Mitigation of Blood Borne Cell Attachment to Metal Implants through CD47-Derived Peptide Immobilization

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll zum Anhängen von Peptid CD47 (pepCD47) an Metallstents mit Polybisphosphonatchemie vorgestellt. Die Funktionalisierung von Metallstents mit pepCD47 verhindert die Anhaftung und Aktivierung von Entzündungszellen und verbessert so deren Biokompatibilität.

Zusammenfassung

Die wichtigsten Komplikationen im Zusammenhang mit Bare-Metal-Stents und Drogen-Eluing-Stents sind In-Stent-Restenose bzw. späte Stentthrombose. Daher bleibt die Verbesserung der Biokompatibilität von Metallstents eine große Herausforderung. Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine robuste Technik der Metalloberflächenmodifikation durch biologisch aktive Peptide zu beschreiben, um die Biokompatibilität von Blutkontakten mit medizinischen Implantaten, einschließlich endovaskulärer Stents, zu erhöhen. CD47 ist ein immunologischer artenspezifischer Selbstmarker und hat entzündungshemmende Eigenschaften. Studien haben gezeigt, dass ein 22 Aminosäurepeptid, das der Ig-Domäne von CD47 im extrazellulären Bereich (pepCD47) entspricht, entzündungshemmende Eigenschaften wie das Volllängenprotein aufweist. In vivo-Studien an Ratten und Ex-vivo-Studien an Kaninchen- und humanen Blutversuchssystemen aus unserem Labor haben gezeigt, dass die Immobilisierung von PepCD47 auf Metallen ihre Biokompatibilität verbessert, indem sie die anhängliche Zellanhaftung und -aktivierung verhindert. In diesem Artikel wird das Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Funktionalisierung von Metalloberflächen und Peptidbefestigung beschrieben. Die Metalloberflächen werden mit Polyallamin-Bisphosphat mit latenten Thiolgruppen (PABT) modifiziert, gefolgt von Deprotection von Thiolen und Amplifikation von Thiol-reaktiven Stellen durch Reaktion mit Polyethylenimin, das mit Pyridyldithio-Gruppen (PEI-PDT) installiert ist. Schließlich wird pepCD47, das terminale Cysteinrückstände enthält, die über einen dualen 8-Amino-3,6-Dioxa-Octanoyl-Abstandser mit der Kernpeptidsequenz verbunden sind, über Disulfidbindungen an der Metalloberfläche befestigt. Diese Methode der Peptidbefestigung an der Metalloberfläche ist effizient und relativ kostengünstig und kann daher angewendet werden, um die Biokompatibilität mehrerer metallischer Biomaterialien zu verbessern.

Einleitung

Perkutane koronare Intervention ist die erste Therapielinie zur Behandlung von koronaren Herzkrankheiten (CAD) und beinhaltet in erster Linie das Stents der erkrankten Arterien. In-Stent-Restenose (ISR) und Stentthrombose sind jedoch häufige Komplikationen im Zusammenhang mit stent Deployment¹. Die Blutinteraktion an der Blut-Stent-Schnittstelle ist durch eine fast sofortige Adsorption von Plasmaproteinen auf der Metalloberfläche gekennzeichnet, gefolgt von Thrombozyten- und Entzündungszellanhaftung und Aktivierung². Die Freisetzung der entzündlichen Zytokine und Chemokine aus aktivierten Entzündungszellen führt zur phänotypischen Veränderung der vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs) in den Tunikamedien und löst deren zentripetale Migration in das Intimfach aus. Die Proliferation des aktivierten VSMC in der Intima führt zu Intimschichtverdickung, Lumenverengung und In-Stent-Restenose³. Drug Eluing Stents (DES) wurden entwickelt, um VSMC Proliferation zu verhindern; jedoch haben diese Medikamente eine off-target zytotoxische Wirkung auf die Endothelzellen^4,5. Daher ist die späte Stentthrombose eine häufige Komplikation im Zusammenhang mit DES^6,7. Stents aus biologisch abbaubaren Polymeren, wie Poly-L-Laktid, haben in den Tierversuchen und ersten klinischen Studien viel Versprechen gezeigt, wurden aber schließlich zurückgerufen, als die klinische Anwendung im "realen Leben" ihre Unterlegenheit gegenüber der^3. Generation des⁸zeigte. Daher ist es notwendig, die Biokompatibilität von Bare-Metal-Stents für bessere Patientenergebnisse zu verbessern.

