Verzögerte intramyokardiale Lieferung von Stammzellen nach Ischämie-Reperfusionsverletzung in einem Murine-Modell

Zusammenfassung

Stammzellen werden kontinuierlich als mögliche Behandlungen für Personen mit Myokardschäden untersucht, jedoch kann ihre verminderte Lebensfähigkeit und Retention im verletzten Gewebe ihre langfristige Wirksamkeit beeinträchtigen. In diesem Manuskript beschreiben wir eine alternative Methode zur Stammzellabgabe in einem murinen Modell der Ischämie-Reperfusionsverletzung.

Zusammenfassung

Es besteht ein erhebliches Interesse an der Verwendung von Stammzellen (SCs) zur Wiederherstellung der Herzfunktion bei Personen mit Myokardverletzungen. Am häufigsten wird die Herzstammzelltherapie untersucht, indem SCs gleichzeitig mit der Induktion von Myokardverletzungen geliefert werden. Dieser Ansatz weist jedoch zwei wesentliche Einschränkungen auf: Die frühe feindliche pro-inflammatorische ischämische Umgebung kann das Überleben transplantierter SCs beeinflussen, und er stellt nicht das subakute Infarktszenario dar, in dem SCs wahrscheinlich verwendet werden. Hier beschreiben wir eine zweiteilige Reihe von chirurgischen Verfahren zur Induktion von Ischämie-Reperfusionsverletzungen und zur Abgabe von mesenchymalen Stammzellen (MSCs). Diese Methode der Stammzellverabreichung kann für die längere Lebensfähigkeit und Retention um beschädigtes Gewebe ermöglichen, indem die anfängliche Immunantwort umgangen wird. Ein Modell der Ischämie-Reperfusionsverletzung wurde bei Mäusen induziert, begleitet von der Abgabe von mesenchymalen Stammzellen (3,0 x 10⁵), die das Reportergen Firefly Luciferase unter dem konstitutiv exprimierbaren CMV-Promotor, intramyokardiär 7 Tage später, stabil ausdrückten. Die Tiere wurden mittels Ultraschall und biolumineszierender Bildgebung zur Bestätigung von Verletzungen bzw. Injektion von Zellen abgebildet. Wichtig ist, dass bei der Durchführung dieses Zwei-Prozedur-Ansatzes für die SC-Bereitstellung keine zusätzliche Komplikationsrate vorhanden war. Diese Methode der Stammzellverabreichung, zusammen mit der Verwendung von hochmodernen Reportergenen, kann die In-vivo-Studie über die Lebensfähigkeit und Retention transplantierter SCs in einer Situation chronischer Ischämie ermöglichen, die häufig klinisch gesehen wird, und gleichzeitig die anfängliche pro-entzündliche Reaktion umgehen. Zusammenfassend haben wir ein Protokoll für die verzögerte Abgabe von Stammzellen in das Myokard erstellt, das als potenzieller neuer Ansatz zur Förderung der Regeneration des geschädigten Gewebes eingesetzt werden kann.

Einleitung

Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind nach wie vor die häufigste Ursache für Morbidität und Mortalität weltweit. Es wurde festgestellt, dass kardiale ischämische Ereignisse die Gesamtfunktion des Myokards und der umgebenden Zellen¹beeinträchtigen. Nur ̴0,45-1,0% der Kardiomyozyten regenerieren sich jedes Jahr nach Myokardschäden². Trotz der wachsenden Nachfrage und der inhärenten Fokussierung auf die Entwicklung von Behandlungen, Therapien zur Unterstützung bei der Regeneration von verletztem Gewebe waren schwierig zu etablieren und erfordern noch weitere Optimierung^3,4,5. Stammzelltherapien wurden als alternativer Weg eingeführt, um geschädigtes Gewebe nach einem ischämischen Ereignis zu verjüngen; die Weiterentwicklung dieser Therapien wurde jedoch durch das begrenzte Überleben und die Retention der Zellen in einen verletzten Bereich in Frage gestellt⁶.

