Ein Protokoll für Immunhistochemie und RNA-in-situ-Verteilung im frühen Drosophila-Embryo

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Protokoll zum Nachweis und zur Lokalisierung von Drosophila-Embryoprotein und RNA von der Sammlung bis zur Voreinbettung und Einbettung, Immunfärbung und mRNA-in-situ-Hybridisierung.

Zusammenfassung

Die Calcium-induzierte Kalziumfreisetzungssignalisierung (CICR) spielt in vielen biologischen Prozessen eine entscheidende Rolle. Jede zelluläre Aktivität von Zellproliferation und Apoptose, Entwicklung und Alterung bis hin zu neuronaler synaptischer Plastizität und Regeneration wurde mit Ryanodinrezeptoren (RyRs) in Verbindung gebracht. Trotz der Bedeutung der Calciumsignalisierung ist der genaue Mechanismus seiner Funktion in der frühen Entwicklung unklar. Als Organismus mit kurzer Schwangerschaft sind die Embryonen von Drosophila melanogaster erstklassige Studienobjekte, um die Verteilung und Lokalisation von CICR-assoziierten Proteinen und ihren Regulatoren während der Entwicklung zu untersuchen. Aufgrund ihrer lipidreichen Embryonen und ihres chitinreichen Chorions ist ihr Nutzen jedoch durch die Schwierigkeit begrenzt, Embryonen auf Glasoberflächen zu montieren. In dieser Arbeit stellen wir ein praktisches Protokoll vor, das die Bindung von Drosophila-Embryonen an Objektträger signifikant verbessert und Methoden für eine erfolgreiche Histochemie, Immunhistochemie und In-situ-Hybridisierung detailliert beschreibt. Die Chromalaun-Gelatine-Objektträgermethode und die Embryo-Voreinbettungsmethode erhöhen die Ausbeute bei der Untersuchung des Drosophila-Embryoproteins und der RNA-Expression dramatisch. Um diesen Ansatz zu demonstrieren, untersuchten wir DmFKBP12/Calstabin, einen bekannten Regulator von RyR während der frühen embryonalen Entwicklung von Drosophila melanogaster. Wir identifizierten DmFKBP12 bereits im synzytialen Blastodermstadium und berichteten über das dynamische Expressionsmuster von DmFKBP12 während der Entwicklung: zunächst als gleichmäßig verteiltes Protein im synzytialen Blastoderm, dann vorläufig lokalisiert es während des zellulären Blastoderms in der Basalschicht des Kortex, bevor es sich während der Drei-Edelsteinschicht-Phase in der frühen Gastrulation in der primitiven neuronalen und Verdauungsarchitektur verteilt. Diese Verteilung könnte die entscheidende Rolle erklären, die RyR in den lebenswichtigen Organsystemen spielt, die aus diesen Schichten stammen: dem subösophagealen und supraösophagealen Ganglion, dem ventralen Nervensystem und dem Bewegungsapparat.

Einleitung

Das Calcium Induced Calcium Release Signaling (CICR) spielt eine entscheidende Rolle in vielen biologischen Prozessen, wie z.B. Skelett-/glatte Muskulatur und kardiale Gefäßfunktion, Zellproliferation und Apoptose, Entwicklung, Alterung, neuronale synaptische Plastizität und Regeneration1,2,3,4,5,6 . Ryanodinrezeptoren (RyRs) und Inositol-1,4,5-Trisphosphatrezeptoren (IP3Rs) sind Hauptakteure im Calcium-Signalweg, der von ihren Regulatoren Proteinkinase A (PKA), ^Ca2+/Calmodulin-abhängige Proteinkinase II (CaMKII), FK506-bindende Proteine (FKBPs), Calsequestrin (CSQ), Triadin und Junitin1,2,3,4,5,6 kontrolliert wird^. . Abnorme menschliche Expression und Mutationen in diesen Proteinen können zu pathologischer Physiologie wie Arrhythmien7 und onkogener Proliferation ^führen8,9.

