P. aeruginosa Infizierte 3D-Co-Kultur von Bronchialepithelzellen und Makrophagen an der Luft-Flüssig-Schnittstelle zur präklinischen Bewertung von Anti-Infektivika

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Protokoll für ein dreidimensionales Co-Kultur-Modell infizierter Atemwege, mit CFBE41o^- Zellen, THP-1 Makrophagen und Pseudomonas aeruginosa, die an der Luft-Flüssig-Schnittstelle eingerichtet wurden. Dieses Modell bietet eine neue Plattform, um gleichzeitig die Wirksamkeit von Antibiotika, die Epithelbarrierefunktion und entzündungshemmende Marker zu testen.

Zusammenfassung

fDie Arzneimittelforschung zur Behandlung von Lungeninfektionen schreitet zu prädiktiven In-vitro-Modellen von hoher Komplexität bei. Die vielfältige Präsenz von Bakterien in Lungenmodellen kann die epitheliale Anordnung wieder anpassen, während Immunzellen eine Entzündungsreaktion gegen die Bakterien in der Mikroumgebung koordinieren. Während In-vivo-Modelle die Wahl waren, um neue Anti-Infektiva im Zusammenhang mit Mukoviszidose zu testen, imitieren sie immer noch nicht genau die In-vivo-Bedingungen solcher Krankheiten beim Menschen und die Behandlungsergebnisse. Komplexe In-vitro-Modelle der infizierten Atemwege auf der Grundlage menschlicher Zellen (Bronchialepithel und Makrophagen) und relevanter Krankheitserreger könnten diese Lücke überbrücken und die Übersetzung neuer Antiinfektiva in die Klinik erleichtern. Zu diesem Zweck wurde ein Kokulturmodell der menschlichen Mukoviszidose-Bronchialzelllinie CFBE41o^- und THP-1-Monozyten-abgeleiteten Makrophagen etabliert, das eine Infektion der menschlichen Bronchialschleimhaut durch P. aeruginosa unter Luft-Flüssig-Schnittstelle (ALI) nachahmt. Dieses Modell wird in sieben Tagen eingerichtet, und die folgenden Parameter werden gleichzeitig bewertet: Epithelbarriereintegrität, Makrophagentransmigration, bakterielles Überleben und Entzündungen. Das vorliegende Protokoll beschreibt ein robustes und reproduzierbares System zur Bewertung der Wirksamkeit von Arzneimitteln und wirtsreaktionen, die für die Entdeckung neuer Antiinfektiva und die Optimierung ihrer Aerosolzufuhr in die Lunge relevant sein könnten.

Einleitung

Pseudomonas aeruginosa ist ein relevanter Erreger bei Mukoviszidose (CF), der zur Beeinträchtigung des Lungengewebes beiträgt¹. Die Produktion von Polysacchariden, wie Alginat und anderen Mukoid-Exopolysacchariden, koordiniert den Krankheitsverlauf, der zu einer hartnäckigen bakteriellen Haftung führt, die Abgabe von Antibiotika an Bakterien begrenzt und die Bakterien vor dem Wirtsimmunsystem schützt². Der Übergang von P. aeruginosa vom planktonischen Stadium zur Biofilmbildung ist in diesem Zusammenhang ein kritisches Thema, das auch das Auftreten von Antibiotikatoleranz erleichtert.

