe einer Alkohollampe trocknen. Lösen Sie den Niederschlag auf, indem Sie 30 l RNase-freies Wasser hinzufügen und sanft mischen.
   7. Laden Sie 2 l synthetisierte RNA auf ein 1% Agarose-Gel. Führen Sie das Agarose-Gel bei 180 V für 5-10 min in 0.5x TBE. Messen Sie die Konzentration der beschrifteten RNA mit einem Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 260 nm.
      1. Verwenden Sie RNase-freie Mikrofugenrohre und Filterspitzen, um eine RNase-Kontamination zu vermeiden.
         HINWEIS: (Pausepunkt) Die mit Digoxygenin beschrifteten Sonden können mehrere Monate bei -70 °C gelagert werden.

2. Coelomic Flüssigkeitssammlung

1. Fixieren Sie den S. nudus auf dem Seziertisch mit Stiften. Öffnen Sie den Körper des S. nudus mit einer kleinen autoklaven Schere. Isolieren Sie die coelomische Flüssigkeit mit einer Pipette.
2. Sammeln und übertragen Sie 1 ml coelomische Flüssigkeit mit einer Pipette auf poly-D-Lysin behandelte Mikroskopschlitten. Tragen Sie die coelomische Flüssigkeit gleichmäßig mit einer Pipettenspitze auf. Die Schlitten 1 h bei 37 °C lufttrocknen.

3. In-situ-Hybridisierung

1. Tag 1
   1. Rehydrieren Sie die Dias in einem Dia-Färbeglas mit 100 ml 1x diethylpyrocarbonat behandelter Phosphat gepufferter Saline (DEPC-PBS). 3 mal mit 1x DEPC-PBS rehydrieren, 5 min pro Wäsche mit sanfter Rührung.
   2. Permeabilisieren Sie den Abstrich von coelomischer Flüssigkeit durch Verdauung mit 10 g/mL-Proteinase K bei Raumtemperatur für 5 min. Inkubieren Sie die Dias in 4% Paraformaldehyd (PFA) für 20 min, um die Verdauung zu stoppen. Waschen Sie die Dias in 1x DEPC-PBS mit sanfter Rührung für 5 min 3 mal.
   3. Fügen Sie 50 l Hybridisierungsmix (HM) mit der Sense/Antisense-Riboprobe auf den Dias hinzu und fügen Sie einen Deckbedeckungsschlupf hinzu.
   4. Fügen Sie den Nasskastenpuffer in die Nassbox ein. Die Dias in die Nassbox stecken und mit Paraffinfolie gut versiegeln. Über Nacht (mindestens 16 h) bei 60 °C hybridisieren.
2. Tag 2
   1. Den Waschpuffer bei 65 °C vorheizen. Tauchen Sie die Folie in das Gleitfärbeglasmitglas ein, das den Waschpuffer enthält, und lassen Sie ihn stehen, bis der Deckelrutsch automatisch abrutscht. Es dauert ca. 5 min.
   2. 2 Mal mit Waschpuffer bei 65 °C waschen, 30 min pro Waschgang mit sanfter Rührung. 2 Mal mit 0,2x Saline-Natriumcitrat (SSC) bei 65 °C waschen, 30 min pro Wäsche mit sanfter Rührung. 2 Mal mit Maleinsäurepuffer mit Tween 20 (MABT) bei Raumtemperatur waschen, 30 min pro Wäsche mit sanfter Rührung.
   3. Inkubieren Sie die Dias bei Raumtemperatur für 3-4 h im Sperrpuffer. Inkubieren Sie die Dias in 1 ml Anti-Digoxigenin-AP Fab-Fragmentlösung bei 1/5000 mit dem Sperrpuffer bei 4 °C über Nacht verdünnt.
3. Tag 3
   1. Entfernen Sie die Antikörperlösung und waschen Sie die Dias kurz in MABT. 4 Mal mit MABT bei Raumtemperatur waschen, 25 min pro Wäsche mit sanfter Rührung.
   2. Inkubieren Sie die Dias mit alkalischen Phosphatasepuffer bei Raumtemperatur 3 mal, 5 min pro Wäsche. Entfernen Sie den alkalischen Phosphatasepuffer und fügen Sie 1 ml 5-Brom-4-Chlor-3-Indolylphosphat (BCIP)/Nitroblautetrazolium (NBT) Färbelösung hinzu. Halten Sie die Dias im Dunkeln.
   3. Beobachten Sie die Farbreaktion periodisch unter einem optischen Mikroskop. Wenn die Farbe vollständig entwickelt ist (Reaktionszeit im Bereich von 1-4 h), waschen Sie die Dias 2 mal mit MABT bei Raumtemperatur, 5 min pro Wäsche mit sanfter Rührung.
   4. 2 Mal mit Stop-Lösung bei Raumtemperatur waschen, 15 min pro Waschgang mit sanfter Rührung. Inkubieren Sie die Dias in Methanol, um überschüssige Flecken zu entfernen, bei Raumtemperatur für 30 min. Je nach Hintergrundfarbe kann die Methanolwäsche 2 oder 3 Mal durchgeführt und die Entfärbungszeit verlängert werden.
   5. 2 Mal mit MABT bei Raumtemperatur waschen, 5 min pro Wäsche mit sanfter Rührung. Übertragen Sie die Dias auf ein frisches Filterpapier. Fügen Sie 50 l Glycerin hinzu. Fügen Sie die Abdeckungen hinzu und beobachten Sie mikroskopisch.
      HINWEIS: Die Lösungszusammensetzung ist in Tabelle 2dargestellt.