FKBPs regulieren die Calciumfreisetzung aus dem endoplasmatischen retikulären (ER) durch RyRs. Dieser Prozess ist essentiell für den Kontraktionsmechanismus und somit verantwortlich für alle mechanischen Bewegungen, die durch die Myosin-Aktin-Kontraktion durch kalziuminduzierte Kalziumfreisetzung zusammen mit embryonalem ^RyRs1,2 erzeugt werden. In Mausmodellen ist der Mangel an RyR2 und seinem Regulator FKBP12/Calstabin ausnahmslos tödlich, entweder während der Embryonalentwicklung oder in der frühen postnatalen ^{Periode10,11,12}. FKBP12/Calstabin-Knockout-Mäuse weisen während der Embryonalentwicklung kritische Herzdefekte mit unregelmäßiger Erregungs-Kontraktions-Kopplung (EC) und Hirnödemen auf. Dies deutet darauf hin, dass FKBP12/Calstabin eine wesentliche Rolle bei der Regulierung der RyR2-Kanalexpression spielt, die sowohl für die kardiale als auch für die zerebrale Entwicklung wichtig ^ist10.

RyR-geleitete Kalziumfunken wurden zunächst in der Zygotenbildungsphase befruchteter Medaka-Eier ^{entdeckt13,14}. Es wurden jedoch nur wenige Untersuchungen zur Funktion der Calciumsignalisierung in der frühen Embryonalentwicklung durchgeführt. Bei Drosophila melanogaster liefern die Ergebnisse von DmFKBP12 S107-Mutanten starke Beweise für die Bedeutung dieses Gens für die Larvenentwicklung und eine gesunde Lebensdauer, die auf seine Funktion gegen oxidativen Stress zurückzuführen ^ist15,16. Vor kurzem haben wir die dynamische Lokalisation von FKBP12/Calstabin-Protein und Boten-RNA während der frühen Entwicklung von Drosophila melanogaster ^{identifiziert17.} Mit den in dieser Methodik beschriebenen Ansätzen konnten wir die Expression von FKBP12/Calstabin in D. melanogaster während des synzytialen Blastoderms (0-2 h), des zellulären Blastoderms (2-3 h), des frühen Gastrillas (3-12 h) und des späten Gastrula (12-24 h) verfolgen. In diesem Artikel stellen wir die detaillierten Protokolle aller Ansätze in der vorherigen Studie vor, einschließlich der Einbettung vor dem Embryo für die klassische Paraffinschnitte, der Vorbeschichtung von Objektträgern für embryonale Abschnitte, der histochemischen Färbung und Immunfärbung sowie der mRNA-In-situ-Hybridisierung zur Identifizierung der Genexpression.

Protokoll

1. Zubereitung von Traubensaft-Agar-Tellern

1. Fügen Sie 5 g Agar und 5 g Saccharose zu 150 ml destilliertem Wasser hinzu. Kochen Sie es mit einer Mikrowelle, bis Agar und Saccharose vollständig aufgelöst sind. Mischen Sie 50 ml 100% Traubensaft und die Lösung zusammen.
2. Fügen Sie 1 ml 100% Propionsäure hinzu, um die Endkonzentration auf 0,5% Propionsäure zu erhöhen. Gießen Sie 25 ml der vorbereiteten Lösung in jede Platte. Nachdem das Agar erstarrt ist, lagern Sie das Medium bei 4 °C.

2. Beschichtungsobjektträger

1. Vorbehandeln Sie Objektträger mit Reinigungsmittel. Waschen Sie die Rutschen 3 Mal mit Leitungswasser und einmal mit destilliertem Wasser. Anschließend trocknen Sie die Objektträger in einem 45 °C Ofen für 2 h.
2. Tauchen Sie die Objektträger 24 Stunden lang in etwa 450 ml Kaliumdichromat-Schwefelsäurelösung (20 g Kaliumdichromat, 40 ml destilliertes Wasser und 400 ml konzentrierte Schwefelsäure). Waschen Sie die Rutschen 3 Mal mit Leitungswasser und einmal mit destilliertem Wasser.
   1. Trocknen Sie die Rutschen in einem 45 °C heißen Ofen zwei Stunden lang. Eintauchen in 95% Ethanol für mehr als 2 h.
3. 0,5 g Chromkaliumsulfat und 5 g Gelatine zu 1 l destilliertem Wasser hinzufügen. Vor Gebrauch in einem 60 °C warmen Wasserbad auflösen. Die Chromalaungelatine kann bei 4 °C über lange Zeiträume gelagert werden.
4. Lassen Sie 10 μL der Chromalaungelatine auf den Objektträger fallen und bedecken Sie die gesamte Oberfläche des Objektträgers vollständig und gleichmäßig mit der Lösung. Legen Sie den Objektträger mit der Gelatineseite nach oben für 48 h in einen Ofen bei 42 °C. Die vorbereiteten Objektträger können zur späteren Verwendung bei 4 °C gelagert werden.
   HINWEIS: Dies ist ein kritischer Schritt. Die komplette Beschichtung ist notwendig. Für die Fruchtfliege und ihren Embryo erscheint dieser Gleitbeschichtungsansatz effizienter als die Polylysinbeschichtung.