Im Kontext von CF wurde die Maus in erster Linie als Modell verwendet. Mäuse entwickeln diese Krankheit jedoch nicht spontan mit der Einführung von CF-Mutationen³. Die meisten bakteriellen Biofilm-Entwicklung und Arzneimittelanfälligkeit Studien wurden auf abiotischen Oberflächen durchgeführt, wie Petri-Gerichte. Dieser Ansatz stellt jedoch nicht die In-vivo-Komplexität dar. So fehlen wichtige biologische Barrieren, darunter Immunzellen sowie das Schleimhautepithel. Obwohl P. aeruginosa ziemlich toxisch für Epithelzellen ist, haben es einige Gruppen geschafft, einen früheren P. aeruginosa Biofilm mit menschlichen Bronchialzellen zu kultivieren. Diese Zellen stammten von Mukoviszidose-Patienten mit^{CFTR-Mutation} (CFBE41o - Zellen)⁴ und erlaubten es, die Wirksamkeit von Antibiotika⁵ zu bewerten oder die Korrektur des CFTR-Proteins während der Infektion⁶zu bewerten. Ein solches Modell wurde gezeigt, um die Vorhersehbarkeit der Wirksamkeit von Arzneimitteln zu verbessern, zusätzlich zur Aktivierung der Charakterisierung von Problemen mit Medikamenten, die in späteren Phasen der Arzneimittelentwicklung versagten⁷.

In der Lunge wird das Schleimhautepithel jedoch der Luft ausgesetzt. Darüber hinaus spielen Immunzellen in den Atemwegen, wie Gewebemakrophagen, eine wesentliche Rolle gegen eingeatmete Krankheitserreger oder Partikel⁸. Makrophagen wandern durch die verschiedenen Zellschichten, um das Bronchiallumen zu erreichen und die Infektion zu bekämpfen. Darüber hinaus müssen inhalierte Medikamente auch mit dem Vorhandensein von Schleim als zusätzliches nichtzelluläres Element der Lungenluft-Blut-Barriere⁹zurechtkommen. Tatsächlich wurden mehrere komplexe dreidimensionale (3D) In-vitro-Modelle entwickelt, die darauf abzielen, die In-vivo-Relevanz zu erhöhen. Co-Kultursysteme erhöhen nicht nur die Komplexität von In-vitro-Systemen für die Arzneimittelentdeckung, sondern ermöglichen auch die Untersuchung von Zell-Zell-Wechselwirkungen. Diese Komplexität wurde in Studien über Makrophagenmigration¹⁰, die Freisetzung von antimikrobiellen Peptiden durch Neutrophile¹¹, die Rolle des Schleims bei^{Infektionen 9}, und die Epithelzellreaktion auf übermäßige Schäden¹²behandelt. Ein zuverlässiges CF-infiziertes In-vitro-Modell, das die genetische Mutation in CF aufweist, der Luft ausgesetzt ist (erhöhter physiologischer Zustand), und Immunzellen integriert, fehlt noch.

Um diese Lücke zu überbrücken, beschreiben wir ein Protokoll für eine stabile menschliche 3D-Kokultur der infizierten Atemwege. Das Modell besteht aus menschlichen CF-Bronchialepithelzellen und Makrophagen, die mit P. aeruginosa infiziert sind und sowohl eine diffusionale als auch eine immunologische Barriere darstellen können. Mit dem Ziel, Anti-Infektiva bei einem relativ hohen Durchsatz zu testen, wurde diese Co-Kultur auf der durchlässigen Filtermembran von Wellplatteneinsätzen unter Verwendung von zwei menschlichen Zelllinien etabliert: CFBE41o^- und THP-1 Monozyten-abgeleitete Makrophagen. Darüber hinaus wurde das Modell zur Untersuchung der Ablagerung von aerosolisierten Antiinfektiva¹³an der luft-flüssigen Schnittstelle (ALI) und nicht an liquiden abgedeckten Bedingungen (LCC) etabliert.

Wie wir hier berichten, ermöglicht dieses Modell nicht nur die Beurteilung des bakteriellen Überlebens bei einer Antibiotikabehandlung, sondern auch die Zellzytotoxizität, die Integrität der Epithelbarriere, die Makrophagentransmigration und die Entzündungsreaktionen, die wesentliche Parameter für die Arzneimittelentwicklung sind.

