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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier stellen wir Protokolle zur Analyse der Knochenumgestaltung innerhalb einer Lab-on-a-Chip-Plattform vor. Eine 3D-gedruckte mechanische Ladevorrichtung kann mit der Plattform gekoppelt werden, um osteozyte Mechanostransduktion durch Verformung der zellulären Matrix zu induzieren. Die Plattform kann auch verwendet werden, um Knochen-Remodeling funktionelle Ergebnisse von Osteoklasten und Osteoblasten (Resorption/Bildung) zu quantifizieren.

Zusammenfassung

Knochenumbau ist ein streng regulierter Prozess, der für das Skelettwachstum und die Reparatur sowie die Anpassung an Veränderungen in der mechanischen Umgebung erforderlich ist. Dabei regulieren mechanosensitive Osteozyten die gegensätzlichen Reaktionen zwischen den katabolen Osteoklasten und anabolen Osteoblasten. Um die hochkomplizierten Signalwege, die diesen Prozess regulieren, besser zu verstehen, hat unser Labor eine grundlegende Lab-on-a-Chip (LOC)-Plattform entwickelt, um funktionelle Ergebnisse (Bildung und Resorption) des Knochenumbaus innerhalb eines kleinen Systems zu analysieren. Da der Knochenumbau ein langwieriger Prozess ist, der in der Größenordnung von Wochen bis Monaten stattfindet, haben wir langfristige Zellkultivierungsprotokolle innerhalb des Systems entwickelt. Osteoblasten und Osteoklasten wurden auf funktionellen Aktivitätssubstraten innerhalb des LOC angebaut und bis zu sieben Wochen lang gewartet. Danach wurden Späne demontiert, um die Quantifizierung der Knochenbildung und Resorption zu ermöglichen. Darüber hinaus haben wir ein 3D-gedrucktes mechanisches Ladegerät entwickelt, das mit der LOC-Plattform koppelt und verwendet werden kann, um osteozyte Mechanotransduktion durch Verformung der Zellmatrix zu induzieren. Wir haben die Zellkultivierungsprotokolle für Osteozyten, Osteoblasten und Osteoklasten innerhalb der LOC-Plattform optimiert und Bedenken der Sterilität und Zytotoxizität angesprochen. Hier stellen wir die Protokolle zur Herstellung und Sterilisation des LOC, zum Säen von Zellen auf funktionalen Substraten, zur Induzieren mechanischer Belastung und zur Demontage des LOC zur Quantifizierung der Endpunktergebnisse vor. Wir glauben, dass diese Techniken den Grundstein für die Entwicklung eines echten Organ-on-a-Chip für den Knochenumbau legen.

Einleitung

Knochen ist ein hochdynamisches Gewebe, das eine komplizierte Koordination zwischen den drei Hauptzelltypen erfordert: Osteozyten, Osteoblasten und Osteoklasten. Multizelluläre Wechselwirkungen zwischen diesen Zellen sind verantwortlich für den Knochenverlust, der während der Lähmung und der langfristigen Unbeweglichkeit auftritt, und für die Knochenbildung, die als Reaktion auf Wachstum und Bewegung auftritt. Osteozyten, der am häufigsten vorkommende Knochenzelltyp, sind hochempfindlich gegenüber mechanischen Reizen, die auf den Knochen aufgetragen werden. Mechanische Stimulation verändert Osteozyten metabolische Aktivität und führt zu einer Erhöhung der wichtigsten Signalmoleküle1,2. Durch diesen Prozess, der als Mechanotransduktion bekannt ist, können Osteozyten die Aktivitäten von Osteoblasten (Knochenbildenden Zellen) und Osteoklasten (Knochenresorbing-Zellen) direkt koordinieren. Die Aufrechterhaltung der Knochenhomöostase erfordert eine strenge Regulierung zwischen Knochenbildung und Knochenresorptionsraten; Störungen in diesem Prozess können jedoch zu Krankheitszuständen wie Osteoporose oder Osteoporose führen.