CD47 ist ein allgegenwärtig exprimiertes Transmembranprotein, das die angeborene Immunantwort hemmt, wenn es an seinen Kognanorezeptor Signal Regulatory Protein alpha (SIRP)⁹gebunden ist. Der SIRP-Rezeptor hat eine Immunzell-Tyrosin-Hemmende Motiv (ITIM) Domäne und die Signalereignisse auf SIRP - CD47 Interaktion führen letztlich in der Downregulation der entzündlichen Zellaktivierung^10,11,12,13. Untersuchungen in unserem Labor haben gezeigt, dass rekombinantes CD47 oder sein Peptidderivat, das der 22-Aminosäure-Ig-Domäne der extrazellulären Region CD47 (pepCD47) entspricht, die Immunantwort des Wirts auf eine Reihe klinisch relevanter Biomaterialien^14,15,16reduzieren kann. Kürzlich haben wir gezeigt, dass pepCD47 auf Edelstahl-Stentoberflächen immobilisiert werden kann und die pathophysiologische Reaktion im Zusammenhang mit Derenose deutlich reduzieren kann. Bemerkenswert ist, dass die pepCD47 modifizierten Oberflächen für relevante Einsatzbedingungen wie Langzeitlagerung und Ethylenoxidsterilisation¹⁷geeignet sind. Zu diesem Zweck kann pepCD47 ein nützliches therapeutisches Ziel sein, um die klinischen Einschränkungen von endovaskulären Stents anzugehen.

Die Strategie für die kovalente Befestigung von pepCD47 an einer Metalloberfläche beinhaltet eine Reihe neuartiger chemischer Modifikationen der Metalloberfläche. Die Metalloberflächen werden zunächst mit Polyallaminbisphosphonat mit latenten Thiolgruppen (PABT) beschichtet, gefolgt vom Deschutz der Thiole und der Befestigung von Polyethyleneimin (PEI) mit installierten Pyridyldithio-Gruppen (PDT). PDT-Gruppen von PEI, die in der Reaktion mit degeschützten PABT-Thiolen nicht verbraucht werden, werden dann mit PepCD47 reagiert, die Thiole in die terminalen Cysteinrückstände einbeziehen, was zu einer Bindung von pepCD47 an die Metalloberfläche über eine Disulfidbindung^14,17,18führt. Wir verwendeten ein fluorophorkonjugiertes pepCD47 (TAMRA-pepCD47), um die Eingangskonzentration von Peptid zu bestimmen, die zu einer maximalen Oberflächenimmobilisierung des Peptids führt. Schließlich bewerteten wir die akute und chronische entzündungshemmende Kapazität der pepCD47 beschichteten Metalloberflächen ex vivo mit dem Chandler-Loop-Apparat bzw. Monozytenaufsatz/Makrophagen-Expansionstest.

Dieses Papier enthält ein systematisches Protokoll für die Befestigung von thiolierten Peptiden an der Metalloberfläche; Bestimmung der maximalen Immobilisierungsdichte des Peptids; und Bewertung der entzündungshemmenden Eigenschaften von pepCD47 beschichteten Metalloberflächen, die Vollblut und isolierten Monozyten ausgesetzt sind.

Protokoll

Alle menschlichen Proben für dieses Experiment wurden in Übereinstimmung mit dem IRB des Children es Hospital of Philadelphia gewonnen. Alle Tierversuche wurden nach Genehmigung der IACUC des Children es Hospital of Philadelphia durchgeführt.