Dieses Protokoll kombiniert zwei relevante Zelltypen für die Inhalationstherapie der Lungenwege: Makrophagen und CF-Bronchialepithel. Diese Zellen werden auf gegenüberliegenden Seiten von durchlässigen Stützeinsätzen gesät, wodurch die Zellexposition gegenüber Luft (sogenannte Air-Liquid Interface (ALI)-Bedingungen) möglich ist. Diese Kokultur der Wirtszellen wird anschließend mit P. aeruginosainfiziert. Beide Wirtszelllinien sind menschlicher Herkunft: Die Epithelzellen stellen das mukovisenfibrosebronchiale Epithel dar, mit einer Mutation auf dem CF-Kanal (CFBE41o^{- ),}und die THP-1^14-Zellen sind eine gut charakterisierte Makrophage-ähnliche Zelllinie. Eine konfluente Epithelschicht darf sich zunächst auf der Oberseite von Brunnenplatteneinsätzen bilden, bevor die makrophageähnlichen Zellen dem gegenüberliegenden Fach hinzugefügt werden. Sobald die Kokultur bei ALI etabliert ist, wird das System mit P. aeruginosa an der apikalen Seite geimpft. Dieses infizierte Co-Kultursystem wird dann verwendet, um die Wirksamkeit eines Antibiotikums, z. B. Tobramycin, zu bewerten. Folgende Endpunkte werden analysiert: epitheliale Barriereintegrität in Bezug auf transepitheliale elektrische Resistenz (TEER), Visualisierung von Zell-Zell- und Zell-Bakterien-Wechselwirkungen durch konfokale Laserscanmikroskopie (CLSM), bakterielles Überleben durch Zählung koloniebildender Einheiten (CFU), Überleben der Wirtszellen (Zytotoxizität) und Zytokinfreisetzung.