Die Mikroumgebung des Herzens nach einem ischämischen Ereignis kann als hypoxisch, prooxidativ und pro-inflammator charakterisiert werden, was feindliche Bedingungen für therapeutische Stammzellen darstellt, um sich zum Überleben anzupassen^7,8. Als Immunantwort nach Verletzungen ausgelöst wird, versuchen naive Lymphozyten, Makrophagen, Neutrophilen und Mastzellen, den Schaden zu reparieren, indem sie sterbende Zellen entfernen und den Prozess für die Gewebeumgestaltung^{modulieren 9,10,11}. Innerhalb der ersten 3 Tage nach der Ischämie ist die Entzündung auf ihrem Höhepunkt mit der Freisetzung von pro-inflammatorischen Zytokinen mit einer hohen Anzahl von Neutrophilen und Monozyten im Bereich^10,12. Nach 7 Tagen hat ein Großteil der Entzündung nachgelassen und der Übergang zu reparativen Zellen beginnt und geht weiter, bis die Umgestaltungskaskade abgeschlossen ist, etwa 14 Tage bei Mäusen¹³. Unsere chirurgische Methode ist ein möglicher alternativer Ansatz für die Einführung von Biologika in das Myokard, um die angeborene Immunantwort nach einer Angeborenen-Reperfusionsverletzung zu umgehen. Gleichzeitig wird es für die Untersuchung von Behandlungen in einem Zustand der subakuten/chronischen Ischämie ermöglichen, bei der es verschiedene Variablen im Vergleich zu akutem Myokardinfarkt zu berücksichtigen gibt.

Protokoll

Die Experimente wurden an weiblichen C57BL/6-Mäusen im Alter von 10-12 Wochen und 20-25 g Körpergewicht durchgeführt. Alle tierischen Verfahren entsprachen den Standards des Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Institute of Laboratory Animal Resources, National Academy of Sciences, Bethesda, MD, USA) und wurden vom Mayo Clinic College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt.

1. Vorbereitung und Intubation

1. Autoklaven Sie alle chirurgischen Instrumente vor der Operation. Wenn mehrere Operationen in einer Sitzung durchgeführt werden sollen, reinigen Sie die Instrumente nach jedem Tier und sterilisieren Sie sie mit einem heißen Perlensterilisator.
2. Anästhetisieren Sie die Mäuse mit 3,5-4% Isofluran bei 1 L/min_O2 in einer Induktionskammer.
3. Buprenorphin SR 1 mg/kg (analgetisch) subkutan verabreichen, das Tier wiegen und das Gewicht in das Beatmungsgerät eintragen.
4. Rasieren Sie die linke Seite der Brust vom Brustbein auf das Niveau der Schulter und wenden Sie Enthaarungscreme an, um überschüssiges Fell zu entfernen.
5. Für das Ischämie-Reperfusionsverfahren den positiven Endexiratoriumsdruck (PEEP) auf dem Beatmungsgerät bei 2_cmH2O. Für die verzögerte Injektion von Zellen Verfahren ändern Sie das PEEP auf 3_cmH2O Lungenkollaps zu verhindern.
6. Intubieren Sie das Tier mit einem 20 G Endotrachealrohr, übertragen Sie es auf ein kontrolliertes Heizkissen, um eine Körpertemperatur von 35-37 °C zu halten.
7. Legen Sie die Maus auf ein Beatmungsgerät in seitlicher Recumbency mit Schädelende auf der linken seite und kaudalen Ende auf der rechten Seite.
8. Halten Sie die Anästhesie bei 2-2,5% Isofluran bei 1 L/min_O2 für den Rest des Verfahrens aufrecht.
9. Schrubben Sie den chirurgischen Bereich abwechselnd zwischen Povidon-Jod und Alkoholtupfer dreimal und wenden Sie ophthalmologische Salbe auf beide Augen an.