1. Beschichten von Blankmetalloberflächen mit PEI-PDT

1. Waschen Sie die Edelstahlfolien-Coupons (1 cm x 1 cm oder 0,65 cm x 1 cm) oder Edelstahl-Mesh-Scheiben mit 2-Isopropanol in einem Shaker (60 °C, Geschwindigkeit 200 Rpm) für 5 min. Führen Sie diesen Schritt 2x aus. Dann 2x mit Chloroform (60 °C, Drehzahl 200 Rpm) für jeweils 10 min waschen.
2. Die gereinigten Edelstahlproben 30 min bei 220 °C in einen Ofen stellen.
3. Bereiten Sie 5 ml 0,5% der PABT-Lösung vor, indem Sie 25 mg Polyallaminbisphosphonat mit latenten Thiolgruppen (PABT) und 5 mg Kaliumbicarbonat (KHCO₃) in 5 ml DDW auflösen und bei 72 °C in einem Shaker bei 200 Umdrehungen pro Minute für 30 min inkubieren.
   HINWEIS: Für DIE PABT-Synthese beziehen Sie sich auf zuvor veröffentlichte Literatur¹⁸.
4. Die gebackenen Folien oder Netzscheiben in 0,5% wässrige Lösung von PABT eintauchen und in einem Shaker (72 °C, Geschwindigkeit 200 Umdrehungen pro Minute) für 1 h inkubieren.
5. Die PABT-modifizierten Proben mit entionisiertem destilliertem Wasser (DDW) 5x waschen, die Proben in eine neue Durchstechflasche geben und mit DDW 5x erneut waschen.
6. Bereiten Sie insgesamt 5 ml TCEP-Lösung (12 mg/ml) vor, indem Sie 60 mg Tris (2-Carboxyethyl)-Phosphinhydrochlorid (TCEP) in 5 ml mit 0,1 M Essigpuffer (0,57 ml Eisessigsäure, 820 mg Natriumacetat in 100 ml DDW) auflösen.
7. Behandeln Sie die PABT-modifizierten Proben mit TCEP 15 min bei Raumtemperatur (RT) auf einem Shaker.
   HINWEIS: TCEP wird verwendet, um die Thiolgruppen zu entschützen.
8. Degas DDW in einem runden Bodenkolben mit einem Vakuum-Erzeugungsgerät, wie einem Lyophilisator und waschen Sie die TCEP behandelten Folien oder Netzscheiben mit entgastem DDW für 5x. Die Proben in eine neue Durchstechflasche überführen und zusätzlich 5x mit entgastem DDW waschen.
   HINWEIS: Es ist von größter Bedeutung, schnell zu arbeiten, um die Oxidation von Thiolen auf der Metalloberfläche durch Luftsauerstoff zu verhindern.
9. Bereiten Sie 5 ml 1% PEI-PDT-Lösung vor, indem Sie 212,5 l DES Lagers PEI-PDT und 125 l 0,4 M Natriumacetat in entgaster DDW verdünnen. Führen Sie Schritt 1.9 gleichzeitig mit Schritt 1.8 durch, um die Exposition der Proben gegenüber atmosphärischer Luft zu minimieren.
   HINWEIS: Die Synthese von PEI-PDT wird in der zuvor veröffentlichten Literatur¹⁸beschrieben.
10. Inkubieren Sie die gewaschenen Edelstahlproben mit 1% PEI-PDT. Ersetzen Sie Luft durch Argongas, versiegeln Sie die Fläschchen luftdicht und mischen Sie auf einem Shaker bei RT für 1 h. Entweder sofort mit der Peptidkonjugation fortfahren oder bei 4 °C bis zu 1 Woche lagern.