Die Komplexität der Wechselwirkungen zwischen diesen drei Zelltypen eignet sich gut für die Untersuchung unter Verwendung von mikrofluidischen und Lab-on-a-Chip (LOC)-Technologien. Zu diesem Zweck hat unser Labor vor kurzem den Proof of Concept einer LOC-Plattform zur Analyse der Knochenresorption und -bildung (funktionelle Ergebnisse) im Knochenumbauprozess etabliert. Die Plattform kann für die Untersuchung von zellulären Wechselwirkungen, veränderten Belastungsumgebungen und Prüfmedikamenten-Screening verwendet werden. In den letzten Jahren wurden verschiedene mikrofluidische Geräte entwickelt, um die molekularen Signalwege zu untersuchen, die den Knochenumbau regulieren; Viele dieser Systeme quantifizieren jedoch die Umgestaltung durch indirekte Marker, die auf eine funktionale Aktivität hinweisen3,4,5,6,7. Ein Vorteil unseres Systems ist, dass es für die direkte Quantifizierung von funktionellen Ergebnissen verwendet werden kann. Der Bone-Umbau ist ein langfristiger Prozess. Daher erfordert die direkte Quantifizierung der Knochenresorption und -bildung ein Kultivierungssystem, das für mindestens mehrere Wochen bis Monate8,,9,10,11aufrechterhalten werden kann. So haben wir bei der Entwicklung der LOC-Plattform langfristige Kultivierungsprotokolle erstellt, die für die Bildung und Resorption notwendig sind, und haben Zellen innerhalb des Systems für bis zu sieben Wochen11gepflegt. Zusätzlich haben wir geeignete Kultiumsubstrate für beide Zelltypen in die Plattform integriert; Osteoklasten wurden direkt am Knochen kultiviert, und Osteoblasten, die als plastische Anhänger bekannt sind, wurden auf Polystyrol-Scheiben kultiviert. Darüber hinaus haben wir Fragen in Bezug auf Sterilität, langfristige Zytotoxizität und Spandemontage für die Remodeling-Analyse11,12behandelt.

Die LOC-Plattform kann auch verwendet werden, um Osteozyten-Mechanotransduktion durch Matrixverformung zu induzieren. Eine 3D-gedruckte mechanische Ladevorrichtung wurde entwickelt, um mit dem LOC zu koppeln und eine statische aus der Ebene Distention anzuwenden, um die Zellen zu dehnen13. Um dieser mechanischen Belastung gerecht zu werden, wurde die Tiefe des Brunnens innerhalb des LOC erhöht. Diese kleine, einfache mechanische Ladevorrichtung kann leicht von Laboren mit begrenzter Engineering-Erfahrung hergestellt werden, und wir haben zuvor Zeichnungen der 3D-gedruckten Komponenten13geteilt. In der aktuellen Arbeit zeigen wir einige der neuartigen Techniken, die für den erfolgreichen Einsatz des LOC notwendig sind. Insbesondere zeigen wir Spanfertigung, Zellsaat auf funktionalen Substraten, mechanische Beladung und Spandemontage für die Remodellierung der Quantifizierung. Wir glauben, dass die Erklärung dieser Techniken von einem visuellen Format profitiert.

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Protokoll

1. Chipmaskenvorbereitung

HINWEIS: Die Schritte 1.1 - 1.3 müssen nur einmal nach dem ersten Empfang der Chipmaske durchgeführt werden. Sie stellen sicher, dass sich die Maske während des Gebrauchs nicht verbeugt. Das Design der mikrofluidischen Masken wurde zuvor beschrieben11,14. Masken wurden im eigenen Haus entworfen und mit hochauflösender Stereolithographie kommerziell hergestellt (Abbildung 1A).

  1. Bedecken Sie die Oberseite der Maske mit Kunststofffolien, um diese Oberfläche vor Klebstoff zu schützen. Befestigen Sie die Spanmaske mit Sprühkleber auf einer gleich großen Acrylfolie. Klemmen Sie die Stücke über Nacht zusammen, damit der Klebstoff vollständig aushärten kann. Nachdem der Klebstoff trocken ist, entfernen Sie die Kunststofffolie von der Oberseite der Maske.
  2. Befestigen Sie die Unterseite des Acrylblatts mit doppelseitigem Klebeband an einem 3D-gedruckten Navellierungsfeld (Zusatzabbildung 1, Ergänzungsdateien 1-4). Drücken Sie fest, um eine enge Bindung zu gewährleisten.
  3. Versiegeln Sie alle kleinen Öffnungen in der Nähe der abnehmbaren Wand der Nättsbox mit einem wasserdichten Dichtmittel. Lassen Sie das Dichtmittel für 24 h aushärten.
  4. Reinigen Sie die Oberfläche der Maske mit 70% Ethanol (EtOH). Legen Sie die Naderbox mit der gewünschten Spanmaske in den Ofen. Verwenden Sie einen digitalen Winkelmesser, um sicherzustellen, dass die Oberseite der Maske eben ist. Stellen Sie bei Bedarf die Ntellschrauben ein.

