Dry Root Rot Disease Assays in Chickpea: eine detaillierte Methodik

Zusammenfassung

Diese Studie stellt Methoden zur Untersuchung der pathomorphologischen und molekularen Mechanismen vor, die der Kichererbsen–Rhizoctonia-Bataticola-Interaktion zugrunde liegen. Die Blotting-Papier-Methode ist nützlich, um Kichererbsen-Genotyp-Antworten schnell zu studieren, während die kranke Topf-basierte Methode verwendet werden kann, um gleichzeitig Dürre und R. Bataticola-Infektion und Bildschirm für tolerante Genotypen aufzuerlegen.

Zusammenfassung

Die Trockenwurzelfäule (DRR)-Krankheit ist eine sich abzeichnende biotische Stressgefahr für den Kichererbsenanbau auf der ganzen Welt. Es wird durch einen bodengestützten Pilzerreger, Rhizoctonia bataticolaverursacht. In der Literatur sind umfassende und detaillierte Schritt-für-Schritt-Protokolle zu Krankheitsassays spärlich. Dieser Artikel enthält vollständige Details zu den Schritten bei der Einrichtung einer Blotting-Papiertechnik zum schnellen Screening von Genotypen auf DRR-Resistenz. Die Blotting-Papiertechnik ist einfach und kostengünstiger. Eine andere Methode, die auf dem Krankentopfansatz basiert, ist eine Mimik natürlicher Infektion und kann angewendet werden, um die interagierenden Komponenten – Pflanze, Krankheitserreger und Umwelt – zu untersuchen, die am Krankheitsdreieck beteiligt sind.

Darüber hinaus kommt DRR in der Natur vor allem in regengespeisten Kichererbsenanbaugebieten vor, wo die Bodenfeuchtigkeit mit fortschreitendem Pflanzenwachstum abgeht. Dürrestress ist dafür bekannt, Kichererbsenpflanzen für DIE DRR-Krankheit prädisponieren. Das pathomorphologische und molekulare Verständnis der Pflanzen-Pathogen-Interaktion unter Dürrestress kann den Weg für die Identifizierung von ELITE-DRR-resistenten Sorten aus dem Kichererbsen-Keimplasmapool ebnen. Dieser Artikel enthält eine schrittweise Methodik für die Vorbereitung eines Krankentopfs und den anschließenden Krankheitstest. Insgesamt werden die hier vorgestellten Informationen den Forschern helfen, R. bataticola pilzinoculum vorzubereiten, diesen Erreger zu erhalten, die Blotting-Papier-Technik einzurichten, Krankenkultur und Krankentopf vorzubereiten und Krankheitserreger-Infektionen in Kichererbsenpflanzen zu bewerten.

Einleitung

Trockenwurzelfäule (DRR) ist eine der wirtschaftlich signifikanten Krankheiten bei Kichererbsen^1,2. Es ist eine wurzelspezifische Krankheit, die durch Rhizoctonia bataticola (Teleomorph, Macrophomina phaseolina)verursacht wird. Infizierte Pflanzen haben seitliche Wurzeln und besitzen spröde Taproots und gelbes Laub^1,3. DRR unter Dürrestress wurde berichtet, eine aufkommende Bedrohung für kichererbsenanbau^1,2,3. Darüber hinaus wird berichtet, dass die DRR-Inzidenz unter Dürrestress unter Feldbedingungen^1,2,3verschlimmert wird. DRR ist in Regengebieten häufiger als in bewässerten Feldern⁴. Die Verwendung resistenter Sorten ist der Weg, um die Krankheit zu überwinden und Fungizid-Einsatz zu umgehen^1,13. Da Kichererbsen-Keimplasma, das auf der ganzen Welt verfügbar ist, genetische Variationen für das Merkmal⁵aufweist, sind das Screening und die Identifizierung resistenter/anfälliger Genotypen für die molekulare Züchtung für die Verbesserung der Ernte von entscheidender Bedeutung.