2. Anlage und qualitative/quantitative Bewertung der fluorophorkonjugierten PepCD47-Retention auf Metalloberflächen mittels Fluoreszenzmikroskopie und Fluorimemetrie

1. Waschfolien-Coupons oder Netzscheiben, wie in Abschnitt 1, Schritte 1.1-1.10 oben mit DDW 5x beschrieben. Die Proben in eine neue Durchstechflasche überführen und zusätzlich 5x mit DDW waschen. 2x mit entgastem Ethanol und 2x mit entgastem Dimethylformamid (DMF) waschen.
2. Bereiten Sie Tetramethylrhodin (TAMRA)-konjugierte PepCD47-Stammlösung vor, indem Sie TAMRA-konjugiertes PepCD47-Pulver in entgastem Dimethylformamid (DMF) auf eine Endkonzentration von 1 mg/ml auflösen. Aliquot die Lagerlösung in 1 ml Zuteilungen. In gut verschlossenen Rohren unter Argonatmosphäre bei -20 °C lagern.
3. Verdünnen Sie 1 mg/ml der Stammlösung von TAMRA-konjugiertem PepCD47 mit entgastem DMF, um die folgenden Konzentrationen von fluorophor konjugierter PepCD47 - 10, 30, 100 und 200 g/ml vorzubereiten.
   HINWEIS: Wenn TAMRA-konjugierte pepCD47 scheint gefällt zu sein, reduzieren Sie den Bestand TAMRA-konjugierte pepCD47 Lösung mit TCEP Perlen im Verhältnis 1:1, bei RT für 20 min. Beachten Sie, dass vor dem Hinzufügen des TAMRA-konjugierten pepCD47 zu den TCEP-Perlen die TCEP-Perlenlösung drehen, den Überstand entfernen und dann mit dem TAMRA-konjugierten pepCD47 fortfahren.
4. Inkubieren Sie die PEI-PDT modifizierten Foliencoupons mit 10, 30, 100 oder 200 g/ml TAMRA-konjugierten pepCD47 in Dreisprachigen für jede Bedingung auf einem Shaker bei RT unter Argonatmosphäre für 1 Stunde. Pei-PDT modifizierte Netzscheiben sowie Netzscheiben, die nicht über Schritt 1.2 hinaus modifiziert wurden (Bare-Metal-Steuerungen) mit 100 g/ml TAMRA-konjugierter pepCD47 in Triplicaten bei RT unter Argonatmosphäre auf einem Shaker für 1 h.
   HINWEIS: Ab diesem Schritt werden die Fläschchen in Aluminiumfolie eingewickelt, um den Inhalt vor Licht zu schützen.
5. Waschen Sie die fluorophorkonjugierten pepCD47-beschichteten Oberflächen, um das nicht kovalent befestigte Peptid in folgender Reihenfolge zu entfernen: DMF (3x), DMF/DDW bei 1:1, DDW (3x), 0,3% SDS in 20 mM Tris pH 7,4 (3x, 5 min je bei 70 °C auf einem Shaker), DDW (3x), Wechselfläschchen und eine abschließende DDW-Wäsche.
6. Steuer- und kovalent konjugierte Netzscheiben auf ein Mikroskopglas legen, 50 L PBS hinzufügen und einen Deckelschlupf platzieren. Bildnetzscheiben mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop, das mit einem Rhodamine-Filter-Set ausgestattet ist. Nehmen Sie repräsentative Bilder mit 100-facher Vergrößerung auf.
7. Bereiten Sie 15 ml 12 mg/ml TCEP-Lösung vor, indem Sie 180 mg TCEP in 1:1 v/v-Mischung aus Methanol und 0,1 M Essigpuffer auflösen.
8. Jede gewaschene Folie mit 1 ml TCEP-Lösung auf einem Shaker bei RT für 15 min inkubieren.
9. Bereiten Sie die folgenden Standards vor, indem Sie den TAMRA-konjugierten PepCD47-Bestand (1 mg/ml) seriell verdünnen – 100 g/ml, 10 g/ml, 1 g/ml, 0,1 g/ml und 0,01 g/ml. Verwenden Sie die TCEP-Lösung als Verdünner.
10. Analysieren Sie die TAMRA-konjugierte pepCD47, die von der Metalloberfläche freigesetzt wird, mit der Kalibrierkurve, die mit den Standards durch Fluoridmetrie bei 544/590 nm Anregungs- und Emissionswellenlängen erzeugt wird.