Protokoll

1. Wachstum und Differenzierung von Zellen in durchlässigen Stützeinsätzen

1. CFBE41o kultivieren^- in einem T75-Kolben mit 13 ml minimalem essentiellen Medium (MEM) mit 10% fetalem Kalbsserum (FCS), 1% nicht essentiellen Aminosäuren und 600 mg/L Glukose bei 37 °C mit 5 %_{CO2-Atmosphäre.} Fügen Sie den Zellen alle 2–3 Tage frisches Medium hinzu.
   1. Lösen Sie die Zellen nach Erreichen von 70% Zusammenfluss im Kolben mit 3 ml Trypsin- Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) bei 37°C für 15 min. Fügen Sie 7 ml frisches MEM hinzu und zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 4 min bei Raumtemperatur (RT). Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie neue 10 ml MEM hinzu, während Sie die Klumpen durch sanftes Pipettieren nach oben und unten stören.
   2. Zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten Zellzähler oder Hämozytometerkammer. Samenzellen mit einer Dichte von 2 x 10⁵ Zellen/Gut in 12-Well-Platten mit durchlässigen Stützen (Porengröße von 3 m, siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Der automatisierte Zellenzähler bestimmt die Zellenzahl, die Größenverteilung und die Lebensfähigkeit der Zellen (siehe Tabelle der Materialien). Hier könnten durchlässige Stützen mit einer Porengröße von 0,4 m verwendet werden; Die Makrophagen sollten jedoch in diesem Zustand direkt zur apikalen Seite hinzugefügt werden, und ihre transzelluläre Migration wird in diesem Fall nicht bewertet.
   3. Samenzellen in flüssig-flüssigem Zustand (LLC) durch Zugabe von 500 l der Zellsuspension auf der apikalen Seite des durchlässigen Trägers und 1,5 ml frisches Medium in der basolateralen Seite. Dann brüten Zellen bei 37°C unter 5%_CO2,für 72 h.
   4. Um zur Luft-Flüssig-Schnittstelle (ALI) Kultur zu wechseln, am dritten Tag nach der Aussaat, entfernen Sie das Medium von der basolateralen Seite zuerst, dann von der apikalen Seite. Auf der basolateralen Seite 500 l frisches MEM hinzufügen und das Medium jeden zweiten Tag ändern, bis Zellen eine konfluente Monoschicht bilden.
      HINWEIS: Für die in diesem Protokoll verwendeten Bedingungen sind die CFBE41o^-Zellen in der Regel nach 3-7 Tagen in kultur konfluent.
   5. Bewerten Sie die epithelialen Barriereeigenschaften an Tag 7, indem Sie CFBE41o^- Zellen mit 500 l Zellmedium in der apikalen Seite und 1,5 ml in der basolateralen Seite für 1 h, bei 37°C unter 5%_CO2inkubieren.
   6. Messen Sie die Barriereeigenschaften über den transepitheliaalen elektrischen Widerstand (TEER), mit einer STX2-Essstäbchenelektrode und einem epithelialer Volt-Ohmmeter; nach 7 Tagen ist dies höher als 300 x cm2.
      HINWEIS: Schließlich haben die Zellen in einigen Membraneinsätzen einen niedrigen TEER. Daher werden keine durchlässigen Einsätze mit TEER < 300 x cm2 verwendet.
2. Um THP-1-Zellen zu kultivieren, wachsen Sie sie in einem T75-Kolben mit 13 ml des Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium, ergänzt mit 10% FCS, und inkubieren bei 37°C unter 5%_CO2. Teilen Sie Zellen jeden zweiten Tag, indem Sie 2 x 10⁶ Zellen/ml-Zellen in einem neuen T75-Kolben aussäen.
   HINWEIS: Nicht differenzierte THP-1-Zellen werden als Monozyten in Suspension angebaut.
   1. Unterscheiden Sie die THP-1-Zellen wie folgt. Zentrifugengehalt eines T75 bei 300 x g für 4 min. Entsorgen Sie den Überstand, setzen Sie das Pellet in frischem Medium wieder auf und legen Sie ihn in einen neuen T75. Fügen Sie 10 ng/mL Phorbol 12-Myristate 13-Acetat (PMA) inkubieren die Zellen in RPMI für 48 h bei 37 °C und 5%_{CO2-Atmosphäre} ¹⁵.
      HINWEIS: Nach der Differenzierung mit PMA vermehren sich die Zellen nicht mehr und heften sich an den Kolben an.
   2. Um THP-1-Makrophagen-ähnliche Zellen zu lösen, einmal mit Phosphat-gepufferter Salin (PBS) bei 37 °C waschen und mit 3 ml Zellablösung (z.B. Accutase) mit 0,5 mM EDTA 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
   3. Prüfen Sie die Zellen unter einem invertierten Mikroskop, um nach einer Zellablösung zu suchen. 7 ml frisches Medium und Zentrifuge bei 300 x g für 4 min bei RT hinzufügen.
      HINWEIS: Makrophagen können auch mit Trypsin-EDTA, 37 °C für 20 min abgenommen werden. Trypsin ist jedoch härter als die gewählte Zellablösung (siehe Materialtabelle).
   4. Nach dem Entfernen des Überstandes, re-suspend Makrophagenzellen in 3 ml THP-1 Medium in einem 15 ml konischen Rohr, zählen Sie die Zellen wie in 1.1.2 beschrieben. und für maximal 1 h bei 37 °C unter 5%_CO2 vor dem Aufbau der Co-Kultur inkubieren.
      HINWEIS: THP-1-Zellen in Suspension können mit Lebensfähigkeitsfarbstoffen gefärbt werden, um die Co-Kultur weiter abzubilden. Verwenden Sie in diesem Schritt das folgende Verfahren (Schritt 1.2.5).
   5. Stain Makrophagen mit 10 'M eines Zelllebensfähigkeitfarbstoffs (basierend auf der Umwandlung von Acetat-Moieties durch intrazelluläre Esterasen, siehe Materialtabelle), in denen 3 l des Zelllebensfähigkeitfarbstoffs auf die Zellsuspension aufgebracht werden. Brützellen für 20 min bei 37 °C, 5%_CO2,dann 1x mit PBS 37°C waschen, um den Farbstoff zu entfernen.
      HINWEIS: Zentrifugieren Sie die Zellen, um den Farbstoff bei 300 x g für 4 min bei Raumtemperatur (RT) zu entfernen.