2. PDMS-Fertigung

HINWEIS: Für funktionelle Aktivitätstests (Bildung und Resorption) wird ein Flachbrunnen(1mm) Chipdesign verwendet, und für mechanische Belastungsstudien wird ein Tiefbrunnen (10 mm) verwendet. Der Boden des Tiefbrunnens wird durch Anbringen einer separaten dünnen PDMS-Membran gebildet (Abbildung 1B).

  1. Deckelschicht (Schicht 1)
    1. Kombinieren Sie 63 g PDMS-Prepolymer und 6,3 g Aushärtungsmittel (10:1-Verhältnis) in einer Kunststofftasse. Mit einem Einweg-Zellspachtel und Degas in einem Vakuum-Austrocknungsor für 30 min gründlich mischen.
    2. Langsam Mischung in die vorbereitete Nättchenkiste gießen. Lassen Sie das PDMS 30 min sitzen und dann bei 45 °C für 18 h backen.
    3. Lösen Sie die Ränder des PDMS mit einem verjüngten Laborspachtel und entfernen Sie das Polymerblech aus dem Navellierungskasten.
    4. Schneiden Sie einzelne Deckel mit einem Skalpell und einer 3D-gedruckten Schablone auf die Größe (70 mm x 34 mm).
    5. Stanzlöcher durch jeden Deckel mit einem Biopsiesstempel (1 mm Durchmesser).
    6. Oberfläche reinigen Sie die Deckel mit Verpackungsband.
      HINWEIS: Wenn die Deckel nicht sofort verwendet werden, wickeln Sie sie jeweils in Verpackungsband und lagern Sie sie bei Raumtemperatur (RT).
  2. Brunnen- und Mikrokanalschicht (Layer 2)
    1. Kombinieren Sie das PDMS-Prepolymer und das Härtungsmittel (10:1-Verhältnis) in einem Kunststoffbecher. Das Flachgut-Design erfordert 43 g Prepolymer und 4,3 g Härtungsmittel, und das Tiefbrunnen-Design erfordert 227 g Prepolymer und 22,7 g Härtungsmittel. Mischen Sie das Polymer kräftig und entgasen für 30 min.
      HINWEIS: Hierbei wird eine Maskenabmessung von 152,4 mm x 152,4 mm angenommen.
    2. Langsam Mischung über geeignete vorlevelierte Maske gießen. Lassen Sie das PDMS 30 min sitzen und dann bei 45 °C für 18 h backen.
    3. Lösen Sie die Ränder des PDMS mit einem verjüngten Laborspachtel und schälen Sie das Polymer vorsichtig von der Maske ab. Verwenden Sie ein Skalpell und eine 3D-gedruckte Vorlage, um einzelne Chips auszuschneiden.
      HINWEIS: Für Ladestudien ist es wichtig, dass die Chipabmessungen (70 x 34 mm) präzise sind und dass sich der Brunnen in der Mitte des Chips befindet.
    4. Oberfläche reinigen Sie das PDMS mit Verpackungsband.
      HINWEIS: Wenn die Chips nicht sofort verwendet werden, wickeln Sie jeden Chip in Verpackungsband und lagern Sie ihn bei RT.
  3. Dünne PDMS-Membran (Schicht 3)
    HINWEIS: Diese Ebene wird nur für das Tiefbrunnendesign verwendet.
    1. 12,7 g PDMS-Prepolymer und 1,3 g Aushärtungsmittel (10:1-Verhältnis) zu einer Kunststofftasse geben. Kräftig mischen und 30 min entgasen.
    2. Gießen Sie langsam Polymer in vorbereitete Nweiterbox und gründlich kratzen Kunststoff-Becher, um so viel PDMS wie möglich zu entfernen.
    3. Verwenden Sie Zellspachtel, um PDMS über die gesamte Oberfläche zu verteilen.
      HINWEIS: Wenn das Polymer nicht manuell verteilt ist, reicht die Oberflächenspannung aus, um zu verhindern, dass das Polymer ein einheitliches Blatt bildet.
    4. Lassen Sie das PDMS 30 min sitzen und dann bei 45 °C für 18 h backen.
    5. Lösen Sie die Ränder des PDMS mit einem verjüngten Spachtel und entfernen Sie das PDMS-Blatt vorsichtig aus dem Naderfeld. Schneiden Sie einzelne Membranen, die den Abmessungen von Schicht 2 entsprechen.
    6. Messen Sie die Membrandicke in der Mitte der Membran mit Bremssätteln. Entsorgen Sie alle Membranen, die außerhalb der gewünschten Dicke liegen (0,5 mm x 0,1 mm).
    7. Reinigen Sie die Membranen sorgfältig mit Verpackungsband und legen Sie sie auf ein Stück Paraffinfolie.
      HINWEIS: Wenn die Membranen nicht sofort verwendet werden, bedecken Sie die Oberseite der Membran mit Verpackungsband und lagern Sie bei RT.