3. Anbringen von humanem PepCD47 an PEI-PDT modifizierten Oberflächen

1. PEI-PDT-beschichtete Proben wie im Abschnitt 1, Schritte 1.1-1.10 oben beschrieben, mit entgastem DDW 5x waschen, die Durchstechflasche wechseln und mit entgastem DDW 5x waschen.
2. Bereiten Sie menschliche pepCD47-Lagerlösung (1 mg/ml) vor, indem Sie humanes PepCD47-Pulver in entgaster 50% Essigsäure auflösen, um eine Konzentration von 1 mg/ml zu erreichen.
3. Bereiten Sie die Arbeitskonzentration des menschlichen PepCD47 (100 g/ml) vor, indem Sie 500 l des Bestands an humanem PepCD47 in 4.500 l entgaster 1x phosphatgepufferter Saline (PBS) auflösen.
4. Inkubieren Sie die gewaschenen PEI-PDT-beschichteten Proben mit 100 g/ml pepCD47 bei RT mit Schütteln für 1 h.
5. Waschen Sie die humanen pepCD47-beschichteten Proben, um überschüssiges Peptid in der folgenden Reihenfolge PBS (3x), DDW (3x), 0,2% Tween-20 (3x, je 5 min), DDW (3x), Wechselfläschchen und abschließende DDW-Wäsche zu entfernen.
   HINWEIS: Humane pepCD47 beschichtete Oberflächen können bis zu 6 Monate trocken bei 4 °C gelagert werden.

4. Beschichtung der PEI-PDT modifizierten Oberflächen mit Rührsequenz (Scr)

1. Lösen Sie das Rührsequenzpulver in entgaster 0,1% Essigsäure auf, um eine Stammlösung von 1 mg/ml herzustellen.
2. Bereiten Sie eine Lösung von 100 g/ml Rührpeptid vor, indem Sie 500 l der in 4.500 l entgasten 0,1% Essigsäure auflösen.
3. Beschichten Sie die gewaschenen PEI-PDT-Proben mit 100 g/ml Rührpeptid bei RT mit Schütteln für 1 h.
4. Um unbefestigtes Rührpeptid zu entfernen, waschen Sie die Oberflächen in der folgenden Reihenfolge 0,01% Essigsäure (3x), DDW (3x), 0,2% Tween-20 (3x, 5 min), DDW (3x), Durchstechflaschen und eine DDW-Wäsche wechseln.

5. Chandler-Schleife zur Analyse der zellulären Befestigung an Metalloberflächen

1. Beschichten Sie die Metallfolien (0,65 cm x 1cm) entweder mit humanem PepCD47 oder Rührpeptid gemäß der Beschreibung auf Abschnitt 1 gefolgt von 3 oder 4.
2. Schneiden Sie 1/4" PVC-Rohre in drei 38 cm lange Stücke.
3. Legen Sie bis zu 8 unveränderte, verknurrte Peptid- oder pepCD47-modifizierte Metallfolien in drei verschiedene Tuben ein.
4. Sammeln Sie 30 ml Blut von gesunden menschlichen Spendern frei von Anti-Thrombozyten-Medikamenten gemäß dem institutionellen IRB-Protokoll. Spritze vorladen mit 1 ml 4% Natriumcitrat, um die Gerinnung von gesammeltem Blut zu verhindern.
5. Mit einer 10 ml Spritze 10 ml Blut in jedes Rohr geben und die Enden mit Metalladaptern verbinden. Legen Sie die blutgefüllten Schläuche auf die Räder des Chandler-Schlaufesgeräts.
6. Übergeben Sie das Blut entlang der Metallfolien durch Raddrehung bei 37 °C bei der Geschwindigkeit berechnet, um die Schere von 25 Dyns/cm² für 4 h zu produzieren.
7. Das Blut aus den Röhrchen ableiten und gemäß den IRB-Anforderungen entsorgen.
8. Schneiden Sie die Rohre mit dem Skalpell, um die Folien aus jedem Rohr zu holen.
9. Bereiten Sie 2% Glutaraldehydlösung vor, indem Sie die 10 ml 4% Glutaraldehydlösung mit 10 ml Natriumkacodylatpuffer mit 0,1 M Natriumchlorid verdünnen.
10. Die Folien in 2% Glutaraldehydlösung für 15 min inkubieren und bei 4 °C über Nacht lagern. Waschen Sie vor der Analyse die Metallfolien 3x mit PBS.

