Intramyokardiale Transplantation von MSC-Loading injizierbaren Hydrogelen nach Myokardinfarkt in einem Murine-Modell

Zusammenfassung

Die Stammzelltherapie hat sich als effiziente Strategie zur Reparatur von verletztem Herzgewebe nach einem Myokardinfarkt herauskristallisiert. Wir bieten eine optimale In-vivo-Anwendung für die Stammzelltransplantation mit gelatinenhydrogelen, die enzymatisch vernetzt werden können.

Zusammenfassung

Eines der Hauptprobleme, mit denen aktuelle Herzstammzelltherapien zur Vorbeugung von Herzinsuffizienz nach dem Infarkt konfrontiert sind, ist die niedrige Retentions- und Überlebensrate transplantierter Zellen innerhalb des verletzten Myokards, wodurch ihre therapeutische Wirksamkeit eingeschränkt wird. In jüngster Zeit hat der Einsatz von Gerüstbiomaterialien Aufmerksamkeit für die Verbesserung und Maximierung der Stammzelltherapie gewonnen. Ziel dieses Protokolls ist es, eine einfache und einfache Technik zur Transplantation von mesenchymalen Stammzellen (MSCs) aus Knochenmark unter Verwendung injizierbarer Hydroxyphenylpropionsäure (GH)-Hydrogele einzuführen; Die Hydrogele sind als Zellabgabeplattform für Herzgewebe-Engineering-Anwendungen aufgrund ihrer Fähigkeit, in situ vernetzt zu sein, und hoher Biokompatibilität günstig. Wir präsentieren eine einfache Methode zur Herstellung von MSC-ladenden GH-Hydrogelen (MSC/Hydrogels) und bewerten deren Überleben und Proliferation in dreidimensionaler (3D) In-vitro-Kultur. Darüber hinaus zeigen wir eine Technik zur intramyokardialen Transplantation von MSC/Hydrogelen bei Mäusen, die einen chirurgischen Eingriff beschreibt, um einen Myokardinfarkt (MI) über links anterior absteigende (LAD) koronare Arterienligation und anschließende MSC/Hydrogel-Transplantation zu induzieren.

Einleitung

Die Herzstammzelltherapie hat sich als möglicher Ansatz für die Myokardreparatur und -regeneration^1,2herauskristallisiert. Trotz der jüngsten positiven Ergebnisse in Tiermodellen und klinischen Studien ist die Anwendung einer Stammzelltherapie zur Myokardreparatur aufgrund der geringen Retention und des schlechten Überlebens der injizierten Zellen an den infarktierten Herzgeweben^3,4begrenzt. Als Ergebnis wurde der Einsatz von zellbasierter Gewebetechnik, einschließlich injizierbarer Biomaterialien⁵, Herzpflaster⁶und Zellblätter⁷, intensiv untersucht, um die Zellretention und -integration innerhalb des Wirtsmyokards zu verbessern.

Unter den verschiedenen möglichen Ansätzen zur biotechnischen Herzgewebereparatur sind injizierbare Hydrogele in Kombination mit geeigneten Zelltypen, wie mesenchymale Stammzellen (MSCs), embryonale Stammzellen (ESCs) und induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs), eine attraktive Option, um Zellen effektiv in die Myokardregionen^8,9zu liefern. Gelatine, ein bekanntes natürliches Polymer, kann aufgrund seiner großen Biokompatibilität, seiner beträchtlichen biologischen Abbaubarkeit und der reduzierten Immunogenität im Vergleich zu einer Vielzahl von Biomaterialien, die in biomedizinischen Anwendungen verwendet werden, als injizierbare Matrix verwendet werden. Obwohl gelatinebasierte injizierbare Plattformen ein großes Potenzial haben, bleibt ihre Anwendbarkeit in vivo aufgrund ihrer geringen mechanischen Steifigkeit und leichten Abbaubarkeit in der physiologischen Umgebung begrenzt.

Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurde ein neuartiges und einfaches Design von gelatinebasierten Hydrogelen, die aus Hydroxyphenylpropionsäure bestehen, für In-vivo-Anwendungen vorgeschlagen. Gelatine-Hydroxyphenylpropionsäure (GH) Konjugate können in Gegenwart eines Enzyms, Der Meerrettichperoxidase (HRP), in situ vernetzt werden und anschließend verschiedene Medikamente, Biomoleküle oder Zellen innerhalb des Hydrogels verkapseln, was auf ein großes Potenzial in gewebetechnischen Anwendungen^{10,11,12,13,14}hindeutet. Darüber hinaus haben wir vor kurzem die therapeutische Wirkung von GH-Hydrogelen untersucht, die gekapselte MSCs enthalten, und ihre Verwendung bei erfolgreicher Herzreparatur und -regeneration nach MI in einem murinen Modell¹⁵nachgewiesen. In diesem Protokoll beschreiben wir eine einfache Technik für die Verkapselung und in vitro dreidimensionale (3D) Proliferation von MSCs in GH-Hydrogelen. Wir führen auch ein chirurgisches Verfahren ein, das entwickelt wurde, um ein murines MI-Modell über koronare Arterienligation und intramyokardiale Transplantation von MSC-ladenden GH-Hydrogelen in das infektiierte Herz zu erzeugen.

Protokoll

Alle Tierforschungsverfahren wurden in Übereinstimmung mit dem Laboratory Animals Welfare Act, dem Guide for the Care and Use of Laboratory Animals und den Richtlinien und Richtlinien für Nagetierexperimente bereitgestellt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) in der School of Medicine der Katholischen Universität Korea zur Verfügung gestellt wurden.

1. Herstellung von MSCs und injizierbaren Gelatinehydrogelen

1. Kultur MSCs in einem 100 mm Kulturgericht bei 37 °C und 5%_CO2. Wenn das MSCs-Wachstum 80 % Zusammenfluss erreicht, waschen Sie die Schale zweimal mit DPBS und fügen Sie 1 ml Trypsin-Ersatz bei 37 °C für 3 min hinzu.
   ANMERKUNG: MSCs wurden nach herkömmlichen Verfahren¹⁶aus dem murinen Knochenmark isoliert, in Dulbeccos Modified Eagle es Medium (DMEM) kultiviert, das 10% fetales Rinderserum (FBS) und 1% Antimykotische Lösung enthält, und zwischen Durchgang 7-u20129 für diese Studie verwendet.
2. Fügen Sie 9 ml Kulturmedium und Zentrifuge bei 500 x g für 3 min hinzu. Als Nächstes entsorgen Sie den resultierenden Überstand, setzen Sie die Zellen in 1 ml PBS wieder auf und halten Sie die Zellsuspension auf Eis aufrecht.
3. Verdünnen Sie 10 l Zellsuspension mit 10 l Trypan-Blau und erhalten Sie die Zellkonzentration mit einem automatisierten Zellzähler.
4. MSCs mit einer Dichte von 1 x 10⁷ Zellen/ml auf ein 1 ml-Rohr zurücksetzen und übertragen.
5. Bereiten Sie eine 6,25 Gew. GH-Konjugatlösung in PBS vor und trennen Sie sie in 2 Durchstechflaschen. Als nächstes mischen Sie die GH-Lösungen entweder mit 6 g/ml HRP (GH-Lösung A) oder 0,07 Gew. H_2O2 (GH-Lösung B).
   HINWEIS: Bereiten Sie Gelatine-Hydroxyphenylpropionsäure (GH) Konjugate nach den veröffentlichten Protokollen^12,15vor.
   1. Bewahren Sie ein 9:1 Volumetric Ratio der GH-Konjugatlösung zu HRP (GH-Lösung A) bzw. GH-Konjugatlösung zu_H2O2 (GH-Lösung B) auf.
6. Vor dem Mischen der MSCs mit GH-Lösung A die Zellsuspension kurz zentrieren bei 1.000 x g und den resultierenden Überstand vorsichtig ansaugen. Anschließend das Pellet, das MSCs enthält, mit GH-Lösung A mischen.