3. Funktionelle Aktivität Substrate

HINWEIS: Polystyrol-Scheiben und Knochenwafer müssen am Boden von Brunnen befestigt werden, die für Osteoblasten bzw. Osteoklastkulturen verwendet werden.

  1. Polystyrol-Scheiben (Abbildung 1C)
    1. Legen Sie Klebeband auf der Rückseite eines Gewebekultur behandelt Polystyrol-Abdeckung. Mit einem geschärften Korkbohrer (5,4 mm Durchmesser) die kreisförmigen Scheiben aus dem Deckelschlupf schneiden. Die Scheiben in 70% EtOH untertauchen und über Nacht verlassen.
    2. Schrubben Sie vorsichtig die Oberseite der Scheibe mit einem Baumwolle gekippt Applikator in 70% EtOH getränkt. Stellen Sie sicher, dass die äußere Kante der Scheibe gründlich gereinigt wird.
    3. Halten Sie die Disc mit zwei Zangenpaaren fest und entfernen Sie die Abspielbandunterlage. Legen Sie die behandelte Scheibe seitlich nach unten und reinigen Sie die Rückseite mit einem mit Baumwolle gekippten Applikator.
    4. Tauchen Sie das hölzerne Ende eines baumwollgekippten Applikators in eine entgaste Mischung aus ungehärtetem PDMS und legen Sie eine kleine Menge des Polymers auf den Boden des gewünschten Brunnens.
      HINWEIS: Das ungehärtete PDMS kann bei -20 °C gelagert werden.
    5. Legen Sie die Polystyrolscheibe, seitlich nach oben behandelt, in den Brunnen und drücken Sie vorsichtig auf die Scheibe mit einem Wattestäbchen. Stellen Sie sicher, dass kein ungehärtetes PDMS mit der behandelten Seite der Disc in Kontakt kommt.
      HINWEIS: Wenn PDMS mit der behandelten Oberfläche der Disc in Kontakt kommt, entfernen Sie die Disc aus dem Brunnen und wiederholen Sie die Schritte 3.1.4 und 3.1.5 mit einer neuen Disc.
    6. Lassen Sie den Chip 30 min auf einer ebenen Oberfläche sitzen und dann bei 65 °C 4 h backen.
  2. Knochenwafer
    1. Verwenden Sie Zangen, um einen Knochenwafer (6 mm Durchmesser, 0,4 mm dick) auf den Boden einer 100 mm Schale zu legen. Halten Sie den Wafer mit den Zangen stabil und ätzen Sie vorsichtig ein "X" auf der Rückseite des Wafers mit einem Skalpell.
      HINWEIS: Während des Bildgebungsprozesses wird das "X" verwendet, um zwischen der Rückseite des Wafers und der Oberfläche zu unterscheiden, auf der Zellen gesät wurden.
    2. Verwenden Sie das hölzerne Ende eines Baumwoll-Applikators, um eine kleine Menge ungehärteten PDMS an den Boden des gewünschten Brunnens hinzuzufügen. Legen Sie den seitlich markierten Knochenwafer in den Brunnen und drücken Sie den Wafer mit einem mit Baumwolle gekippten Applikator nach unten.
    3. Lassen Sie den Chip 30 min auf einer ebenen Oberfläche sitzen und dann bei 65 °C 4 h backen.

