Erzeugung dynamischer Umgebungsbedingungen mit einem hochdurchsatzstarken mikrofluidischen Gerät

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein mikrofluidisches System für Hochdurchsatzstudien an komplexen Lebensmaschinen, das aus 1500 Kultureinheiten, einer Reihe verbesserter Peristaltikpumpen und einem Mischmodul vor Ort besteht. Der mikrofluidische Chip ermöglicht die Analyse der hochkomplexen und dynamischen Mikro-Umgebungsbedingungen in vivo.

Zusammenfassung

Die Nachahmung von in vivo-Umweltbedingungen ist entscheidend für In-vitro-Studien an komplexen Lebensmaschinen. Aktuelle Techniken, die auf lebende Zellen und Organe abzielen, sind jedoch entweder sehr teuer, wie Robotik, oder es fehlt an Nanolitervolumen und Millisekunden-Zeitgenauigkeit bei der Flüssigkeitsmanipulation. Wir präsentieren hierdas Design und die Herstellung eines mikrofluidischen Systems, das aus 1.500 Kultureinheiten, einer Reihe verbesserter peristaltischer Pumpen und einem Mischmodul vor Ort besteht. Um die Kapazitäten des mikrofluidischen Geräts zu demonstrieren, werden neuronale Stammzellkugeln (NSC) im vorgeschlagenen System beibehalten. Wir haben beobachtet, dass die runden konforme Konformation gut erhalten bleibt, wenn die NSC-Kugel CXCL in Tag 1 und EGF in Tag 2 ausgesetzt ist. Die Variation der Eingangsreihenfolge von 6 Medikamenten bewirkt morphologische Veränderungen der NSC-Sphäre und des ausdrucksrepräsentativen Markers für NSC-Stammheit (d. h. Hes5 und Dcx). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass dynamische und komplexe Umgebungsbedingungen große Auswirkungen auf die NSC-Differenzierung und Selbsterneuerung haben, und das vorgeschlagene mikrofluidische Gerät ist eine geeignete Plattform für Hochdurchsatzstudien an den komplexen Lebensmaschinen.

Einleitung

Hohe Durchsatztechniken sind entscheidend für biomedizinische und klinische Studien. Durch die parallele Durchführung von Millionen chemischer, genetischer oder lebender Zell- und Organoidtests können Forscher schnell Gene identifizieren, die einen biomolekularen Pfad modulieren, und den sequenziellen Medikamenteneinsatz an die spezifischen Bedürfnisse anpassen. Robotik¹ und mikrofluidische Chips in Kombination mit einem Gerätesteuerungsprogramm ermöglichen die Automatisierung komplexer experimenteller Verfahren, die zell-/gewebemanipulation, Flüssigkeitshandhabung, Bildgebung und Datenverarbeitung/-steuerung^2,3umfassen. Daher können Hunderte und Tausende von experimentellen Bedingungen auf einem einzigen Chip aufrechterhalten werden, nach dem gewünschten Durchsatz^4,5.

In diesem Protokoll beschrieben wir das Design- und Herstellungsverfahren eines mikrofluidischen Geräts, das aus 1500 Kultureinheiten, einer Reihe verbesserter peristaltischer Pumpen und einem Mischmodul vor Ort besteht. Die 2-stufige Zellkulturkammer verhindert unnötiges Scheren während des mittleren Austauschs, was eine ungestörte Kulturumgebung für die langfristige Live-Zell-Bildgebung sicherstellt. Die Studien zeigen, dass das vorgeschlagene mikrofluidische Gerät eine geeignete Plattform für Hochdurchsatzstudien an komplexen Lebensmaschinen ist. Darüber hinaus ermöglichen die fortschrittlichen Eigenschaften des mikrofluidischen Chips die automatisierte Rekonstitution hochkomplexer und dynamischer Mikroumweltbedingungen in vivo, wie die ständig wechselnden Zytokin- und Ligandenzusammensetzungen^6,7, deren Fertigstellung Monate für konventionelle Plattformen wie 96-Well-Platten dauert.