2. Etablierung einer Epithel-Makrophagen-Kokultur auf durchlässigen Stützen

1. Verwenden Sie CFBE41o^- Monolayer bei ALI mit TEER bei 300 x cm2 (Schritt 1.1.6.). Entfernen Sie das Medium aus der unteren Kammer, umkehren Sie vorsichtig die Stütze in einer sterilen Glas Petrischale (50 mm x 200 mm), und entfernen Sie die Zellen, die durch die Membranporen an der Unterseite der Membran mit einem Zellschaber überwuchert sind.
   HINWEIS: Aufgrund der Porengröße von 3 m neigen Epithelzellen dazu, durch die Poren zur basolateralen Seite zu wachsen. Daher muss man sie entfernen, bevor sie die Makrophagen auf dieser Seite hinzufügen. CFBE41o^- Lungenepithelzellen können in diesem Schritt gefärbt werden. Das Verfahren in Schritt 1.2.5 kann verwendet werden; Anstelle einer Zellsuspension wird jedoch die Farbstofflösung in MEM (nur 500 l apikal) auf die aufhaftenden Zellen auf die durchlässige Stütze aufgetragen.
2. Verwenden Sie 2 x 10⁵ Zellen/Well (in 200 l RPMI) aus der Zellsuspension von PMA-differenzierten THP-1-Makrophagen und platzieren Sie die Zellen auf der basolateralen Seite der invertierten Einsätze.
3. Schließen Sie die Petri-Gerichte sorgfältig und brüten für 2 h bei 37 °C unter 5% CO₂.
4. Legen Sie die Einsätze wieder in die 12-Well-Mikroplatten und fügen Sie 500 l MEM-Medium in die basolaterale Seite des durchlässigen Einsatzes ein, um die ALI-Bedingungen beizubehalten. Die Zellen sind nun bereit für eine Infektion.

3. Infektion durch P. aeruginosa

HINWEIS: Alle folgenden Schritte von hier aus müssen in einem Labor der Biosicherheitsstufe 2 (BSL2) durchgeführt werden.

1. Impfung 15 ml Lysogeny-Brühe (LB), ergänzt mit 300 g/ml Ampicillin in einem Erlenmeyerkolben (50 ml) mit einer einzigen Kolonie von P. aeruginosa PAO1-GFP.
   HINWEIS: Auch andere Stämme von P. aeruginosa könnten hier verwendet werden, z. B. PAO1-Wildtyp, PA14 oder klinische Stämme, nach ihren eigenen Anbauprotokollen.
2. Die Bakterien 18 h bei 37 °C bebrüten und bei 180 Umdrehungen von 180 Umdrehungen min schütteln.
3. Den Inhalt nach dem 18 h in ein 50 ml kegelförmiges Rohr und zentrifugieren bei 3850 x g für 5 min übertragen. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie 10 ml steriles PBS bei 37 °C hinzu.
4. Messen Sie die optische Dichte auf einem Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 600 nm und passen Sie die Konzentration von Bakterien mithilfe des Zellkulturmediums auf eine Endkonzentration von 2 x 10⁵ KBE/ml an. Dies entspricht einer Vielzahl von Infektionen (MOI) eines Bakteriums pro Epithelzelle.
5. Fügen Sie 100 l bakterielle Suspension auf die apikale Seite des durchlässigen Trägers (Schritt 2.4.) und inkubieren bei 37 °C unter 5%_CO2 für 1 h, um Bakterien an den Zellen anhängen zu lassen. Dann entfernen Sie die apikale Flüssigkeit vorsichtig mit einer Pipette, um die ALI-Bedingungen wiederherzustellen. Halten Sie einige Proben als Kontrolle nicht infiziert.
   HINWEIS: In diesem Stadium sollten die anhaftenden Bakterien in LB-Agar plattiert werden (siehe Schritte 5.4/5.5), um die anfänglichen Bakterien inoculum zu bestimmen.
6. Inkubieren Sie das Medikament von Interesse nach bakteriellen Adhäsion in den Zellen. Für Behandlungsexperimente fügen Sie der apikalen Seite 500 l einer im Zellmedium verdünnten Wirkstofflösung (in diesem Protokoll wurde Tobramycin 6 g/ml verwendet) bei. Fügen Sie 1.500 L Zellmedium ohne Medikament auf der basolateralen Seite hinzu.
   HINWEIS: Anstatt die Medikamente als Lösung zu insleben, kann das Modell auch an die Aerosolablagerung angepasst werden. Zu diesem Zweck werden die Zellen bei ALI von der basolateralen Seite mit 500 l Zellmedium zugeführt. Das Medikament wird dann zuerst vernebelt und erlaubt, im apiischen Fach durch eine geeignete Vorrichtung (hier nicht beschrieben) zu deponieren. Die infizierte und behandelte Probe kann auf die in den Abschnitten 4 bis 7 beschriebenen Endpunkte überprüft werden. Von diesem Schritt an können durchlässige Stützen verwendet werden, um entweder Bilder zu erstellen (Abschnitt 4) oder um Ergebnisse des Bakterienwachstums und der Zelllebensfähigkeit von Säugetieren zu erhalten ,,Abschnitte 5–7).