Ergebnisse

Abbildung 1ist eine Zusammenfassung der Schritte der ISH dargestellt. Antisense und entsprechende Sense-Ribosonden für dmrt1 wurden aus PCR-Produkten synthetisiert, die aus der coelomischen Flüssigkeit cDNAs verstärkt wurden. Die Echtheit der PCR-Produkte wurde durch direkte Sequenzierung überprüft. Riboprobes wurden mit T7-RNA-Polymerasen nach den Protokollen des Herstellers und einem früheren Bericht⁴ mit einigen geringfügigen Modifikationen syntheti...

Diskussion

Frühere Studien zeigten, dass ISH zum Nachweis mehrerer Ziel-RNAs^16,17,18geeignet ist. In diesem Protokoll haben wir eine hochauflösende ISH-Methode beschrieben, um die mRNA in coelomischer Flüssigkeit zu detektieren und die optimierten Hybridisierungsbedingungen in Sipunculus nudus hervorzuheben. Die offensichtlichen Signale von dmrt1, die wir beobachteten, zeigten die erfolgreiche Anwendung dieses Protokol...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Biowest	111860
Anti-digoxigenin-AP Fab fragments	Roche	11093274910
BCIP/NBT alkaline phosphatase color development kit	Beyotime	C3206
Bovine Serum Albumin	Sigma	B2064
Centrifuge	Eppendorf	5415R
Citric acid	Sinopharm Chemical Reagent Co.	5949-29-1
Citric acid trisodium	Sinopharm Chemical Reagent Co.	4/3/6132
Coverslips	Beyotime	FCGF60
Deionized formamide	Amresco	12/7/1975
Diethyl pyrocarbonate, DEPC	Sigma	D5758	Noxious substance
Digoxigenin (DIG) RNA Labeling Mix	Roche	11277073910
DNase I, RNase-free	Invitrogen	18047019
EDTA	Sigma	431788
Electrophoresis gel imaging	Bio-Rad	Universal Hood III
Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co.	64-17-5
Gel extraction kits	Omega	D2500
Gel-electrophoresis apparatus	Beijing Liuyi Instrument Factory	DYY-6C
Glycerol	Sinopharm Chemical Reagent Co.	56-81-5
Glycine	Sigma	G5417
Heparin	Sigma	8/1/9041
KCl	Sinopharm Chemical Reagent Co.	7447-40-7
KH2PO4	Sinopharm Chemical Reagent Co.	7778-77-0
LiCl	Sigma	203637
Maleic acid	Sinopharm Chemical Reagent Co.	110-16-7
Methanol	Sinopharm Chemical Reagent Co.	67-56-1	Noxious substance
MgCl2	Sinopharm Chemical Reagent Co.	7786-30-3
Na2HPO4	Sinopharm Chemical Reagent Co.	7558-79-4
NaCl	Biofount	JT0001
NaOH	Sinopharm Chemical Reagent Co.	1310-73-2	Corrosive
Paraffin film	Bemis Company, Inc.	PM-996
Paraformaldehyde, PFA	Sigma	158127	Noxious substance
PCR Instrument	Life Technology	Proflex
Pins	Deli	16
Pipette	Eppendorf	plus G
Poly-D-lysine treated microscope slides	Liusheng	VER_A01
Proteinase K	Sigma	SRE0005
RNase free water	HyClone	SH30538. 02
RNase inhibitor	Roche	3335399001
S. nudus
Sheep serum	Beyotime	C0265
Slide staining jar	Beyotime	FG010
Slide storage box	Beyotime	FBX011
Small autoclaved scissors	Shuanglu	sku_8330
Spectrophotometers	Thermo Fisher	NanoDrop 2000/2000c
T7 RNA polymerases	Roche	10881767001
Taq DNA polymerase mix (2X)	Thermo Scientific	K1081
Tris HCl	Sigma	RES3098T
tRNA	Roche	10109517001
Tween-20	Sigma	P1379
Water bath	Zhengzhou Great Wall Scientific Industrial	HH-S2