4. Spanmontage und Sterilisation

  1. Aktivieren Sie die Oberflächen von Schicht 1 und Schicht 2 mit einem Plasmareiniger für 30 s mit einer mittleren Hochfrequenzeinstellung (RF) (entspricht ca. 10,2 W).
  2. Richten Sie die Zugangslöcher in Schicht 1 mit den Mikrokanälen in Schicht 2 aus und drücken Sie die beiden Schichten fest zusammen.
  3. Wiederholen Sie für das Tiefbrunnendesign Schritt 4.1 mit Schicht 2 und Schicht 3. Verwenden Sie während der Plasmabehandlung doppelseitiges Klebeband, um den Paraffinfilm der Schicht 3 an einer ebenen Oberfläche zu befestigen.
  4. Verwenden Sie ein Skalpell, um überschüssiges Material von der PDMS-Membran abzuschneiden. Das Blatt Paraffinfolie vorsichtig von der Unterseite des Chips abziehen
  5. Backen Sie den Chip bei 65 °C für 10 min, um die Bindungsfestigkeit zwischen den PDMS-Schichten zu erhöhen.
  6. Angled Dosierspitzen (18 Gauge, 0.5 in, 90°) in die Zugangslöcher im Deckel einlegen. Sichern Sie die Dosierspitzen mit einem zweiteiligen Epoxid am Deckel. Verwenden Sie eine Mikropipette-Spitze, um das Epoxid um jede Dosierspitze aufzutragen.
  7. Nachdem das Epoxid vollständig ausgehärtet ist, reinigen Sie den Chip mit 70% EtOH und legen Sie ihn in einen Biosicherheitsschrank. Führen Sie alle nachfolgenden Schritte innerhalb des Biosicherheitsschranks aus.
  8. Schließen Sie eine 5 ml Spritze mit sterilen Silikonschläuchen (1/32'' ID, 10 cm Länge) an die Dosierspitzen an und füllen Sie den gesamten Chip mit 70% EtOH für mindestens 30 s. Für die Flachgut-Konstruktion alle Flüssigkeiten mit einer Spritzenpumpe auf einen Durchfluss von 4 ml/h abstellen. Für das Tiefbrunnen-Design alle Flüssigkeiten verabreichen, indem Sie die Spritze langsam von Hand abgeben.
  9. Entfernen Sie den EtOH vom Chip und sterilisieren Sie den Chip über Nacht mit UV-Licht.
  10. Waschen Sie den Chip 3 mal mit dH2O. Füllen Sie den Chip mit dH2O, entfernen Sie Schläuche von den Dosierspitzen und brüten sie mindestens 48 h bei 37 °C.

5. Mechanische Ladevorrichtungsbaugruppe

HINWEIS: Die Konstruktions- und Fertigungsprozesse für die 3D-gedruckte mechanische Ladevorrichtung (Abbildung 2A-C) wurden zuvor beschrieben, und alle Konstruktionsdateien für gedruckte Komponenten wurden zuvor bereitgestellt13.

  1. Alle Komponenten der Ladevorrichtung für 30 min bei 121 °C autoklavieren.
    HINWEIS: Um eine Verformung von bedruckten Bauteilen zu vermeiden, wickeln Sie jedes Stück einzeln in Folie und legen Sie es während des Autoklaviervorgangs auf eine harte, flache Oberfläche. Metallhardware kann zusammengewickelt werden. Führen Sie alle nachfolgenden Schritte in einem Biosicherheitsschrank aus.
  2. Legen Sie eine Kompressionsfeder um die Welle der Platte und setzen Sie die Platte in das zentrale Loch auf der Unterseite der Basis(Abbildung 2D).
  3. Befestigen Sie den Zifferblattblock mit vier selbstschneidenden Schrauben an der Unterseite der Basis.
  4. Legen Sie eine zweite Kompressionsfeder um die Mittelschraube. Setzen Sie die Schraube in die sechseckige Bohrung in der Unterseite des Zifferblatts ein und schrauben Sie die Baugruppe in die Gewindebohrung in der Mitte des Zifferblattblocks.
  5. Schrauben Sie vier männlich-weibliche Aussen in den Boden der Basis.
  6. Entfernen Sie die Pufferzeit vom Gerät, indem Sie das Zifferblatt gegen den Uhrzeigersinn drehen, bis sich die Oberseite der Platte unter der Oberseite der Basis befindet. Drehen Sie dann langsam das Zifferblatt im Uhrzeigersinn, bis die Oberseite der Platte mit der Oberseite der Basis eben ist.