2. Ischemia-Reperfusionsverletzung

1. Mit einem #10 Klingenskalpell machen einen vertikalen Schnitt 2,5 mm rechts von der linken Nippel im Sichtfeld.
2. Mit einer Schere durchschneiden Sie die oberflächlichen Muskelschichten, bis die interkostalen Muskeln und Rippen sichtbar sind.
3. Beim Heben der Rippen und des umgebenden Gewebes durchschneiden Sie den interkostalen Raum zwischen der 4. und 5. Rippe, und legen Sie dann den Augenlid-Retraktor in den offenen Raum ein.
4. Ziehen Sie das Perikard mit gekrümmten Zangen zurück, bewegen Sie die Lunge nach oben und aus dem Blickfeld.
5. Visualisieren Sie die Arterie LAD und gehen Sie mit einer 9-0 Nylon-Naht durch das Myokard unter der Arterie 2,5 mm distal zur linken Ohrmuschel und binden Sie einen lockeren quadratischen Knoten.
6. 1 cm Polyethylenschläuche schneiden und in den losen Knoten legen.
7. Sichern Sie die Naht um den Schlauch, bestätigen Ischämie, dann nach 35 min loslassen.
   HINWEIS: Bestätigen Sie Ischämie durch Pallor und ventrikuläre Arrhythmie.
8. Nach dem Lösen der Ligation und dem Entfernen der Schläuche, warten Sie 5 min, um die Reperfusion des Myokards zu bestätigen.
9. Legen Sie ein 24 G I.V. Katheterrohr in die Brusthöhle einen interkostalen Raum rechts von der Öffnung.
10. Schließen Sie den interkostalen Schnitt mit einer 6-0 resorbierbaren Naht in einem einfachen unterbrochenen Muster.
11. Schließen Sie die Muskelschicht mit einer 6-0 resorbierbaren Naht in einem kontinuierlichen Nahtmuster.
12. Nach dem Schließen der oberflächlichen Muskelschicht, entfernen Sie das Brustrohr, während Sie die Luft aus der Brusthöhle mit einer 1 ml Tuberkulinspritze zurückziehen.
13. Schließen Sie den Hautschnitt mit einer 6-0 resorbierbaren Naht in einem kontinuierlichen horizontalen Matratzenmuster
    HINWEIS: Nylonnähte und ein diskontinuierliches Nahtmuster können auch für die Hautschicht verwendet werden.
14. 1,5 ml warme Salin subkutan verabreichen und dreifach antibiotische Salbe auf die Einschnittstelle auftragen, um eine Infektion zu verhindern.
15. Isofluran ausschalten und das Tier auf 100%_O2 durch das Beatmungsgerät atmen lassen, bis es ohne Hilfe kontinuierlich atmen kann.
16. Übertragen Sie die Maus in einen bettläktfreien Käfig oder einen Käfig mit überdachtem Bett (Papiertuch oder Drap) auf einem warmen Pad mit einer Temperatur von 35-37 °C, bis sie vollständig wiederhergestellt ist.

3. Maus mesenchymale Stammzelllieferung

HINWEIS: Der Für das Verfahren verwendete Mäusestamm ist eine Inzuchtlinie und gilt als genetisch identisch. Die mesenchymalen Stammzellen wurden von Tieren desselben Stammes gewonnen, und durch Protokolldesign wurde die Immunsuppression nicht induziert¹.