2. In situ MSC-Lade- und dreidimensionale In-vitro-Kultur

1. Laden Sie GH-Lösung A (mit MSCs) und GH-Lösung B in beide Seiten einer Doppelspritze. Platte 300 l der kombinierten GH-Lösungen mit MSCs mit einer Enddichte von 5 x 10⁶ Zellen/ml auf einem Acht-Well-Kammerschlitten.
2. Nach der In-situ-Hydrogelbildung und der anschließenden MSC-Verkapselung über enzymatische Vernetzung, fügen Sie 700 l DMEM mit 10% FBS und 1% antimykotischer Lösung hinzu.
3. Inkubieren Sie die Rutsche bei 37 °C und 5%_CO2 und ersetzen Sie das Kulturmedium alle 2-u20123 Tage.

3. Bestätigung der In-vitro-Proliferation und des Überlebens von MSCs in GH-Hydrogelen

1. Um die Lebensfähigkeit von 3D-kultivierten MSCs innerhalb von GH-Hydrogelen zu bestimmen, verwenden Sie einen Live/Dead Cell Staining Assay nach der vorgegebenen Inkubationszeit.
2. Nach inkubation der gekapselten MSCs in GH-Hydrogelen für 3, 5, 7 oder 14 Tage, das Medium ansaugen und den Brunnen zweimal mit PBS waschen.
3. Bereiten Sie eine Färbelösung vor, die 5 l Calcein AM und 20 l Ethidium-Homodimer-1 (EthD-1) in 10 ml DPBS enthält.
4. Fügen Sie 200 l der Färbelösung in den Brunnen und inkubieren für 30 min im Dunkeln bei Raumtemperatur.
5. Die Färbelösung ansaugen und den Brunnen zweimal mit PBS waschen.
6. Trennen Sie die Kammer vorsichtig von der Rutsche und legen Sie einen vollständigen Deckelüberschlag über die GH-Hydrogele. Verwenden Sie eine konfokale Mikroskopie, um den Grad der Proliferation und morphologischen Veränderungen der gekapselten MSCs zu visualisieren.
   HINWEIS: Fluoreszierende Bilder wurden unter 200-facher Vergrößerung aufgenommen und bei den Anregungs-/Emissionswellenlängen von 470/540 nm für Calcein und 516/607 nm für EthD-1 abgebildet.

4. Induktion des Myokardinfarkts bei Mäusen

1. Anästhetisieren Sie 7 Wochen alte männliche C57BL/6-Mäuse (20-u201222 g) mit intraperitonealer Injektion einer Mischung aus Zoletil (30 mg/kg) und Rompun (10 mg/kg) in Saline.
2. Vor der Operation, depilate die Brust der Maus mit Haarentfernung Creme und sterilisieren die Haut mit Jod.
3. Legen Sie die Maus auf einen Operationstisch und intubieren Sie, indem Sie einen Katheter in die Luftröhre einsetzen, um zusätzlichen Sauerstoff über mechanische Belüftung bereitzustellen.
4. Mit einer chirurgischen Schere vorsichtig durch die Haut schneiden und dann mit einer Mikroschere in die Interkostalmuskulatur eindringen. Trennen Sie die zweite und dritte linke Rippe mit einer 5-0 Seidennaht, um eine offene Brusthöhle zu erhalten.
5. Vorsichtig ligate die linke vordere absteigende (LAD) Koronararterie mit einem Nadelhalter mit einem 8-0 Polypropylen-Nähte und schneiden Sie die Naht mit Elektrokauterie.
6. Beobachten Sie einen sofortigen Farbwechsel in der vorderen linken ventrikulären Wand.

