Optimierung der Manschettentechnik für DieMurine Heart Transplantation

Zusammenfassung

Wir führen einen inneren Röhrenansatz zur Manschettentechnik für die heterotopische Herztransplantation der Maus ein, um das Gefäß über die Manschette zu bringen. Wir stellten fest, dass die Zusammenarbeit zwischen zwei erfahrenen Chirurgen die Operationszeit deutlich verkürzt.

Zusammenfassung

Die murine Herztransplantation wird seit mehr als 40 Jahren durchgeführt. Mit Fortschritten in der Mikrochirurgie wurden bestimmte neue Techniken eingesetzt, um die chirurgische Effizienz zu verbessern. In unserem Labor haben wir die Manschettentechnik mit zwei Hauptschritten optimiert. Zuerst verwendeten wir die innere Rohrtechnik, um ein temporäres Innenrohr in die äußere Jugularvene und das Karotisarterienblutgefäß einzufügen, um die Umwandlung des Gefäßes über die Manschette zu erleichtern. Zweitens führten wir eine vollständige heterotopische Herztransplantation in Zusammenarbeit mit zwei erfahrenen Chirurgen durch. Diese Änderungen reduzierten effektiv die Betriebszeit auf 25 Minuten, mit einer Erfolgsrate von 95%. In diesem Bericht beschreiben wir diese Verfahren ausführlich und stellen ein zusätzliches Video zur Verfügung. Wir glauben, dass dieser Bericht über die verbesserte Manschettentechnik praktische Anleitungen für die murine heterotopische Herztransplantation bieten und den Nutzen dieses Mausmodells für die Grundlagenforschung verbessern wird.

Einleitung

Die Etablierung einer heterotopischen Mausherztransplantation durch End-to-End-Anastomose im Bauch im Jahr 1973 war ein wichtiger Meilenstein in der grundlagenlichen Transplantimmunologieforschung¹. Dieses Modell bot ein wichtiges und gültiges Werkzeug für die Analyse der Mechanismen der Ischämie-Reperfusionsverletzung², immunologische Abstoßung und Toleranz^3,4. Die komplexe und zeitaufwändige Betätigung der Operation sowie das Infektionspotenzial können jedoch zu schweren perioperativen Bauchverklebungen und Entzündungsreaktionen führen, was zu einer geringen Effizienz für das heterotopische Herztransplantationsmodell führt.

Die zervikale heterotopische Herztransplantationstechnik wurde erstmals 1991 von Chen beschrieben⁵. In diesem Modell wird die äußere Jugularvene des Empfängers an der Lungenarterie des Transplantats anastomosed und die Halsschlagader wird anderastomosed zur aufsteigenden Aorta. Die Hauptvorteile dieser Methode sind die Bequemlichkeit der Überwachung und die Verringerung von Traumata für den Empfänger. Im selben Jahr beschrieb Matsuura eine verbesserte Technik, bei der das Ende der äußeren Jugularvene und der Halsschlagader über eine Teflonmanschette getrungen und mit einer umlaufenden Seidenligatur⁶fixiert wurde. Einige Forscher fixierten auch die Manschette an der rechten Lungenarterie im Spenderherz, bevor sie die Manschette in die äußere Jugularvene des Empfängers⁷einsteckten. Bisher wurde die Manschettentechnik in verschiedenen vaskulären Pedikelntransplantationsmodellen weit verbreitet, einschließlich der für^{Lungen-8-,Leber-9-}und Nieren-10-Transplantationen.¹⁰

Bis heute gibt es mehrere Schwierigkeiten im Zusammenhang mit der Manschettentechnik. Zum Beispiel ist die Halsschlagader aufgrund der zusätzlichen Elastizität, die dazu führt, dass das Gewebe nach hinten kippt, schwer über die Manschette zu werfen. Daher kann eine zusätzliche Praxis und ein mikrochirurgischer Dilator erforderlich sein, um diesen Schritt abzuschließen. Darüber hinaus kann die Zervixgefäßvorbereitung bis zu 25 Minuten dauern.