Protokoll

1. Mikrofluidische Chips Design

1. Entwerfen Sie den mikrofluidischen Multiplexer, der aus 18 Einlässe besteht, die jeweils über ein einzelnes Ventil und eine Peristaltikpumpe gesteuert werden. Um das durch den Pumpzyklus angetriebene Flüssigkeitsvolumen zu erhöhen, müssen die Peristaltikpumpe aus 3 Steuerkanälen bestehen, die absichtlich auf 200 m erweitert wurden, und 10 angeschlossenen Durchflussleitungen.
2. Gestalten Sie die scherfreie Kulturkammer. Die Replikation der 2-stufigen Kultureinheit besteht aus einer unteren Zellkulturkammer (400 x 400 x 150 m) und einer höheren Pufferschicht (400 x 400 x 75 m), die unerwünschte Scherbelastung der Zellen während des mittleren Austauschs verhindert(Abbildung 1).
3. Entwerfen Sie Funktionen mit hohem Durchsatz. Duplizieren Sie die Kultureinheit, um ein 30 x 50 Matrix-Layout zu bilden, das eine Fläche von ca. 7 cm x 5 cm größe einnimmt.

2. Chipherstellung und Betrieb

1. Herstellung des Replikgusses mittels UV-Lithographie
   HINWEIS: Die Replik Formteile wurden auf Silizium-Wafer nach dem Standard-Photolithographie-Protokoll⁸hergestellt.
   1. Fertigung der Kanalstrukturen
      1. Spinning Photoresist: Spincoat 5 ml der SU-8 3025 negativer Photoresist auf einem Siliziumwafer bei 500 U/min für 10 s und 3000 U/min für 30 s.
      2. Soft Backen: Den Wafer bei 65 °C für 2 min und dann 10 min auf eine Kochplatte legen und 10 min abkühlen lassen, auf Raumtemperatur abkühlen.
      3. Ausrichtung und Aushärtung: Befestigen Sie den Wafer und die Maske am Halter des Aligners und schalten Sie die Lichtquelle für 18 s ein, um den belichteten Photowiderstand zu heilen.
      4. Pre-Post-Exposition backen: Den Wafer bei 110°C/h von der Raumtemperatur auf 95°C hochfahren und mindestens 40 min bis zum Entfernen aufbewahren.
      5. Entwickeln: Tauchen Sie den Wafer in die entwicklungsorientierte Lösung (SU-8-Entwickler) und agitieren Sie ihn für 2,5 min, um redundanten Photowiderstand abzuwaschen und die 25 m hohe Kanalstruktur zu erhalten.
      6. Hart backen: Den Wafer mit glasier Petrischale bedecken und bei 65 °C 2 min backen, dann bei 120 °C/h auf 160°C hochfahren und 3 Stunden aufbewahren.
   2. Herstellung der Zellkulturkammer mit der Pufferschicht
      1. Verwenden Sie die Parameter von Schritt 2.1.1.1, um die Schicht 7 ml des SU-8 3075 negativen Photoresists auf dem obigen Wafer zu drehen.
      2. Soft backen (beschrieben in Schritt 2.1.1.2) den Wafer und ändern Sie die Maske, um gut mit Markern auf dem Wafer auszurichten. Schalten Sie dann die Lichtquelle für 24 s ein, um den exponierten Photowiderstand zu heilen.
      3. Tauchen Sie den Wafer in die sich entwickelnde Lösung (SU-8-Entwickler) ein und bewegen Sie ihn 4 Minuten und 40 Sekunden lang, um redundanten Photoresist abzuwaschen und eine 75 m hohe Schichtstruktur zu erhalten, die um die 25 m hohe Kanalstruktur herum gefertigt wurde. Hartes Backen (beschrieben in Schritt 2.1.1.6) der Wafer, um die komplexe Struktur stärker zu machen.