1. Führen Sie die Vorbereitungs- und Intubationsschritte wie zuvor für das erste Verfahren aus.
2. Entfernen Sie die Naht aus der Hautschicht mit Schere und Zange.
3. Mit einem #10 Skalpell, machen Einen Schnitt an der gleichen Stelle wie die vorherige Operation.
4. Verwenden Sie weiterhin das Skalpell, um Narbengewebe zu durchschneiden, bis Muskelschicht Naht sichtbar ist
5. Mit der Schere und Zange entfernen Sie die Naht und schneiden Sie die Muskelschicht auf.
6. Visualisieren und entfernen Sie die Nähte, die die Rippen zusammenhalten, und schneiden Sie den Interkostalmuskel aus dem vorherigen Schnitt weiter.
   HINWEIS: Die Lunge kann an der Brustwand haften haben, wenn dies geschieht, verwenden Sie stumpfe oder gekrümmte Zangen, um sie sorgfältig zu trennen und loszulassen.
7. Legen Sie den Augenlid-Retraktor in den interkostalen Raum und lokalisieren Sie den Bereich der vorherigen Ligation.
8. Laden Sie die mesenchymalen Stammzellen (3,0 x 10⁵), die in 20 L PBS aufgehängt sind, in eine 30 G Insulinspritze, biegen Sie die Nadel bei Bedarf leicht, damit der richtige Winkel injiziert werden kann.
   HINWEIS: Mesenchymale Stammzellen (MSCs) wurden aus dem Fettgewebe von 4-6 Wochen alten C56BL/6-Mäusen isoliert. Frühe Durchgangszellen (p3) wurden mit einem Vektor transduziert, der das Galleifferase-Gen unter dem CMV-Promotor ausdrückte, um eine In-vivo-Zelllebensfähigkeitsüberwachung zu ermöglichen. Adipose-abgeleitete Maus MSC waren durch Durchflusszytometrie gekennzeichnet und die Zellen waren positiv für CD44, CD29, CD90 und CD105, aber negativ für den hämatopoetischen Marker CD45¹⁴. Vor der Injektion wurden MSCs für mindestens einen Durchgang kultiviert, um den Verlust von Zellen durch den Auftauprozess zu vermeiden.
9. Bewegen Sie sich in Richtung von der Spitze in Richtung der Basis des Herzens setzen Sie die Spritze in den Peri-Infarkt-Bereich, bis die Nadelöffnung vollständig innerhalb des Myokards ist.
10. Sobald im Inneren langsam injizieren die Zellen in das Myokard, warten Sie 3 s, dann entfernen Sie die Nadel.
11. Beobachten Sie das Herz 3 min lang genau, um sicherzustellen, dass keine abnormalen Reaktionen auf die Zellen wie Kammerflimmern auftreten.
12. Legen Sie ein 24 G IV Katheterrohr in die Brusthöhle einen interkostalen Raum rechts von der Öffnung.
13. Schließen Sie die Interkostal-, Muskel- und Hautschichten und entfernen Sie das Brustrohr nach der gleichen Methode wie das erste Verfahren.
14. 1,5 ml warme Salin subkutan verabreichen und dreifach antibiotische Salbe auf die Einschnittstelle auftragen, um eine Infektion zu verhindern.
15. Isofluran ausschalten und das Tier durch das Beatmungsgerät auf 100%_O2 atmen lassen, bis es ohne Hilfe kontinuierlich atmen kann.
16. Übertragen Sie die Maus in einen bettläktfreien Käfig oder einen Käfig mit überdachtem Bett (Papiertuch oder Drap) auf einem warmen Pad mit einer Temperatur von 35-37 °C, bis sie vollständig wiederhergestellt ist.

4. Postoperative Pflege nach beiden Verfahren

1. Beobachten Sie das Tier kontinuierlich, bis spontane Atmung, Brustbekehr und normale Bewegung etabliert ist.
2. Weiter Beobachtung alle 15-30 min für mindestens 3 h am Tag der Operation.
3. Überprüfen Sie die Mäuse auf Wunddehiszenz oder abnorme Schmerzen einmal täglich für 5 Tage, dann 2-3 mal wöchentlich.
4. Wenn das Tier nach 72 h nach der Op Anzeichen von Schmerzen (d.h. gewölbter Rücken, minimale Bewegung, Grimassen oder schroffes Fell) zeigt, stellen Sie eine zusätzliche Dosis des Buprenorphin SR-Analgetikums zur Verfügung.