4. Probenvorbereitung für konfokale Laserscanmikroskopie (CLSM)

1. Nach der Etablierung der Kokultur, Infektion und medikamentöse Behandlung, entfernen Sie alle Medien von der apikalen und basolateralen Seite. 1x mit PBS bei 37°C waschen und dann die Zellen mit 3% Paraformaldehyd (PFA) für 1 h bei RT (300 l auf apikal/600 l auf basolateral) fixieren. Zellkerne werden 30 min bei Raumtemperatur mit 5 g/ml DAPI-PBS gefärbt.
   VORSICHT: PFA ist gefährlich.
2. Schneiden Sie die Membranen mit einem Skalpell und legen Sie sie zwischen zwei 12 mm Mikroskopie-Abdeckungsschlitten mit einem Montagemedium (siehe Tabelle der Materialien). Lassen Sie es in der Fließbank 30 min trocknen, bevor Sie bei 4 °C lagern. Visualisieren Sie durch konfokale Scanmikroskopie.
   HINWEIS: Nach der Co-Kultur und vor der Montage können enge Knoten Immunstaining durchgeführt werden. Dazu werden die Zellen 30 min lang mit Paraformaldehyd 3% fixiert, wieder mit PBS gewaschen und mit Saponin 0,05%/BSA 1% in PBS permeabilisiert. In diesem Protokoll wurde das Zonula-Occludens-Protein (ZO-1) über mausfeindlichen ZO-1-Antikörper (1:400, Inkubation bei 4 °C über Nacht) nachgewiesen. Die Proben wurden dann für 2 h bei RT mit Ziegenanti-Maus-IgG-Antikörper Alexa Fluor 633 (1:2000 in rot) inkubiert. Die Kerne wurden mit DAPI (1 g/ml) gebeizt und mit Montagemedium auf Abdeckungen montiert.
3. Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop für die Abbildung der gespeicherten Membranen. Wählen Sie 25x oder 63x Wasser-Immersion-Objektive und Laser bei 405, 488, 505 oder 633 nm zur Detektion. Bilder sollten eine Auflösung von 1024 x 1024 Pixeln haben.
   HINWEIS: Die Laser werden nach dem verwendeten Fleck ausgewählt.
4. Erfassen Sie apikale Ansichten und Querschnittsansichten, und verwenden Sie den Zeta-Stack-Modus (10–15 Stacks) für die Konstruktion eines dreidimensionalen Modells mit Bildgebungssoftware.