      4. Wiederholen Sie die Schritte 2.1.2.1-2.1.2.3, um eine 75 m hohe Kammerstruktur herzustellen, die sich auf der Schichtstruktur stapelt.
   3. Herstellung der Ventilstrukturen
      1. Mit dem Parameter Schritt 2.1.1.1 zu drehen Schicht 5 ml der AZ 50x positive Photoresist auf dem oben wafer.
      2. Soft backen (beschrieben in Schritt 2.1.1.2) den Wafer und machen die Maske gut mit Markern auf dem Wafer ausgerichtet, dann halten Sie die Lichtquelle für 20 s und sofort für 30 s. Wiederholen Sie den Lichtein-/Aus-Vorgang in 5 Kreisen, um den belichteten Photowiderstand zu heilen.
      3. Tauchen Sie den Wafer auf den passenden Entwickler und rühren Sie ihn für ca. 8 min, um redundanten Photoresist abzuwaschen und die runden Ventile zu erhalten, die sich mit den Steuerkanälen überlappen, um eine gute Verbindung zu gewährleisten. Hart backen (beschrieben in Schritt 2.1.1.6) der gemusterte Wafer, um das ganze Modell stärker zu machen.
2. Mikrofluidische Chipproduktion mit weicher Lithographie
   1. Behandeln Sie die gemusterten und leeren Siliziumwafer mit Rimethylchlorosilane für 15 min.
   2. Bereiten Sie 3 Portionen PDMS-Gel (10:1 Monomer/Katalysatorverhältnis) vor, die 50 g Durchflussschicht, 20 g Kontrollschicht 2 bzw. 20 g Membran entsprechen.
   3. 50 g PDMS-Gel auf den gemusterten Siliziumwafer gießen und 1-2 Stunden in der Vakuumkammer bei -0,85 MPa entgasen, um die Durchflussschicht zu kopieren.
   4. Die 2 Portionen von 20 g PDMS entgasen und auf dem gemusterten Wafer und einem leeren Siliziumwafer bei 2000-2800 U/min für 30 s drehen, um eine Kontrollschicht und Membranschicht vorzubereiten.
   5. Die PDMS-bedeckten Wafer für 60 min bei 80 °C zur Inkubation in den Lüftungsofen geben.
   6. Richten Und verkleben Sie die verschiedenen Schichten durch kundenspezifische optische Vorrichtung (Zoom in 100x) und Plasmaätzmaschine. Dann halten Sie es in einem Lüftungsofen für 2 Stunden bei 80 °C, um die Bindung des Chips zu verbessern.
   7. Stanzen Sie die Einlasslöcher auf den Chip, und kleben Sie ihn dann vor Gebrauch auf einen PDMS-beschichteten Coverslip und werden vor Gebrauch mindestens 12 Stunden bei 80 °C ausgehärtet.
3. Chipbetrieb
   1. Verbinden Sie miniaturpneumatische Magnetventile mit der Steuerschicht des Chips und öffnen Sie die angepasste grafische MatLAB-Benutzeroberfläche^8, um den Schalter zu verbinden und zu steuern.
   2. Stellen Sie die Schließdrücke von Push-up PDMS Membranventilen auf 25 psi ein.
   3. Bieten Sie dynamisch wechselnde kombinatorische/sequenzielle Eingänge an bestimmte Kammern(Abbildung 2d) durch rechtzeitiges Einschalten der Ventile.