Ergebnisse

Die Ischemia-Reperfusionsverletzung wurde bei Mäusen am 0. Tag induziert, gefolgt von einem postoperativen Echokardiogramm und Elektrokardiogramm am Tag vor der Stammzellimplantation. Ultraschall- und Elektrokardiogrammanalyse bestätigt infarktundund verringerte ventrikuläre Kontraktilfunktion (Abbildung 1A-D). Eine weitere Untersuchung der Daten zeigte, dass die Auswurffraktion und die fraktionale Verkürzung bei Mäusen, die ischämische Verletzungen erhielten, verringe...

Diskussion

Über 85 Millionen Menschen weltweit sind von Herz-Kreislauf-Erkrankungen betroffen³. Die hohe Prävalenz dieser ischämischen Ereignisse rechtfertigt die Weiterentwicklung und Erweiterung alternativer Therapien zur Förderung der Regeneration von geschädigtem Gewebe. Traditionelle Methoden nutzen das Ischämie-Reperfusionsverfahren in einer akuten Umgebung mit anschließender Verabreichung von Therapeutika¹. Entzündungsreaktionen sind auf ihrem Höhepunkt zwischen 3-4 Ta...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% NaCl Irrigation, USP	Baxter	0338-0048-04
11x12" Press n' Seal surgical drape, autoclavable	SAI Infusion Technologies	PSS-SD
24G 3/4" IV catheter tube	Jelco	4053
28G x 1/2" 1mL allergy syringe	BD	305500	Injection of analgesic
30G x 1/2" 3/10cc insulin syringe	Ulticare	08222.0933.56	Injection of stem cells
6-0 S-29, 12" Vicryl suture	Ethicon	J556G	Intercostal, superficial muscle and skin layer incision closure
9-0 BV100-4, 5" Ethilon suture	Ethicon	2829G	Ligation of the LAD artery
Absorbent underpad	Thermo Fischer Scientific	14-206-64	For underneath the animal
Alcohol prep pads, 2 ply, medium	Coviden	6818
Anti-fog face mask	Halyard	49235
Bonn Strabismus scissors, curved, blunt	Fine Science Tools	14085-09
Buprenorphine HCL SR LAB 1mg/ml, 5 ml	ZooPharm Pharmacy		Buprenorphine narcotic analgesic formulated in a polymer that slows absorption extending duration of action (72 hours duration of activity).
Castroviejo needle holders, curved	Fine Science Tools	12061-01
Curity sterile gauze sponges	Coviden	397310
Delicate suture tying forceps, 45 angle bent	Fine Science Tools	11063-07
Electric Razor	Wahl		Fur removal
Isoflurane 100 ml	Cardinal Health	PI23238	Anesthetic
Lab coat
Monoject 1 mL hypodermic syringe	Coviden	8881501400
Moria iris forceps, curved, serrated (x2)	Fine Science Tools	11370-31
Moria speculum retractor	Fine Science Tools	17370-53
Mouse endotracheal intubation kit	Kent Scientific
Nair depilatory cream	Johnson & Johnson		Fur removal
Optixcare eye lube plus	Aventix		Sterile ocular lubricant
Physiosuite ventilator	Kent Scientific
PolyE Polyethylene tubing	Harvard Apparatus	72-0191	Temporary compression of LAD artery
Povidone-iodine swabs	PDI	S41125
Scalpel, 10-blade	Bard-Parker	371610
Sterile 3" cotton tipped applicators	Cardinal Health	C15055-003
Sterile 6" tapered cotton tip applicators	Puritan	25-826-5WC
Sterile gloves	Cardinal Health	N8830
Sterilization pouches	Medline	MPP100525GS
Surgery cap
Surgical Microscope	Leica	M125
Suture tying forceps, straight (x2)	Fine Science Tools	10825-10
Transpore surgical tape	3M	1527-1
Triple antibiotic ointment	G&W Laboratories	11-2683ILNC2	Topical application to prevent infection
Vannas-Tübingen Spring Scissors, curved	Fine Science Tools	15004-08
Vetflo vaporizer	Kent Scientific