5. Messung der bakteriellen Proliferation über koloniebildende Einheiten (KBE)

1. Sammeln Sie das apikale und basolaterale Medium (enthaltende Bakterien), um die KBE von nicht angeschlossenen Bakterien zu bewerten. Sammeln Sie 500 L von den apiischen und basolateralen Seiten und poolen Sie sie.
   HINWEIS: Verwenden Sie diese Suspension direkt, um Bakterien (Schritt 5.4) oder Zentrifuge bei 21.250 x g für 10 min zu zählen, um die Laktatdehydrogenase (LDH) aus dem Überstand (Abschnitt 6) zu bewerten und/oder in PBS erneut suspendiert zu werden, um extrazelluläre Bakterien zu zählen (Schritt 5.4).
2. Bewerten Sie das Überleben von Bakterien, die in den Zellen befestigt und/oder internalisiert sind, indem Sie in jedem Fach des durchlässigen Trägers 500 l sterilen entionisierten kalten Wassers hinzufügen. Inkubieren Sie Zellen für 30 min bei Raumtemperatur.
   HINWEIS: Die Proben können entweder auf LB-Agar (siehe Schritt 5.4) oder gefroren (als ganze Einsatzplatte) bei -20 °C zur späteren Beschichtung beschichtet werden.
3. Zur Beurteilung der KBE von anhaftenden/internalisierten Bakterien, Tauproben bei 37°C für 10 min (wenn gefroren). Mit Pipettenspitzen für jeden Brunnen die Membranoberfläche und Pipette nach oben und unten kratzen, um alle haftenden Inhalte zu entfernen.
   HINWEIS: In diesem Schritt werden alle Epithelzellen lysiert und anhaftende/internalisierte Bakterien stehen als Suspension zur Plattimitieren zur Verfügung.
4. Mit der bakteriellen Suspension aus beiden Fraktionen, führen Sie eine 1/10 serielle Verdünnung mit Tween-80 0,05% in PBS und Platte die Bakterien auf LB Agar Platten.
   HINWEIS: Verdünnungen zwischen 1 und 10 werden empfohlen. Die Bakterien sollten in der höchsten Verdünnung gezählt werden, wo einzelne Kolonien zuerst identifiziert werden.
5. Agarplatten bei 30°C für 16–72 h inkubieren, um Kolonien zu zählen, und cFU entsprechend berechnen.
   HINWEIS: Eine Temperatur von 30 °C zum Zeitpunkt der Platteninkubation ist für behandelte Proben und zur Beobachtung des verzögerten Wachstums von Kolonien unerlässlich.

6. Bewertung der Zellzytotoxizität mittels Lactat-Dehydrogenase-Assay

1. Verwenden Sie den Überstand infizierter Zellen, die Bakterien (ab Schritt 5.1) für die Beurteilung der Zelllebensfähigkeit für den LDH-Test¹⁶verwenden. Zentrifugieren Sie den Überstand bei 21.250 x g für 10 min, um die Bakterien und schließlich den Rest der Zellen zu pellet. Verwenden Sie den bakteriellen Überstand, um die LDH-Freisetzung zu messen.
   HINWEIS: Der Überstand sollte nicht eingefroren werden, bevor LDH durch diesen Test gemessen wird.
2. Übertragen Sie 100 l des Überstandes auf eine 96-Well-Platte, und fügen Sie 100 l der LDH-Assay-Lösung hinzu (siehe Materialtabelle). Inkubieren Bei Raumtemperatur für 5 min im Dunkeln, dann Lesen Absorbieren bei 492 nm.

7. Beurteilung der Freisetzung menschlicher Zytokine

1. Für die Cytokin-Quantifizierung verwenden Sie entweder ELISA oder cytometrischer Adad-Array-Immunoassay¹⁷(siehe Materialtabelle). Zentrifugenüberstand ab Schritt 5.1 bei 21.250 x g für 10 min und messen entweder sofort oder lagern -80 °C bis zur Analyse bis zu 15 Tage.
2. Bewerten Sie Überstand mit einem handelsüblichen ELISA-Kit.
   HINWEIS: Das Verfahren folgt den Herstellungsanweisungen, die die Beschichtung von Platten mit dem Aufnahmeantikörper, die Zugabe der Proben (100 l) und Zytokinstandards, die Inkubation, das Waschen und die Zugabe von Detektionsantikörpern umfassen, um eine farbmetrische Messung des Zytokinvorhandenseins zu ermöglichen. Alternativ kann die Durchflusszytometrie verwendet werden, um Zytokine über handelsübliche Kits zu messen (siehe Tabelle der Materialien).