5. Intramyokardiale Transplantation von MSC-ladenden GH-Hydrogelen

1. Nach der Induktion des Myokardinfarkts durch LAD-Ligatur, injizieren Sie 10 l MSC-ladende GH-Lösungen in zwei verschiedene Punkte in der Infarktgrenzzone (insgesamt: 2 x 10⁵ MSCs/20 l) mit einer Doppelspritze, die mit einer 26G-Nadel ausgestattet ist.
   1. Nach dem in Schritt 1 beschriebenen Verfahren können Sie MSC-ladende GH-Lösungen vorbereiten und in eine Doppelspritze übertragen.
      ANMERKUNG: Zur Beurteilung der Engraftmentierung von MSC-ladenden GH-Hydrogelen im Infarktbereich wurden MSCs und GH-Konjugate mit PHK26 bzw. Fluoresceinisothiocyanat (FITC) voretikettiert.
2. Stellen Sie die geöffnete Brusthöhle wieder her und schließen Sie die Muskeln und die Haut mit 5-0 Nähten.
   HINWEIS: Entfernen Sie vor dem Brustverschluss die Luft mit einer Katheterspritze.
3. Entfernen Sie das Luftröhrenrohr und legen Sie die Maus während der Bergung in einen Käfig unter einer Infrarotlampe.
4. Bei postoperativer Analgesie subkutane Ketoprofen-Injektionen (5 mg/kg pro Tag) mindestens 72 h verabreichen. Alle Mäuse sollten für einen angemessenen Zeitpunkt genau überwacht werden, um eine ordnungsgemäße Genesung nach chirurgischen Eingriffen sowie eine angemessene Schmerzbehandlung zu gewährleisten.

6. Echokardiographie

1. Vier Wochen nach der Transplantation die Maus zunächst mit 5% Isofluran befeuchten und dann die Isoflurankonzentration auf 1% anpassen.
2. Depilate die Brust mit Haarentfernung Creme und legen Sie die Maus auf einem Heizkissen. Ultraschall-Wandlergel auf die Brust auftragen.
3. Erfassen Sie zweidimensionale parasternale Kurzachsenansichten und zeichnen Sie M-Modus-Tracings auf der Ebene des Papillenmuskels auf.
   ANMERKUNG: Platzieren Sie einen linearen Array-Wandler (7-u201215 MHz) in der linken parasternalen Linie und zeigen Sie die anatomischen Strukturen an.
4. Messen Sie entsprechende Linien für LVAW, LVID und LVPW, um Herzwanddicke, Kammerabmessung und fraktionierte Verkürzung zu erhalten.
   HINWEIS: Vergleichen Sie die Herzfunktion einschließlich der Auswurffraktion (EF), der fraktionierten Verkürzung (FS) und des endsystolischen Volumens (ESV) auf der Ebene des Papillenmuskels, um eine ordnungsgemäße Bewertung an derselben anatomischen Stelle zu gewährleisten.

7. Histologische Bewertung

1. Zur vorgegebenen Zeit nach der Transplantation von MSC-ladenden GH-Hydrogelen in das Infarktherz, euthanisieren Sie die Maus in einer_CO2-Kammer und sammeln Sie das Herz für die histologische Analyse¹⁵.
2. Für Hämatoxylin und Eosin (H&E) und Massons Trichromfärbung (MT) fixieren Sie das sezierte Herzgewebe in 4% Paraformaldehyd (PFA) und betten Sie es in Paraffin ein. Als nächstes schneiden Sie paraffin-eingebettete Herzblöcke mit einem Mikrotom in 4 m serielle Abschnitte und färben die Abschnitte mit MT-Färbung nach Standardprotokollen¹⁷.
3. Erfassen Sie Bilder auf einem Diascanner mit 20-facher Vergrößerung und berechnen Sie die Infarktgröße der Behandlungsgruppen.
   Infarktgröße (%) = Gesamtinfarktumfang / Gesamtumfang LV x 100
4. Berechnen Sie beide Umfangswerte nach Messung der Mittellinielänge. Messen Sie bei LV-Mittellinienumfangdien die Mittellinienlängen zwischen den Endokard- und Epikardialoberflächen. Bei Midline-Infarktumfangen die Infarktlängen messen, einschließlich mehr als 50 % der Gesamtdicke von Myokard¹⁸.
   HINWEIS: Alle Bildanalysen wurden mit ImageJ-Software durchgeführt.
5. Messen Sie die Wanddicke der Narbe auf den Papillenmuskelebenen.
6. Berechnen Sie den Bruchteil der Kollagenfläche.
   Kollagenfläche (%) = Gesamtfläche der interstitiellen Fibrose/Myozytenfläche x 100