6. Experimentieren

HINWEIS: Protokolle für funktionelle Aktivitätsexperimente wurden zuvor bereitgestellt11,12.

  1. Ladestudien (Abbildung 3)
    1. Verwenden Sie nach Schritt 4.9 eine 5 ml Spritze, um dH2O aus dem Tiefbrunnenchip zu entfernen. Beschichten Sie den Boden des Brunnens mit 200 l 0,15 mg/ml Kollagen Typ I (CTI) in 0,02 M Essigsäure für 1 h.
    2. Spülen Sie den Chip dreimal mit Dulbeccos phosphatgepufferter Saline mit Kalzium und Magnesium (DPBS++).
    3. Legen Sie Den Chiphalter und den Samen mit MLO-Y4-Osteozyten mit einer Dichte von 2 x 104 Zellen/ml in einem minimal entiellen Alphamedium (MEM) ein, ergänzt mit 5% Kalbsserum, 5% fetalem Rinderserum und 1% Penicillin/Streptomycin.
    4. Entfernen Sie die Schläuche von den Dosierspitzen und legen Sie den Chip in eine Tiefbrunnen-Kulturschale (150 mm x 25 mm). Inkubieren Sie Zellen bei 37 °C und 5%CO2 für 72 h.
    5. Befestigen Sie sterile Schläuche an Dosierspitzen und verwenden Sie eine 5 ml Spritze, um verbrauchtes Kulturmedium vom Chip zu entfernen. Langsam in frischem Kulturmedium abgeben, um den Chip nachzufüllen.
    6. Platzieren Sie den Spanhalter in den rechteckigen Einset auf der Oberseite der Ladevorrichtungsbasis. Führen Sie die Schläuche durch die Schlitze auf dem Ladevorrichtungsdeckel und befestigen Sie den Deckel mit vier Schwenkkopfschrauben und Sechskantmuttern an der Basis.
      HINWEIS: Um sicherzustellen, dass der Deckel eben bleibt, befestigen Sie zunächst zwei Schrauben, die diagonal voneinander entfernt sind, bevor Sie die verbleibenden beiden Schrauben sichern.
    7. Tragen Sie die Last auf die Zellen auf, indem Sie das Zifferblatt im Uhrzeigersinn drehen, bis die gewünschte Plattenverschiebung erreicht ist.
      HINWEIS: Das Gerät ist so ausgelegt, dass eine Drehung des Zifferblatts einer Plattenverschiebung von 1 mm entspricht. Das auf der Oberseite der PDMS-Membran erzeugte Dehnungsfeld wurde zuvor als Funktion der Plattenverschiebung mittels Finite-Elemente-Analyse (FEA)13modelliert.
    8. Legen Sie das Ladegerät in eine leere P1000 Micropipette-Spitzenbox. Inkubieren Sie die Zellen mit der angewendeten Last für 15 min.
      HINWEIS: Die hier verwendete Ladezeit dient als Beispiel. Es können alternative Ladezeiten verwendet werden.
    9. Entfernen Sie nach der Inkubation die Last aus den Zellen, indem Sie das Zifferblatt gegen den Uhrzeigersinn drehen, bis die Platte in die ursprüngliche Startposition zurückkehrt. Entfernen Sie den Deckel vom Gerät und legen Sie den Spanhalter in die Tiefbrunnen-Kulturplatte. Inkubieren Sie die Zellen für eine 90-min-Nachladeerholungsphase.
      HINWEIS: Auch hier dient der hier verwendete Erholungszeitraum als Beispiel. Alternative Wiederherstellungszeiten können verwendet werden. Für Langzeitstudien, Futterzellen alle 72 h.
    10. Verwenden Sie eine 5 ml Spritze, um das konditionierte Medium vom Chip zu entfernen.
      HINWEIS: Dieses Medium kann bei -80 °C gespeichert und gespeichert werden.
    11. Entfernen Sie den Chip aus dem Chiphalter und verwenden Sie einen verjüngten Spachtel, um die Bindung zwischen dem PDMS-Deckel und der Well-Schicht zu brechen.
      HINWEIS: Zelluläre Assays können nun nach jedem Protokoll durchgeführt werden, das für eine Zellkulturplatte eingerichtet wurde.