Um diese Probleme zu lösen, führen wir die Innenrohrtechnik ein, die auf der Manschettentechnik basiert und die Befestigung der Manschette an der äußeren Jugularvene und der Halsschlagader mit einem Innenrohr umfasst, um bei der Eversion der Gefäßwand zu helfen. Darüber hinaus wird die Empfängervorbereitung mit einfachem Training auf 15,5 Minuten reduziert. Diese Technik reduziert die Komplexität der Operation und erfordert keine zusätzliche Praxis oder den Einsatz eines Gefäßdilators. Es kann in der gesamten Transplantationsimmunforschung angewendet werden, insbesondere zur Überprüfung der Immuntoleranz Dritter, bei der der Empfänger zwei Herz-Allografts erhält, eine im Bauch und die andere im Nacken¹¹. Wir empfehlen auch die Zusammenarbeit zwischen zwei erfahrenen Chirurgen, um dieses Modell zu etablieren, wobei ein Chirurg das Empfängertier vorbereitet und das andere das Spenderherz erntet und implantiert. Eine solche Zusammenarbeit kann die Betriebszeit auf 25 Minuten verkürzen. Mit diesem optimierten Verfahren haben wir syngene, allogene^{12,13,14,15,16,17,18,19}, und xenogene Maus Herz Transplantation Modelle²⁰.

Der Grund für die Entwicklung der Innenrohrtechnik war es, die Betriebszeit für die Etablierung eines Mausherztransplantationsmodells mit hoher Erfolgsrate zu reduzieren. Die Optimierung des Zervixherztransplantationsmodells erleichtert den Erwerb hoher Erfolgsraten in kurzer Zeit im Vergleich zur herkömmlichen Naht- und Manschettentechnik²¹. Darüber hinaus kann das Kooperationsmodell die warme ischämische Zeit des Spenderherzens im Vergleich zu Operationen mit einem einzigen Bediener weiter reduzieren.

Protokoll

Tiere (BALB/c, C57BL/6, männlich, 8-12 Wochen) werden in einer speziellen pathogenfreien Anlage im Xiamen University Laboratory Animal Center untergebracht. C57BL/6 wird als Empfänger und BALB/c als Spender verwendet. Alle Verfahren werden gemäß den Richtlinien des Institutionellen Ausschusses für Tierpflege und -nutzung (IACUC) durchgeführt.

HINWEIS: Eine Reihe von mikrochirurgischen Instrumenten, einschließlich einer Mikroschere, MikrogeradeZange, Mikro gekrümmten Zangen und Mikronadelhalter, sind für die Operation notwendig (Tabelle und Materialien, Abbildung 1B, C, D, E). Ein Paar Einweg-Bulldog-Klemmen (Abbildung 1F) wird benötigt. Zwei Manschetten für die äußere Jugularvene und die Halsschlagader werden durch Schneiden der kundenspezifischen Polyamidröhren mit einem Skalpell Nr. 10 unter dem Mikroskop hergestellt. Der Durchmesser der Vene und der Arterienmanschette beträgt 0,9 mm bzw. 0,55 mm. Darüber hinaus beträgt der Durchmesser des Innenrohres für die entsprechende Venenmanschette 0,6 mm, und diese des Innenrohres für die entsprechende Arterienmanschette beträgt 0,28 mm(Abbildung 1G).