Ergebnisse

Um MSCs effektiv an das infarktierte Myokard zu liefern, wurden in diesem Protokoll mSC-ladebare in situ-vernetzte Hydrogele verwendet, die in Abbildung 1 beschrieben sind. Vor der In-vivo-Transplantation wurden die Proliferation und das Überleben von MSCs in GH-Hydrogelen durch einen 3D-In-vitro-Färbe-Assay bestätigt (live: grün; tot: rot). Wie in Abbildung 2dargestellt, zeigten repräsentative Bilder eine ausreichende Verbreitung von MSCs, die verzweigte N...

Diskussion

Injizierbare GH-Hydrogele haben aufgrund ihrer Fähigkeit, verschiedene therapeutische Wirkstoffe in situ homogen zu integrieren, ein großes Potenzial für In-vivo-Anwendungen. Darüber hinaus können ihre physikalischen und biochemischen Eigenschaften aufgrund krankheitsabhängiger Anforderungen leicht manipuliert werden. In dieser Hinsicht wurden injizierbare Hydrogele vorgeschlagen, um die großen Einschränkungen in der aktuellen Herzstammzelltherapie anzugehen, die durch schlechtes Überleben und Zellretention (d. ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
4 % paraformaldehyde (PFA)	Intron	IBS-BP031-2
5-0 silk suture	AILEE	SK534
8-0 polypropylene suture	ETHICON	M8732H
8-well chamber slide	Nunc LAB-TEK	154534
Angiocath Plus (22GA) catheter	BD Angiocath Plus	REF382423
Antibiotic-antimyocotic	Gibco	15240-062
Centrifuge	GYROGEN	1582MGR
Confocal microscope	Zeiss	LSM 510
Cover slipe	MARIENFELD	101242
Deluxe High Temperature Cautery kit	Bovie	QTY1
DMEM	Gibco	11995-065
DPBS	Gibco	14040-133
Dual-syringe
EOSIN	SIGMA-ALDRICH	HT110116
Ethanol	EMSURE	K49350783 739
FBS	Gibco	16000-044
Fechtner conjunctiva forceps titanium	WORLD PRECISISON INSTRUMENTS	WP1820
Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC)	SIGMA-ALDRICH	F7250
Forcep	HEBU	HB0458
Hair removal cream	Ildong Pharmaceutical
Heating pad	Stoelting	50300	Homeothermic Blanket System
		50301	Replacement Heating Pad for 50300 (10 X 12.5cm)
Hematoxylin	SIGMA-ALDRICH	HHS80
Horseradish peroxide (HRP; 250-330 U/mg)	SIGMA-ALDRICH	P8375
Hydrogen peroxide (H2O2; 30 wt % in H2O)	SIGMA-ALDRICH	216763
Iodine	Green Pharmaceutical
LIVE/DEAD cell staining kit	Thermo Fisher	R37601
Mechanical ventilator	Harvard Apparatus
Micro centrifuge	HANIL	Micro 12
Micro needle holder	KASCO	37-1452
Micro scissor	HEBU	HB7381
Microscope	OLYMPUS	SZ61
MT staining kit	SIGMA-ALDRICH	HT1079-1SET	Weigert’s iron hematoxylin solution
		HT15-1KT	Trichrome Stain (Masson) Kit
Paraffin	LK LABKOREA	H06-660-107
PBS buffer	Gibco	10010-023
PHK26 staining kit	SIGMA-ALDRICH	MINI26
Slide scanner	Leica	SCN400
Surgical scissor	HEBU	HB7454
Surgical tape	3M micopore	1530-1
Tissue cassette	Scilab Korea	Cas3003
Transducer gel	SUNGHEUNG	SH102
Trout-Barraquer needle holder curved	KASCO	50-3710c
Ultrasound system	Philips	Affiniti 50
Xylene	JUNSEI	25175-0430