Robuste, einfache und kostengünstige Krankheitstests sind unerlässlich, um R. bataticola Infektionsmuster in Kichererbsen zu untersuchen. Die primäre Krankheit Assay verwendet, um die Reaktion von Kichererbsen-Genotypen auf R. Bataticola-Infektion zu beobachten ist die Blotting-Papier-Technik^1,4. Es ist eine einfache Technik und kann mit flüssigem Pilzinokulum, Sämlingen mit Wurzeln und sterilem Blotting-Papier ausgeführt werden. Diese Technik wurde jedoch nicht maximal verwendet, da in der Literatur kein Step-by-Step-Protokoll verfügbar ist.

In der Zwischenzeit beinhaltet die Kranke Topftechnik die Vorbereitung einer potentiellen Krankenkultur und die Auferlegung von Dürrestress. Angesichts der Tatsache, dass Dürrestress die Inzidenz^derDRR-Krankheit 3 verschlimmert, ist es wichtig, die Pflanzen-Pathogen-Wechselwirkung unter Dürrestress zu untersuchen^6,7. Die Sick-Topf-Technik bietet die Plattform für eine solche simultane Studie, fördert bessere Möglichkeiten für das Keimplasma-Screening und das Verständnis der mechanistischen Basis der Interaktion. Pathomorphologische Veränderungen wie eine Erhöhung der Wurzellänge und eine Verringerung der lateralen Wurzelzahl – inhärent für DIE DRR-Krankheit – können mit der Krankentopftechnik^1,3,7angegangen werden.

Hierin wird ein detailliertes Protokoll zum Blotting von Papier und Krankentopftechniken vorgestellt, mit dem die Wechselwirkung zwischen Kichererbsen und R. Bataticola und Screen-Kichererbsen-Keimplasma untersucht werden kann. Die Einzelheiten der in der Studie verwendeten Materialien sind in der Tabelle der Materialienangegeben.

Protokoll

1. Isolierung von R. bataticola und Lagerung

1. Details zum Kichererbsengenotyp und DRR-Symptomen
   1. Verwenden Sie Kichererbsenpflanzen (Genotyp, JG 62), die in der Regel typische DRR-Symptome zeigen, wie trockene, spröde Primärwurzel ohne laterale Wurzeln und Mikrosklerotie unter der Rinde und innerhalb der Pith^1,3.
2. Abholung und Waschen
   1. Entwurzelung stagnieren Pflanzen, die Symptome wie trockene strohfarbene Blattblätter und spröde Primärwurzel mit Mikrosklerotie unter der Epidermisschicht zeigen. Während der Entwurzelung wird ein großteil der Wurzeln im Boden bleiben, da die infizierten Wurzeln spröde sind. Entfernen Sie die groben Bodenablagerungen, die an der Wurzel befestigt sind. Schneiden Sie die Wurzeln separat und sammeln Sie sie in Papierumschlägen (27,5 cm x 12 cm) mit dem richtigen Etikett und legen Sie sie in eine Probensammelbox.
   2. Nach dem Transport von Proben ins Labor, legen Sie die Wurzeln in einem 200 ml Becher und Decken mit Mesh (Nylon-Mesh mit der Porengröße von 3 mm Durchmesser), und waschen Sie die Wurzeln gründlich mit fließendem Leitungswasser, um ankende Bodenpartikel zu entfernen.