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Ergebnisse

Die Flachgutkonfiguration kann zur Analyse der funktionellen Aktivität von Osteoblasten und Osteoklasten verwendet werden. Die Knochenbildung über Osteoblasten und die Resorption über Osteoklasten erfordert Kultivierungszeiten in der Größenordnung von mehreren Wochen bis Monaten. Die Knochenbildung aus MC3T3-E1-Präosteoblasten wurde mit Alizarinrot und von Kossa-Färbungen11,15quantifiziert. An Tag 49 betrug die durchschnitt...

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Diskussion

Dieser Artikel beschreibt die Grundlagen für die Herstellung einer BONE Remodeling LOC Plattform für die Kultivierung von Osteozyten, Osteoklasten und Osteoblasten. Durch die Änderung der Tiefe und Größe des Bohrbrunnens innerhalb des Chips wurden mehrere Konfigurationen entwickelt, um Osteozyten mit mechanischer Belastung zu stimulieren und die funktionellen Ergebnisse des Knochenumbaus zu quantifizieren (Abbildung 1B).

Während der Chipmont...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation unter Grant Nos. (CBET 1060990 und EBMS 1700299) unterstützt. Dieses Material basiert auch auf Arbeiten, die vom National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program unter Grant No. (2018250692) unterstützt werden. Alle Meinungen, Erkenntnisse, Schlussfolgerungen oder Empfehlungen, die in diesem Material zum Ausdruck kommen, sind die der Autoren und spiegeln nicht unbedingt die Ansichten der National Science Foundation wider.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Acrylic sheetOptix--3.175 mm thick
Angled dispensing tipsJensen GlobalJG18-0.5X-90Remove plastic connector prior to use
Biopsy punchRobbins InstrumentsRBP-101 mm diameter
Bone wafersBoneslices.com0.4 mm thickBovine cortical bone
Bovine calf serumHycloneSH30072
CalipersGlobal IndustrialT9F534164
Cell spatulaTPP99010
Chip maskProtoLabsCustom-designedPrint material: Accura SL 5530
Cork borerFisher Scientific07-865-10B
Cotton tipped applicatorPuritan806-WCL
Culture dish (100 mm)Corning430591Sterile, Non-tissue culture treated
Culture dish (150 mm)Corning430597Sterile, Non-tissue culture treated
Double sided tape3M CompanyScotch 237
Fetal bovine serumHycloneSH30910
ForcepsFisher Scientific22-327379
Leveling boxCustom-made--3D printed
Masking tape3M CompanyScoth 2600
MC3T3-E1 preosteoblastsATCCCRL-2593Subclone 4
Mechanical loading deviceCustom-made--3D printed
Minimum essential alpha mediumGibco12571-063
MLO-Y4 osteocytes----Gift from Dr. Lynda Bonewald
Packaging tapeDuck Brand--Standard packaging tape
Paraffin filmBemis ParafilmPM999
Penicillin/streptomycinInvitrogenp4333
Plasma cleanerHarrick PlasmaPDC-001Expanded plasma cleaner
Polydimethylsiloxane kitDow CorningSylgard 184
Polystyrene coverslipsNunc Thermanox174942Sterile, tissue culture treated
OvenQuincy Lab12-180
RAW264.7 preosteoclastsATCCTIB-71
ScalpelBD Medical372611
Silicone tubingSaint-Gobain TygonABW00001ID: 1/32" (0.79 mm), OD: 3/32" (2.38 mm)
SolidWorks softwareDassault Systèmes--Used to generate 3D printed models and perform FEA
Spray adhesiveLoctite2323879Multi-purpose adhesive
Syringe (5 ml)BD Medical309646Sterile
Syringe pumpHarvard Apparatus70-2213Pump 11 Pico Plus
Tapered laboratory spatulaFisher Scientific21-401-10
Two-part expoxyLoctite13953915 minute quick set
Type I collagenCorning354236Rat tail collagen
Vacuum desiccatorBel-ArtF42010-0000
Waterproof sealantGorilla8090001100% silicone sealant

Referenzen

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