6. Analyse der zellulären Befestigung an Metalloberflächen mit CFDA-Farbstoff

1. 8 ml PBS in 15 ml Rohr in einem Auf 37 °C eingestellten Wasserbad erwärmen.
2. Bereiten Sie die CFDA-Farblösung CFDA (Carboxy-Fluorescein-Diacetat, Succinimidylester) wie folgt vor - fügen Sie 90 L DMSO zu einer CFDA-Farbdurchstechflasche hinzu, um eine Lagerkonzentration von 10 mM zu erreichen. Als nächstes bereiten Sie die Arbeitskonzentration von 93,75 m vor, indem Sie 75 l des CFDA-Bestands auf 8 ml warmes PBS anfügen. Mischen Sie die Rohre ein paar Mal und bedecken Sie das Rohr mit Aluminiumfolie.
   HINWEIS: Es ist ratsam, den CFDA-Farbstoff vor jedem Gebrauch frisch zuzubereiten.
3. Jede Folie mit 1 ml CFDA-Farbstoff in einer 24-Well-Platte inkubieren. Bedecken Sie die Platte mit Aluminiumfolie und bebrüten Sie die Platte bei 37 °C für 15 min.
4. Waschen Sie die Metallfolien 3x mit PBS, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen. Bild mit dem invertierten Fluoreszenzmikroskop.