3. Erzeugung dynamischer Eingänge in zellulären Mikroumgebungen

1. Chipbehandlung und Zellbeladung
   1. Halten Sie die Standardkulturbedingungen (37 °C, 5%_CO2) mindestens 5 Stunden am Mikroskop aufrecht.
   2. Füllen Sie den Chip mit einem Beschichtungsmedium (d. h. in der ANMERKUNG erwähnt) und inkubieren Sie ihn unter den Standardkulturbedingungen (beschrieben in Schritt 3.1.1) für mindestens eine Stunde.
   3. Spülen Sie den Chip durch phosphatgepufferte Saline (PBS) oder Zellkulturmedium (Dulbecco es Modified Eagle es medium, DMEM), um eine gesunde Kulturumgebung aufzubauen.
   4. Ernten Sie Zellen mit einer Koninfluenzanz von 80 % und setzen Sie die Zellen mithilfe von Kulturmedien (DMEM) mit einer Dichte von 10⁶/ml wieder aus. Dann laden Sie Zellen in den Chip, indem Sie die zellhaltige Lösung unter Druck setzt.
      HINWEIS: Das Culieren verschiedener Zelllinien auf dem Chip erfordert ein entsprechendes Beschichtungsmedium, um die Zellkulturkammer zu behandeln. Typischerweise sind für Experimente mit 3T3-Fibroblasten und der anhaftenden Kultur der Henne alle Ventile, die die Kulturkammern steuern, offen, Zellen fließen in alle Kulturkammern innerhalb derselben Säule.
2. Einrichtung für Live-Zell-Bildgebung mit hohem Durchsatz
   HINWEIS: Für die Bildaufnahme wurden ein invertiertes Mikroskop mit einer automatisierten Translationsstufe und eine digitale Komplementär-Metall-Oxid-Halbleiterkamera (CMOS) verwendet. Die Bühnen- und Bildaufnahme wurde über die kundenspezifische Software gesteuert.
   1. Visualisieren Sie die Matrix der Kulturkammern mit 10x Objektivlinse im hellen Feld, um die Positionskoordinaten jeder Kammer der 30 x 50-Kammermatrix zu bestätigen und zu definieren.
   2. Transformieren Sie die Objektivlinse in das 20x oder 40x, dann wählen Sie die Positionskoordinaten der gewünschten Kammer aus und die Translationsstufe bewegt sich nach der Bestätigung an die zugewiesene Position. Feinabstimmung der x, y, z Fokalebene, um ein optimales Bild zu erhalten.
   3. Optimal wurden die Lichtintensität, die Zeit verfügbar gemacht und andere abgebildete Parameter wurden für jeden Kanal individuell bestimmt (d. h. Lichtfeld- und Fluoreszenzbildgebung).
   4. Legen Sie das Intervall und die Dauer des Bildgebungszyklus fest, speichern Sie den Pfad, und starten Sie dann mit der Bildgebung.

Ergebnisse

Die konventionelle On-Chip-Peristaltikpumpe wurde erstmals von Stephen Quake im Jahr 2000 beschrieben, mit der die Peristaltik nach dem Muster 101, 100, 110, 010, 011, 001 ^8,10betätigt wurde. Die Zahlen 0 und 1 zeigen "öffnen" und "schließen" der 3 horizontalen Steuerlinien an. Studien mit mehr als 3 Ventilen (z.B. fünf) wurden ebenfalls berichtet¹¹. Obwohl die peristaltische Pumpe aus 3 Steuerleitungen und 3 Durchflusslinien Nanoliter...

Diskussion

Verschiedene mikrofluidische Geräte wurden entwickelt, um Multiplex- und komplexe Experimente^{durchzuführen 17,18,19,20}. Beispielsweise können Mikrobrunnen aus einer Reihe von topologischen Aussparungen einzelne Zellen ohne den Einsatz externer Kraft einfangen, was vorteilhafte Zeichen wie geringe Stichprobengröße, Parallelisierung, geringere Materialkosten, schnellere Reaktion, hohe Empfin...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2713 Loker Avenue West	Torrey pines scientific
AZ-50X	AZ Electronic Materials, Luxembourg
Chlorotrimethylsilane(TMCS) 92360-25mL	Sigma
CO2 Incubator HP151	Heal Force
Desktop Hole Puncher for PDMS chips WH-CF-14	Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.
DMEM(L-glutamine, High Glucose, henol Red)	Invitrogen
Electronic Balance UTP-313 Max:600g, e:0.1g, d:0.01g	Shanghai Hochoice Apparatus Manufacturer Co.,LTD.
FBS	Sigma
Fibronection 0.25 mg/mL	Millipore, Austria
Glutamax 100x	Gibco
Heating Incubator BGG-9240A	Shanghai bluepard instruments Co.,Ltd.
Nikon Model Eclipse Ti2-E	Nikon
Pen/Strep 10 Units/mL Penicillin 10 ug/mL Streptomycin	Invitrogen
Plasma cleaner PDC-002	Harrick Plasma
polydimethylsiloxane(PDMS)	Momentive
polylysine 0.01%	Sigma
Spin coater ARE-310	Awatori Rentaro
Spin coater TDZ5-WS	Cence
Spin coater WH-SC-01	Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.
SU-8 3025	MicroChem, Westborough, MA, USA
SU-8 3075	MicroChem, Westborough, MA, USA