1. Empfängervorbereitung

1. Anästhetisieren Sie die Empfängermaus mit Pentobarbital (60 mg/kg, i.p). Verwenden Sie atraumatische mechanische Clippers, um das Haar im rechten seitlichen Zervixbereich zu entfernen.
2. Verwenden Sie einen sterilen Baumwollspitzenapplikator, um den chirurgischen Bereich mit Jod-Antiseptikum gefolgt von 70% Ethanol abzuwischen.
3. Platzieren Sie die Maus in der Supine-Position auf der Bedienplattform. Bedecken Sie die Maus mit steriler Gaze.
4. Verwenden Sie eine ophthalmologische Schere, um einen Querschnitt vom unteren Ein-Drittel-Ausschnitt-Mittellinie zum rechten Schulter-Clavusgelenk zu machen.
5. Isolieren Sie die rechte äußere Jugularvene mit mikrogekrümmten Zangen, um genügend Länge freizulegen, schneiden Sie die Zweige durch Elektrokoagulation ab und legen Sie das Gefäß am distalen Ende mit einer 6-0 Seidennaht auf.
6. Klemmen Sie die äußere juguläre Vene proximal mit einer Bulldoggeklemme und transsektieren Sie die Vene dann proximal mit einer Mikroschere auf die Ligatur.
7. Waschen Sie das Gefäßlumen mit 100 U/mL 0-4 °C heilsamen Saline, um Restblut zu entfernen.
8. Ziehen Sie die externe jugular Vene durch die Venenmanschette mit Mikro gerade Zange; Setzen Sie das Veneninnenrohr als Stent in das Lumen ein und lassen Sie die Gefäßwand mit mikrogeraden Zangen über die Manschette legen (Abbildung 2A).
9. Fixieren Sie das everted Gefäß Endothel am proximalen Ende der Manschette mit einem umfangreichen 8-0 Seidennaht (Abbildung 2B).
10. Verwenden Sie Mikrogerade Zangen, um das Veneninnenrohr aus dem Venengefäß zu ziehen.
11. Führen Sie eine stumpfe Zerlegung mit mikrogekrümmten Zangen durch, um die rechte Halsschlagader neben dem inneren Rand des Sternocleidomastoids zu isolieren.
12. Klemmen Sie die rechte Halsschlagader proximally mit einer Bulldogge Klemme, ligate die Halsschlagader distal mit einer 6-0 Seidennaht, und verwenden Sie eine Mikroschere, um die Halsschlagader proximal auf die Ligatur zu transsektieren.
13. Waschen Sie die Halsschlagader mit 100 U/mL 0-4 °C heilsamen Saline, um Restblut zu entfernen.
14. Passieren Sie die Halsschlagader durch die Arterienmanschette und legen Sie das Arterien-Innenrohr mit Mikro-Geradenzangen in das Arteriengefäß ein (Abbildung 2C).
15. Evert das Gefäß über der Manschette mit Mikro gerade Zange; fixieren Sie das Everted-Gefäß-Endothel mit einem umfangreichen 8-0 Seidennaht (Abbildung 2D).
16. Ziehen Sie das Arterien-Innenrohr mit Mikrogeraden aus dem Arteriengefäß.
    HINWEIS: Bewahren Sie die submandibuläre Drüse des Empfängers auf.

2. Spendervorbereitung

1. Anästhetisieren Sie die Spendermaus mit Pentobarbital (60 mg/kg, i.p). Verwenden Sie atraumatische mechanische Clippers, um das Haar im Bauchbereich zu entfernen.
2. Platzieren Sie die Maus in der Supine-Position auf der Bedienplattform. Bedecken Sie die Maus mit steriler Gaze.
3. Verwenden Sie einen sterilen Baumwollspitzenapplikator, um den chirurgischen Bereich mit Jod-Antiseptikum gefolgt von 70% Ethanol abzuwischen.
4. Machen Sie einen AbdominalMittelschnitt mit einer augenheilbemischen Schere und belichten Sie die Bauchhöhle.
5. Verwenden Sie mikrogekrümmte Zangen, um die minderwertige Vena cava freizulegen, und intravenös injizieren Sie dann 200 L von 100 U/mL 0-4 °C heparinisierte Saline pro 20 g Körpergewicht durch die inferiorvena cava.
6. Thorakotomie mit ophthalmologischer Schere durchführen, die Rippen durch die bilateralen midaxillären Linienschnitte abschneiden, die vordere Brustwand nach außen kippen, um die Brusthöhle freizulegen.
7. Verbrauchen Sie den Thymus mit mikrogekrümmten Zangen.
8. Setzen Sie die Aorta aus, und durchdringen Sie dann 200 l von 100 U/ml 0-4 °C heilte Saline durch den Aortenbogen an die Herzkranzgefäße.
   HINWEIS: Vermeiden Sie es, Gasblasen in das Spenderherz zu durchdringen.
9. Verwenden Sie eine Mikroschere, um die aufsteigende Aorta am Anfang des Aortenbogens zu transsektieren.
10. Transect die Lungenarterie am Anfang der beiden Hauptzweige mit einer Mikroschere.
11. Ligate die überlegene Vena cava und unterlegenven cava proximally mit einer 6-0 Seidennaht und verwenden Sie eine Mikroschere, um Vene distally auf die Ligatur zu transsektieren.
12. Die Lungenvenen umlaufend mit einer einzigen 6-0 Seidennaht zusammenziehen und die Venenzweige mit einer Mikroschere distal zur Ligatur abschneiden.
13. Entfernen Sie das Herztransplantat aus dem umgebenden Weichgewebe; in 0-4 °C heiler Saline aufbewahren.