7. Monozytenaufsatz und Makrophagenerweiterung auf den pepCD47-modifizierten und blanken Metalloberflächen

1. Sammeln Sie 10 ml peripheres Blut über den Vena cava Zugang während des Opfers einer 400-450 g männlichen Sprague-Dawley Ratte. Mischen Sie sofort mit 1.000 I.E. Natriumheparin, um die Gerinnung zu verhindern.
2. Pipette 10 ml Dichtegradientenmedium in ein 50 ml kegelförmiges Rohr. Mischen Sie das Blut mit 5 ml PBS, und schichten Sie das blutverdünnte Blut sorgfältig über das Dichtegradientenmedium mit einer Pasteur Pipette. Zentrifuge in einem schwingenden Schaufelrotor bei 800 x g und 18-25 °C für 20 min mit minimalen Einstellungen der Beschleunigung und Verzögerung.
3. Sammeln Sie mit einer Pasteur-Pipette eine undurchsichtige Schicht buffy Mantel auf der Schnittstelle zwischen Plasma und Ficoll. Buffy Mantel 1:3 mit PBS und Zentrifuge bei 550 x g und 4 °C für 10 min bis zu buffy Fellzellen verdünnen.
4. Buffy-Beschichtungszellen in 3 ml ACK-Lysepuffer wieder aussetzen, um kontaminierende Erythrozyten zu lyse. 4 min auf Eis bebrüten. Fügen Sie 12 ml Zelltrennpuffer hinzu (CSB; 0,5% BSA, 0,5% FBS, 2 mM EDTA/PBS).
5. Zentrifuge bei 550 x g und 4 °C für 10 min. Das Pellet in 10 ml CSB wieder aufhängen.
6. Zentrifuge bei 200 x g und 4 °C für 10 min, um Thrombozyten zu eliminieren. Wiederholen Sie dies zweimal.
7. Setzen Sie das Pellet in 500 l CSB wieder auf. Fügen Sie 10 g der folgenden Anti-Ratten-Antikörper der Maus hinzu: CD8a (Klon OX-8), Anti-CD5 (Klon OX-19), Anti-CD45RA (Klon OX-33) und Anti-CD6 (Klon OX-52).
8. Bei 4 °C auf einem vertikalen Rohrrotator für 1 h inkubieren. 9,5 ml CSB hinzufügen. Zentrifuge bei 300 x g und 4 °C für 10 min. Überstand entsorgen, das Pellet in 10 ml CSB wieder aufhängen und zentrifugieren.
9. Setzen Sie das Pellet in 500 l CSB wieder auf. Fügen Sie 150 L Ziegen-Anti-Maus-IgG-Mikroperlen hinzu. Bei 4 °C auf einem vertikalen Rohrrotator für 20 min inkubieren. 9,5 ml CSB hinzufügen. Zentrifuge bei 300 x g und 4 °C für 10 min.
10. Entsorgen Sie den Überstand. Das Pellet in 1 ml CSB wieder aufhängen.
11. Legen Sie eine LS-Säule in ein magnetisches Trennzeichen.  Primieren Sie die LS-Säule mit 3 ml CSB. Verwerfen Sie den Spaltendurchsatz. Fügen Sie 1 ml wieder aufgehängtes Zellpellet aus dem Schritt 7.10 hinzu. Beginnen Sie mit dem Sammeln des Durchsatzes. Fügen Sie nach dem Ablaufstopp 5 ml CSB hinzu und sammeln Sie den Spaltendurchsatz, bis der Durchfluss stoppt.
12. Zentrifugieren Sie den Säulendurchsatz (6 ml) mit negativ ausgewählten Monozyten bei 300 x g und 4 °C für 10 min. Das resultierende kleine Pellet in 2 ml RPMI-1640 Medium, ergänzt durch 10% FCS, 1% Pen/Strep und 100 ng/mL Ratte Makrophagenkolonie stimulierenden Faktor (M-CSF) wieder aufsetzen.
13. Zählen Sie die Monozyten mit Hämozytometer. Monozytenkonzentration auf 5 x 10⁵ Zellen/ml einstellen.
14. Fügen Sie 1 ml Volumen Monozytenaufhängung in die einzelnen Bohrungen einer 12-Well-Platte mit den blanken Edelstahlfolienproben (N=3) oder Mit RattenpepCD47 (N=3) modifizierten Edelstahlproben gemäß 1.1-1.10 und 3.1-3.6 hinzu.
15. Ändern Sie das Medium an den Tagen 3 und 5 nach der Aussaat. Am 6. Tag nach der Aussaat die Zellen mit PBS waschen und mit 4% Paraformaldehyd bei Raumtemperatur für 15 min fixieren. Zweimal mit PBS für 5 min waschen.
16. Entfernen Sie die Edelstahlfolien und legen Sie sie einzeln in eine neue 12-Well-Platte. Drehen Sie die Folien nicht um.
17. Inkubieren Sie in 0,5% Tween-20/PBS für 15 min, um die Zellen zu permeabilisieren. Zweimal mit PBS für 5 min waschen.
18. Block in 10% Ziegenserum/PBS für 20 min. Aspirieren Sie das Serum. Nicht waschen. Fügen Sie Maus Anti-Ratten CD68 Antikörper hinzu (verdünnt 1:100 in 1%BSA/PBS). Bei Raumtemperatur 1 h inkubieren. Waschen Sie 3x in PBS für je 5 min.
19. Fügen Sie Ziege Anti-Maus IgG Alexa Fluor 546 (verdünnt 1:200 in 1% BSA/PBS). Inkubieren Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur für 45 min. Waschen Sie in PBS für 5 min. Gegenfärbung mit 1 g/mL Hoechst 33342 Farbstoff in dunkel bei Raumtemperatur für 10 min. Waschen Sie 3x in PBS für je 5 min.
20. Drehen Sie die Folien und das Bild mit einem Fluoreszenzmikroskop mit der invertierten Optik. Erfassen Sie Bilder mit 200-facher Vergrößerung mit blauen und roten Filtereinstellungen.
21. Zählen Sie die angehängten Monozyten in den einzelnen Bildern und berechnen Sie die Gruppendurchschnitte und Standardabweichungen.