3. Einbettung des Drosophila-Embryos

1. Sammlung von Drosophila-Embryonen
   HINWEIS: Wir sammelten Drosophila-Embryonen in vier Perioden von 0-2 Stunden (Synzytialblastoderm), 2-3 Stunden (zelluläres Blastoderm), 3-12 Stunden (frühe Gastrula) und 12-24 Stunden (späte Gastrula)¹⁸. Der Anteil der wichtigsten Embryonentypen in jeder Periode ist in Tabelle 1 dargestellt.
   1. Legen Sie 400-500 Fliegen in eine Plastiksammelflasche und bedecken Sie die Flasche mit der Traubensaft-Agarplatte, die Hefeextrakt enthält. Drosophila-Embryonen werden bei Raumtemperatur auf den Traubensaft-Agar gelegt.
   2. Sammeln Sie vier Perioden von Embryonen und fügen Sie vorsichtig 2 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCL, 10 mM _Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) zu jeder Platte hinzu, um die Embryonen schwimmen zu lassen. Übertragen Sie etwa 200 Embryonen in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen und halten Sie es 2 Minuten lang auf Eis, um die Embryonen zu beruhigen.
2. Voreinbettung
   1. Transfer von 200 Drosophila-Embryonen in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen. Halten Sie die Röhre für 2 Minuten auf Eis, um die Embryonen zu beruhigen, und werfen Sie dann den Überstand vorsichtig mit der Pipette ab. Fügen Sie 1 ml 50% Bleichmittel in die Tube und schütteln Sie es vorsichtig für 2 min.
      HINWEIS: Das Bleichmittel sollte frisch zubereitet werden, und die Menge des Bleichmittels kann je nach Menge der gesammelten Embryonen variieren.
   2. Sammeln Sie vorsichtig Embryonen, indem Sie sie auf Filterpapier gießen und waschen Sie sie 3 Mal mit jeweils 1 ml PBS.
   3. Übertragen Sie die Embryonen mit Filterpapier auf etwa 5 ml n-Heptan.
   4. Die Mischung in ein frisches 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen geben. Fügen Sie 1 ml Methanol hinzu und schütteln Sie es vorsichtig. Sammle Embryonen nach der Sedimentation.
   5. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Embryonen 3-5 Mal in 1 ml PBS.
   6. Fixieren Sie die Embryonen mit 400 μL Bouinlösung (71% gesättigte Picrinsäure, 24% Formalin, 5% Essigsäure) für 30 min. Waschen Sie die fixierten Embryonen 3 mal in 1 ml PBS für jeweils 5 Minuten.
   7. Um Embryonen zu aggregieren, übertragen Sie die Proben in einen Gummistopfen und entfernen Sie das PBS.
   8. Bereiten Sie 1,2% ige Agarose-PBS-Lösung vor und halten Sie die Lösung bei 60 ° C. Fügen Sie 200 μL 1,2% ige Agarose-PBS-Lösung in die Embryonen ein, um sie in einem Agarblock zu fixieren.
   9. Nehmen Sie den Block aus dem Stopper heraus und speichern Sie den Block in PBS.
      HINWEIS: Während des Ansatzes vor der Einbettung ist die Pro-Erwärmung entscheidend für den Erfolg. Wir empfehlen dringend, dass die Zentrifugenröhrchen und Mikropipettenspitzen, die in diesem Schritt verwendet werden, vor dem Betrieb vollständig vorgewärmt werden sollten.
3. Paraffin-Einbettung
   1. Tauchen Sie den voreingebetteten Agarblock für jeweils 15 Minuten in 35 % Ethanol, 50 % Ethanol, 75 % Ethanol und 85 % Ethanol ein. Dann 2 mal in 95% Ethanol und 100% Ethanol tauchen.
      ANMERKUNGEN: Etwa 5-10x Blockvolumen von jedem, gefolgt von einem abgestuften Fixiermittel für 15-30 Minuten, ist abhängig von der Anzahl der Embryonen im Block notwendig.
   2. Tauchen Sie den Embryonenblock 15 min in 100% ige Ethanol- und Xylollösung (Verhältnis 1:1).
   3. Übertragen Sie den Block für 1 Minute auf Xylol, um das Embryogewebe transparent zu machen.
   4. Tauchen Sie den Block für 30 Minuten in Xylol und Paraffin (Verhältnis 1:1) ein.
   5. Tauchen Sie den Block jeweils für 2 Stunden in Paraffin I, Paraffin II und Paraffin III ein.
   6. Füllen Sie die Einbettungsbox vorher mit Paraffin und übertragen Sie den Block dann vorsichtig und horizontal in den Boden der Einbettungsbox. Nachdem das Paraffin auf natürliche Weise erstarrt ist, kann der erstarrte Paraffinblock bei 4 °C gelagert werden.
      HINWEISE: Die voreingebettete Probe kann in der Kryosektion verwendet werden, indem Sie die folgenden Schritte ausführen. Nachdem die Embryonen wie oben beschrieben mit Agarose voreingebettet wurden, werden die Proben einfach in OCT Compound eingebettet. Danach kann die Kryosektion nach dem routinemäßigen Kryosektionsprotokoll durchgeführt werden. Anschließend können regelmäßige Färbeansätze auf den Abschnitten verwendet werden.