   3. Verwenden Sie Umkehrosmose (RO) Wasser, um einmal am Ende zu spülen.
3. Oberflächensterilisation
   1. Die Wurzeln mit jeweils 2 cm Länge mit einer Skalpellklinge in vier Stücke brechen und in einen sauberen 200 ml Becher geben.
   2. Montieren Sie autoklaviertes RO-Wasser, 2% NaOCl, Auswurfglas und autoklaviertes Blottingpapier (5 cm²) in der laminaren Durchflusskammer.
   3. Waschen Sie die Wurzeln mit 50 ml autoklaviertem RO-Wasser dreimal und dann mit 50 ml von 2% NaOCl für 10 min. Waschen Sie die Wurzeln mit 50 ml RO-Wasser dreimal wieder, um den NaOCl zu entfernen.
   4. Trocknen Sie die Wurzeln, indem Sie die Wurzeln auf autoklaviertes Blottingpapier legen und lassen Sie, bis die Wurzeln getrocknet sind.
4. Medien und Inkubation
   1. Entfernen Sie die Ränder der Wurzeln mit einer sterilisierten Skalpellklinge. Teilen Sie die Wurzeln mit der Klinge und verwenden Sie die sterilisierten Zangen, um sie auf einer Kartoffel dextrose Agar (PDA) Medien Petriplatte mit Streptomycinsulfat (50 mg L^-1) und Ampicillin (50 mg L^-1) zu platzieren.
   2. Schließen Sie die Platte, versiegeln Sie sie mit Parafilm und brüten Sie in einem Inkubator bei 28 °C für zwei Tage im Dunkeln.
5. Hyphal-Tipp-Methode
   1. Nach zwei Tagen Inkubation die Platten in die laminare Strömungskammer bringen. Schneiden Sie die Spitze des Hyphalwachstums⁸ unter einem Stereomikroskop (Leica EZ4 pädagogisches Stereomikroskop) und übertragen Sie sie in eine frische PDA-Platte mit Streptomycinsulfat und Ampicillin.
   2. Die Platten im Inkubator bei 28 °C zehn Tage lang im Dunkeln bebrüten.
6. Lagerung und Wartung von R. bataticola pilzinoculum
   1. Machen Sie PDA-Schräglagen in Reagenzgläsern und übertragen Sie einen Pilzagar-Stecker von einer zehn Tage alten Kulturplatte mit der flammsterilisierten Impfschleife. Versiegeln Sie die Reagenzglaskappe mit Parafilm.
   2. Die Schrägen bei 28 °C zehn Tage lang im Dunkeln inkubieren.
   3. Versiegeln Sie die Kappe erneut mit Parafilm und lagern Sie sie bei 4 °C im Kühlschrank für die zukünftige Verwendung.
   4. Subkultur alle sechs Monate, um den Pilz zu erhalten.
7. Aufrechterhaltung der Virulenz
   1. Infizieren Sie die Pflanzen mit reinem Pilzinokulum, wie in der^{Krankentopftechnik}3 erwähnt. Isolieren Sie den gleichen Pilz von den infizierten Pflanzen (Kochs Postulate)⁹ und verwenden Sie für weitere Experimente.
      HINWEIS: In dieser Studie wurde ein feldisolierter Pilzstamm verwendet (GenBank: MH509971.1 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MH509971)