Ergebnisse

Die Metalloberflächen werden thiol-reaktiv für die Peptidbefestigung durch eine Reihe chemischer Modifikationen gerendert, wie in Abbildung 1dargestellt. PaBT-Inkubation gefolgt von PEI-PDT-Behandlung macht die Metalloberfläche für Peptid-Befestigung zugänglich. Peptid CD47 (pepCD47) mit Cysteinrückstand am C-Terminus, der über eine flexible duale AEEAc-Brücke mit der Pepcd47-Sequenz verbunden ist, wird über Disulfidbindungen kovalent an den Thiol-reaktiven Oberflächen befestigt. M...

Diskussion

Wir zeigen und beschreiben eine relativ neuartige chemische Strategie, um therapeutische Peptidmoieties an eine Edelstahloberfläche anzuhängen, mit dem übergeordneten Ziel, die Reaktivität der Oberfläche mit entzündlichen Zellen im Blut zu reduzieren. Die hier beschriebene Bisphosphonatchemie beinhaltet die Koordinatenbildung zwischen den Metalloxiden und Bisphosphonatgruppen von PABT. Die Dicke der auf der Metalloberfläche gebildeten Polybisphosphonat-Monoschicht überschreitet 5 nm¹⁸nicht...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M Tris-HCL	Invitrogen	15567-027	pH - 7.5
4% Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16539-07
4% Sodium Citrate	Sigma	S5770
ACK lysing buffer	Quality Biologicals	118-156-721
anti-CD45RA Ab (mouse anti-rat; clone OX-19)	Biolegend	202301
anti-CD5 Ab (mouse anti-rat; clone OX-19)	Biolegend	203501
anti-CD6 Ab (mouse anti-rat; clone OX-52)	BD Biosciences	550979
anti-CD68 Ab (mouse anti-rat; clone ED-1)	BioRad	MCA341
anti-CD8a Ab (mouse anti-rat; clone OX-8)	Biolegend	201701
Chloroform Certified ACS	Fisher Chemical	C298-500
Dimethyl Formammide (DMF)	Alfa Aesar	39117
Embra stainless steel grid	Electron Microscopy Sciences	E200-SS	stainless steel mesh mesh disks
Ficoll Hypaque	GE Healthcare	17-1440-02
Glacial acetic acid	ACROS organic	148930025
goat anti-mouse IgG Alexa Fluor	ThermoFisher	A11030
Heparin sodium	Sagent Pharmaceuticals	402-01
Human pepCD47	Bachem	4099101
Isopropanol	Fisher Chemical	A426P-4
Metal adapters	Leur Fitting	6515IND	1 way adapter 316 ss 1/4"-5/16" hoes end
Methanol	RICCA chemical company	4829-32
Microscope	Nikon Eclipse	TE300
Phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	14190-136
Pottasium Bicarbonate (KHCO3)	Fisher Chemical	P184-500
PVC tubes	Terumo-CVS	60050	1/4" X 1/16 8'
sodium cacodylate buffer with 0.1M sodium chloride	Electron Microscopy Sciences	11653
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Bio-Rad laboratories	161-0302
Sodum actetate (C2H3NaO2)	Alfa Aesar	A13184
Src peptide	Bachem	4092599
Stainless steel (AISI 304) cylinder-shaped samples with a lumen	Microgroup, Medway, MA	20097328	1 cm X 6 mm OD
Stainless steel foils (AISI 316L)	Goodfellow, Coraopolis, PA		100 mm X 100 mm X 0.05 mm
Tetramethylrhodamine-conjugated pepCD47 (TAMRA-pepCD47)	Bachem	4100277
TMB (3,3’ ,5,5’ -tetramethylbenzidine) substrate and tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)	Thermo Scientific	PG82089
Tween-20	Bio-Rad laboratories	170-6531
Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit	Invitrogen	V12883