4. Hämatoxylin-Eosin-Färbung

1. Bereiten Sie Drosophila-Embryo-Abschnitte vor. Vorbereitete Abschnitte für 15 min in einen Ofen bei 60 °C legen und dann die Abschnitte 2 mal für jeweils 10 min in Xylol tauchen. Tauchen Sie die Abschnitte einmal für 2 min 100% Ethanol und Xylol (Verhältnis 1:1) ein.
2. Hydratisieren Sie die Abschnitte in 100% Ethanol I, 100% Ethanol II, 95% Ethanol, 85% Ethanol, 75% Ethanol, 50% Ethanol und in destilliertem Wasser für 3 min.
3. Färben Sie die Abschnitte mit Hämatoxylinlösung für 2 min. Tauchen Sie die Objektträger schnell in 1% ige saure Alkohollösung (1 ml Salzsäure, 100 ml 70% Ethanol) und waschen Sie die Objektträger in destilliertem Wasser.
4. Tauchen Sie die Objektträger nacheinander in 50% Ethanol, 75% Ethanol, 85% Ethanol und 95% Ethanol ein.
5. Färben Sie die Abschnitte mit Eosinlösung für 1 min.
6. Dehydrieren Sie die Objektträger in 95% Ethanol I, 95% Ethanol II, 95% Ethanol III, 100% Ethanol I, 100% Ethanol II und 100% Ethanol III für jeweils 1 Minute.
7. Löschen Sie die Objektträger in 100% Xylol I, 100% Xylol II und 100% Xylol III für jeweils 5 Minuten.
8. Montieren Sie die Dias mit neutralem Balsam gemäß den Anweisungen des Herstellers.