2. Blotting Papiertechnik

HINWEIS: Die Blotting-Papier-Technik beinhaltet die Herstellung von flüssigem Pilzinokulum, Sämlingsvorbereitung und Krankheitsbeurteilung.

1. Zubereitung von flüssigem R. bataticola inoculum
   HINWEIS: Flüssiges R. bataticola Pilzinokulum enthält sowohl Mycelia als auch Mikrosklerotie. Beide Strukturen fungieren als primäres Inokulum.
   1. Bereiten Sie 500 ml PDB-Medien in einem 1.000 ml Kolben vor und autoklavieren Sie es bei 121 lbs für 15 min.
   2. Nachdem die Medien abgekühlt sind, impfen Sie die Brühe mit einer Schleife von Pilz-Agar-Stecker aus einer Pilzschrägenkultur und bebrüten bei 28 °C für fünf Tage in einem Shaker bei 180 U/min im Dunkeln.
   3. Montieren Sie einen autoklavierten Glas- oder Kunststofftrichter (10 cm), einen Einliter-Konuskolben und zwei Gewebeschichten (10 cm² Größe) (Nylon-Mesh mit einer Porengröße von 3 mm Durchmesser) auf den Tisch. Filtern Sie die Pilzmycelia und Mikrosklerotie mit dem Netz heraus. Den Pilz in autoklaviertem Blottingpapier trocknen.
   4. 100 g Mycelia für 50% Inokulum wiegen und bei Raumtemperatur aufbewahren.
2. Zubereitung von Kichererbsenpflanzen
   1. Wählen Sie 50 gesunde Samen (in dieser Studie wurde der DRR-anfällige Genotyp JG 62 verwendet), legen Sie sie in einen 100 ml Becher und decken Sie sie mit einem Netz ab.
   2. Waschen Sie die Samen zuerst mit Leitungswasser, um Bodenschrott zu entfernen.
   3. Nehmen Sie den Becher mit Samen in die laminare Durchflusskammer und waschen Sie sie mit sterilisierten 50 ml RO-Wasser dreimal für 1 min pro Wäsche.
   4. Sterilisieren Sie die Samen mit 50 ml von 2% wässrigen NaOCl für 2 min mit kontinuierlichem Schütteln und waschen Sie die Samen mit 50 ml sterilisiertem Wasser fünfmal für jeweils 1 min.
   5. Füllen Sie einen Polythenbeutel (47,5 cm x 25 cm) mit Soilrite (eine Mischung aus Gartenbauqualität expandierter Perlit, Irisches Torfmoos und Peeling-Vermiculit im gleichen Verhältnis, d.h. 1/3:1/3:1/3), säen die oberflächensterilisierten 50 Samen zwei cm tief und halten in einer Wachstumskammer/Raum mit 28 °C ± 2 °C Temperatur, 16 h Photoperiode mit einer Lichtintensität von 150^€mol m m und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 70 % . Gießen Sie sie mit RO-Wasser und entwurzeln Sie die Pflanzen acht Tage nach der Aussaat.
   6. Waschen Sie die Wurzeln im Leitungswasser, um die Soilrite-Partikel zu entfernen. Spülen Sie die Wurzeln mit sterilisiertem RO-Wasser und halten Sie sie im RO-Wasser in einem 1000 ml Becher.
3. Herstellung von Blottingpapier in Schalen
   1. Nehmen Sie ein Blotting-Papier und schneiden Sie es in Stücke (30 cm × 23 cm) in ausreichender Anzahl, um die Replikationen zu erfüllen.
   2. Verpacken Sie die Blätter in autoklavierbaren Polythenbeutel und autoklavieren Sie sie 15 Minuten lang bei 121 lbs und bewahren Sie sie zum Trocknen in einem Heißluftofen auf.
   3. Falten Sie jedes Blotting-Papierblatt in der Hälfte.
   4. Legen Sie das Papier auf eine saubere, mit Spirituosen gewischte Kunststoffschale, wie in Abbildung 2i-ivdargestellt.
4. Pflanzenimpfung durch Tauchen
   1. Lösen Sie 100 g Pilzinokulum in 200 ml autoklaviertem RO-Wasser in einem 200 ml Becher, um 50% Inokulum zu erhalten.
   2. Tauchen Sie die Pflanzenwurzeln in das vorbereitete Inokulum für 1 min mit intermittierender Auf-und-Ab-Bewegung, um eine gleichmäßige Befestigung von Pilzinokulum zu gewährleisten.
5. Platzieren der Pflanzen in das Fleckpapier
   1. Befeuchten Sie die Unterseite des auf das Tablett gelegten Blotpapiers mit sterilem RO-Wasser. Legen Sie die Pflanzen auf das Papier in einer Weise, wo nur die Wurzeln durch das Papier bedeckt sind, und Triebe werden weggelassen.
   2. Schließen Sie es, indem Sie die Oberseite des Blotting-Papiers falten und das gesamte Papier nass machen, um genügend Wasser zu liefern, um das Pflanzenwachstum aufrechtzuerhalten.
   3. Gießen Sie das Tablett einmal täglich und halten Sie die Schalen bei 28 °C. Beobachten Sie die Symptome wie Nekrose, Wurzelfäule und Blattvergilbung täglich.

3. Kranke TopfTechnik

HINWEIS: Die Kranke TopfTechnik beinhaltet die Herstellung von virulenten Inokulum und einem kranken Topf, die Aufrechterhaltung des Feuchtigkeitsniveaus und die Bewertung von Krankheitssymptomen.