Ergebnisse

Abbildung 1A zeigt die Morphologie der resultierenden Kokultur menschlicher Bronchialepithelzellen und Makrophagen, nachdem sie sowohl für 24 h auf der apikalen bzw. basolateralen Seite durchlässiger Stützen gewachsen sind. Die Epithelbarriereintegrität wird durch höhere TEER (834 x²) und CLSM durch Immunfärbung für das enge Knotenprotein ZO-1 (Abbildung 1B) gezeigt. Die gleichen Ergebnisse, die in Bezug auf die^- Barriereintegrität ...

Diskussion

Dieses Papier beschreibt ein Protokoll für eine 3D-Kokultur der infizierten Atemwege, bestehend aus der menschlichen Mukoviszidose-Bronchialzelllinie CFBE41o- und der menschlichen Monozyten-abgeleiteten Makrophagenzelllinie THP-1. Das Protokoll ermöglicht die Beurteilung der Epithelbarriereintegrität, Makrophagentransmigration, des Überlebens von Bakterien und Entzündungen, die wichtige Parameter bei der gleichzeitigen Prüfung der Wirksamkeit von Arzneimitteln und der Wirtsreaktionen sind. Die Neuheit im Modell lie...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase	Accutase	AT104
Ampicillin	Carl Roth, Germany	HP62.1
CASY TT Cell Counter and Analyzer	OLS Omni Life Sciences	-
CellTrace Far Red	Thermo Fischer	C34564
Centrifuge Universal 320R	Hettich, Germany	1406
CFBE41o- cells	1. Gruenert Cell Line Distribution Program 2. Sigma-Aldrich	1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert 2. SCC151
Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mm	World Precision Instruments, Sarasota, USA	STX2
Confocal Laser-Scanning Microscope CLSM	Leica, Mannheim, Germany	TCS SP 8
Cytokines ELISA Ready-SET-Go kits	Affymetrix eBioscience, USA	15541037
Cytokines Panel I and II	LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA).	740102
Cytotoxicity Detection Kit (LDH)	Roche	11644793001
D-(+) Glucose	Merck	47829
Dako Fluorescence Mounting Medium	DAKO	S3023
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)	Thermo Fischer	D1306
Epithelial voltohmmeter	World Precision Instruments, Sarasota, USA	EVOM2
Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0μm Transparent PET Membrane, Sterile	Corning, Amsterdam, Netherlands	353181
Fetal calf serum	Lonza, Basel, Switzerland	DE14-801F
Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633	Invitrogen	A-21050
L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscle	Roche, Mannheim, Germany	10127230001
LB broth	Sigma-Aldrich, Germany	L2897-1KG
MEM (Minimum Essential Medium)	Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.	11095072
Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.	11140050
P. aeruginosa strain PAO1	American Type Culture Collection	47085
P. aeruginosa strain PAO1-GFP	American Type Culture Collection	10145GFP
Paraformaldehyde Aqueous Solution -16%	EMS DIASUM	15710-S
Phosphate buffer solution buffer	Thermo Fischer	10010023
Petri dishes	Greiner	664102
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma, Germany	P8139-1MG
Precision Cover Glasses	ThorLabs	CG15KH
Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibody	BD Transduction Laboratories	610966
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium	Gibco by Lifetechnologies, Paisley, UK	11875093
Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter)	Normax, Portugal	5058561
Saponin	Sigma-Aldrich, Germany	S4521
T75 culture flasks	Thermo Fischer	156499
THP-1 cells	Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany)	No. ACC-16
Tobramycin sulfate salt	Sigma	T1783-500MG
Trypsin-EDTA 0.05%	Thermo Fischer	25300054
Tween80	Sigma-Aldrich, Germany	P1754