3. Herzimplantation

1. Legen Sie das Spenderherz kopfüber in den rechten Halsbereich des Empfängers.
2. Geben Sie die Lungenarterie des Spenderherzens in eine 6-0 Seidenschlaufe mit Mikrogeraden ein.
3. Wickeln Sie das Gefäßlumen um die Venenmanschette, und ziehen Sie dann die 6-0 Seidennahtschlaufen um die Manschette, um das Gefäßgelenk zu banden.
4. Führen Sie eine Anastomose der Aorta des Transplantats und der Arterienmanschette durch Befolgen der in Schritt 3.2 beschriebenen Schritte.
5. Lassen Sie die geklemmte Jugularvene gefolgt von der geklemmten Jugulararterie los. Halten Sie das Gefäßgelenk ungedreht und stellen Sie sicher, dass der Blutfluss ungehindert ist.
   HINWEIS: Der Sinusrhythmus, der innerhalb von 1 min zu mehr als 200 Mal zurückkehrt, gilt als normal.
6. Befeuchten Sie das Spenderherz mit warmer (37 °C) Saline und prüfen Sie, ob das Transplantat blutet. Stellen Sie das pulsierende Herztransplantat in den subkutanen Raum ein, und verschließen Sie dann den Schnitt.

4. Postoperative Pflege und Graft-Bewertung

1. Nehmen Sie die Zeit zum normalen Sinusrhythmus und die Erhaltung des normalen Sinusrhythmus für mindestens 5 Minuten nach der Klemmenfreigabe auf, um die postoperative Transplantatfunktion zu überwachen.
2. Legen Sie den Empfänger allein auf eine warme Decke, bis der Empfänger aus der Anästhesie aufwacht. Verabreichen Sie Buprenorphin Analgesie, 0,05 mg/kg, s.c. am Ende der Operation und alle 12 Stunden für 72 Stunden nach der Operation.
3. Zeichnen Sie das Gewicht und den postoperativen Wiederherstellungsstatus des Empfängers täglich auf. Im Falle von >15% Gewichtsverlust im Vergleich zu dem am Operationsdatum, hemiplegische Lähmung, oder Infektion, einschläfern den Empfänger über terminale Isofluran-Inhalation²¹.
4. Überwachen Sie das Transplantatüberleben durch tägliche Palpation. Die Operation gilt als erfolgreich, wenn der murine Allograft für >72 Stunden überlebt. Grad die Transplantatfunktion, wie zuvor berichtet²²: Skala 3 - kräftig pulsieren und Frequenz; Skala 2 - weniger pulsierend; Skala 1- Fibrillation und bevorstehende Ablehnung; oder Skala - 0, Verlust des Herzschlags und vollständige Ablehnung.

Ergebnisse

Chirurgische Operationszeit

Nach der Ausbildung kann ein erfahrener Chirurg die Operation innerhalb von 35 Minuten mit der Innenrohrtechnik erfolgreich durchführen, wobei ca. 15,5 Minuten für die Empfängervorbereitung benötigt werden, 10,9 Minuten für die Spendervorbereitung und 4,4 Minuten für Spenderherzanastomosen erforderlich sind. Die kalte und warme Ischämiezeit (von der Spendervorbereitung bis zur Herzimplantation) wird im Vergleich zur Operation mit der Manschet...

Diskussion

Mausherztransplantationsmodelle sind wichtige Werkzeuge für die Transplantationsimmunologieforschung, da Werkzeuge und Materialien zur Bewertung der Immunmechanismen dieses Modells und einer großen Anzahl genmodifizierter Mäuse zur Verfügung stehen. Mikrochirurgische technische Herausforderungen, wie Die Naht gefäßnah und die Eversion, haben jedoch ihre weit verbreitete Verwendung eingeschränkt. In der vorliegenden Studie haben wir einige technische Kernherausforderungen der murinen Herztransplantation untersucht ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artery cuff	Self-made		Polyamide tube. diameter: 0.55 mm,length: 1.0 mm
Artery inner tube	Self-made		Polyamide tube. Diameter: 0.28mm
Micro curved forceps	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory	WA3050	1/8 arc, 0.3-mm tip without a hook
Micro needle holders	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory	WA2050	0.2-mm tip
Micro scissors	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory	WA1050	Straight, blade length: 10 mm
Micro straight forceps	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory	WA3060	0.15-mm tip without a hook
Scanlan Vascu-Statt Bulldog Clamps	Scanlan International Inc	1001-531	Clamping pressure 20–25 grams
Vein cuff	Self-made		Polyamide tube. diameter: 0.9 mm,length: 1.2 mm
Vein inner tube	Self-made		Polyamide tube. Diameter: 0.6 mm