1. Herstellung von Substrat
   1. Nehmen Sie ein kg aller handelsüblichen Kichererbsensamen. Entfernen Sie infizierte Samen (Samen mit Pilzwachstum, Infektionsflecken und Insektenschäden). Legen Sie sie in 5 L KunststoffBecher und waschen Sie mit Leitungswasser gründlich 3-4 Mal, um große Schmutz zu entfernen.
   2. Waschen Sie die Samen mit 2 L RO-Wasser dreimal und tränken Sie die 1 kg Samen in einem 5 L Becher mit dreifach mehr Wasser für fünf h.
   3. Sobald die Samen das Wasser imprägniert haben, waschen Sie sie dreimal mit RO-Wasser, um die Samenexsudate zu entfernen.
   4. Entfernen Sie das Wasser vollständig und verpacken Sie die Samen in Marmeladenflaschen (300 ml, 12 cm Höhe, 6 cm Durchmesser und 155 g Gewicht) auf ca. 1/4^Th Kapazität (100 g pro Marmeladenflasche) und schließen Sie die Flaschen mit Kappen. Packen Sie zehn Marmeladenflaschen in eine autoklavierbare Plastiktüte (48 cm x 30 cm) Autoklav zweimal bei 121 lbs für 15 min kontinuierlich.
   5. Trocknen Sie die Samen bei 40 °C über Nacht im Ofen, um die Wassertröpfchen in der Flasche zu entfernen.
2. Vorbereitung der Krankenkultur
   1. Schalten Sie die Laminar-Durchflusskammer BSL-2 ein. Wischen Sie den Boden gründlich mit 70% Ethanol ab und schalten Sie UV für 15 min ein. Bewahren Sie dann die Samen in der laminaren Strömungskammer auf.
   2. Nehmen Sie die 10 Tage alte, frisch isolierte R. bataticola Kultur (Teil 1). Dann nehmen Sie drei Pilz-Agar-Stecker (4 mm Durchmesser) mit einer sterilen Pipettenspitze oder Korkbohrer, und legen Sie sie in Marmeladenflaschen aseptisch. Bedecken Sie die Flaschen mit Kappen und versiegeln Sie sie mit Parafilm.
   3. Schütteln Sie die Flaschen, um die Pilzscheibe mit den Kichererbsensamen gleichmäßig zu mischen.
   4. Die Flaschen 15 Tage lang bei 30 °C im Dunkeln bebrüten.
   5. Nehmen Sie Marmeladenflaschen mit schwarzem Pilzwachstum (Abbildung 4iii) und übertragen Sie die Krankenkultur (Samen mit Mikrosklerotie) von Marmeladenflaschen auf eine glasierte Petriplatte mit steriler Zange. Trocknen Sie sie bei Raumtemperatur für zwei Tage in einer Glas-Petri-Platte.
   6. Die Pilzmasse mit Mörtel und Stößel pulverisieren und bei 4 °C lagern.
   7. Autoklav Soilrite zweimal bei 121 lbs für 15 min.
   8. Trocknen Sie die autoklavierte Soilrite-Mischung unter einem Sonnenschirm.
   9. Mischen Sie das Pilzpulver mit Soilrite bei 50% w/w, füllen Sie die Töpfe mit der Mischung, und halten Sie sie bei Raumtemperatur für einen Tag.
   10. Säen Sie ein oberflächensterilisiertes DRR-anfälliges Kichererbsensaatgut pro Topf (10 cm runde Töpfe)(Materialtabelle)und halten Sie einen Feuchtigkeitsgehalt von 80% Feldkapazität (FC).
   11. Beobachten Sie die Symptome wie Nekrose und Wurzelfäule, indem Sie die Pflanzen nach der Keimung entwurzeln.
3. Bewertung der Effizienz des Krankentopfs
   HINWEIS: Pflanzen zeigen gelbe Blattsymptome, wenn die Wurzeln vollständig verrottet sind.
   1. Entwickeln Sie einen Krankheitsscore basierend auf der Läsion (nekrotische Flecken) (Ergänzende Abbildung 2C) Zahlen und Schweregrad der Wurzelfäule. Kranke Töpfe mit 90% Pflanzentod können weiter verwendet werden.
4. Genotyp-Screening
   1. Bereiten Sie die Krankenkultur in großen Mengen vor und mischen Sie sie entweder mit sterilisiertem Soilrit oder Felderde (5% w/w) in 30 cm hohen Töpfen. Gießen Sie die Töpfe, um die Oberfläche zu befeuchten und lassen Sie sie für sieben Tage ungestört.
   2. Säen Sie einen oberflächensterilisierten Samen pro 10 cm rundem Topf und drei Samen pro 30 cm runde Töpfe und gießen Sie sie ausreichend.
   3. Beobachten Sie die gelben Blatt- und Wurzelfäule-Symptome.
5. Kombinierte Dürre und R. bataticola Infektion
   1. Beungung von Dürrestress durch Befolgung der in Sinha et al. (2019) erwähnten Protokolle.

Ergebnisse

Diese Studie zielte darauf ab, Techniken wie das Bloten von Papier und Kranke Topftechniken zu demonstrieren, um das pathomorphologische und molekulare Verständnis der Pflanzen-Pathogen-Interaktion unter Dürrestress zu erleichtern. Um dies zu erreichen, wurden Pflanzen mit DRR-Symptomen^1,3,4 aus einem Kichererbsenfeld gesammelt, und der Pilz wurde mit der Hyphal-Spitzenmethode⁸isoliert. R. bataticol...

Diskussion

Die Blotting-Papier-Technik bietet einen einfachen Ansatz, um Kichererbsen-Genotypen unter Laborbedingungen zu untersuchen. Die Dip-Impfung ermöglicht die untersuchung der Wechselwirkung auf zeitlicher Basis mit einfacher Kontrolle der Inokulumbelastung (Zusatzabbildung 1) und erleichtert das In-vitro-Screening. Darüber hinaus können auch junge Sämlinge verwendet werden. Fünf Tage alte Pilzkultur (Abbildung 1B) kann genug Inokulum liefern, um die Pflanzen zu infizieren....

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fungus- Rhizoctonia bataticola	Pathogen inoculum	Indian Type Culture Collection No. 8365	GenBank: MH509971.1, ITCC 8635 (https://www.iari.res.in/index.php?option=com_content&view=article& id=1251&Itemid=1370)
Soilrite mix	Soil medium in the lab	Keltech Energies Limited, Bangalore, India	http://www.keltechenergies.com/
Filter paper	Blotting paper to support the plant growth	Himedia	http://himedialabs.com/catalogue/chemical2017/index.html#374
Pot	Growing plants	10 and 30 cm size pots	Routinely used nursery pots, for example, https://dir.indiamart.com/impcat/nursery-pots.html
Potato dextrose agar/broth	Culture and maintain the fungus	Cat# 213400, DifcoTM, MD, USA	https://www.fishersci.com/shop/products/bd-difco-dehydrated-culture-media-potato-dextrose-agar-3/p-4901946
Incubator	Culture the fungus	LOM-150-2, S/N AI13082601-38, MRC, incubator, and shaker	http://www.mrclab.com/productDetails.aspx?pid=91131
Growth chamber	Growing plants in controlled condition	Model No. A1000, Conviron, Canada	https://www.conviron.com/products/gen1000-reach-in-plant-growth-chamber
Laminar airflow	Carrying out aseptic exercises	Telstar, Bio II advance, Class II cabinet, EN-12469-2000	https://www.telstar.com/lab-hospitals-equipment/biological-safety-cabinets/bio-ii-advance-plus/, http://www.atlantisindia.co.in/laminar-air-flow.html
Mesh	Filtering the fungal mycelia	Nylon mosquito net	Mesh with 0.6-1 mm diameter pore size
Autoclave	Autoclaving media and chickpea seeds	Autoclave	http://www.scientificsystems.in/autoclave
Microscopes	Visualizing the infection ang fungal mycelia	SMZ25 / SMZ18, Research Stereomicroscopes, Leica EZ4 educational stereomicroscope	https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18 https://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/p/leica-ez4/ https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-80i
Weighing balance	Weighing fungus and chemicals	Sartorius Electronic Weighing Balance, BSA 4202S-CW	https://www.sartorius.com/en/products/weighing/laboratory-balances
WGA-FITC	Fungus staining	Sigma	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l4895?lang=en&region=IN
Aniline blue	Fungus staining	Himedia	http://www.himedialabs.com/intl/en/products/Chemicals/Dyes-Indicators-and-Stains/Aniline-blue-Water-soluble-Practical-grade-GRM901