5. Periodische Säure-Silber-Methenamin-Färbung

1. Deparaffinisieren und hydratisieren Sie Paraffinabschnitte von Drosophila embryo zu destilliertem Wasser.
2. Oxidieren Sie die Abschnitte in 1% periodischer Säure für 15 min bei Raumtemperatur.
3. Spülen Sie die Objektträger in destilliertem Wasser 3 Mal für jeweils 1 min ab.
4. Die Objektträger in etwa 40 ml frisch gefilterter Silbermethenamin-Arbeitslösung (3% Methenamin, 5% Silbernitrat, 5% Natriumboratlösung) für 1 h und 20 Minuten bei 60 °C inkubieren. Dann spülen Sie die Rutschen in destilliertem Wasser für 1 min.
5. Tonne die Objektträger in 0,2% Goldchlorid für 2 min und spüle dann die Objektträger in destilliertem Wasser für 1 min.
6. Legen Sie die Objektträger für 3 min in 3% Natriumthiosulfat und spülen Sie die Objektträger dann für 1 min in destilliertem Wasser ab.
7. Bekämpfen Sie die Objektträger in Hämatoxylin für 30 s. Waschen Sie die Rutschen in fließendem Leitungswasser für 3-5 min.
8. Dehydrieren Sie die Objektträger in 70% Ethanol, 80% Ethanol, 95% Ethanol I, 95% Ethanol II, 95% Ethanol III, 100% Ethanol I und 100% Ethanol II für jeweils 5 Minuten.
9. Löschen Sie die Objektträger in 100% Xylol I, 100% Xylol II und 100% Xylol III für jeweils 5 Minuten.
10. Montieren Sie die Dias in neutralem Balsam gemäß den Anweisungen des Herstellers.

6. Immunhistochemie

1. Deparaffinisieren und rehydrieren Sie Paraffinabschnitte von Drosophila embryo zu PBS gemäß dem Standardprotokoll19^.
2. Behandeln Sie Objektträger mit 0,3% _H2O2 in Methanol für 10 min bei Raumtemperatur und vermeiden Sie Licht.
3. Den entsprechenden Antigen-Retrieval-Puffer in einem Behälter mit den Objektträgern im Gemüsedämpfer auf ca. 100 °C vorheizen. Der Behälter sollte auch einen Deckel haben. Legen Sie die Folien in den Behälter. Schließen Sie den Deckel des Dampfers.
   1. Bewahren Sie den Behälter ab diesem Zeitpunkt für 20 Minuten im Dampfgarer auf. Beachten Sie, dass der Deckel des Gleitbehälters nicht vollständig angezogen werden sollte, damit während des Dämpfvorgangs Wasserdampf eindringen kann.
4. Lassen Sie die Objektträger auf Raumtemperatur zurückkehren, bevor Sie sie vorsichtig in PBS-T (PBS mit Tween-20, pH 7,2) 3 Mal für jeweils 5 Minuten spülen und dann die Objektträger in PBS 3 Mal für jeweils 1 Minute spülen.
5. Blockieren Sie die Objektträger mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS für 60 min bei Raumtemperatur.
6. Inkubieren Sie die Objektträger mit einem primären Antikörper (Anti-FKBP12 bei 1:1000) über Nacht bei 4 °C oder bei Raumtemperatur für 4 h.
7. Waschen Sie die Objektträger in PBS-T 4 Mal für jeweils 5 Minuten.
8. Tragen Sie die Objektträger mit HRP-markiertem Polymer auf, das mit sekundären Antikörpern (Anti-Rabbit, 1:5.000) für 90 min bei Raumtemperatur konjugiert ist. Tun Sie dies im Dunkeln, um Fotobleichen zu vermeiden.
9. Waschen Sie die Dias in PBS-T 3 Mal für jeweils 5 Minuten.
10. Die Objektträger mit 5% 3,3'-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid (DAB) für 2-10 min inkubieren, bis die Farbe der Reaktionsprodukte unter dem Mikroskop angemessen ist.
11. Färben Sie die Objektträger 30 s lang in Hämatoxylin und waschen Sie die Objektträger in destilliertem Wasser 2 Mal für jeweils 5 Minuten.
12. Dehydrieren Sie die Objektträger in 50% Ethanol, 70% Ethanol, 90% Ethanol, 95% Ethanol und 100% Ethanol für jeweils 1 Minute.
13. Löschen Sie die Objektträger in 100% Xylol I, 100% Xylol II und 100% Xylol III für jeweils 5 Minuten.
14. Montieren Sie die Dias in neutralem Balsam gemäß den Anweisungen des Herstellers.

7. In-situ-Hybridisierung

HINWEIS: Drosophila-Embryo-Abschnitte wurden mit 0,01% Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandeltem Wasser hergestellt. Alle Zubehörteile, die für die In-situ-Hybridisierung verwendet werden, wenden die DEPC-Behandlung über Nacht im Voraus an.

1. Riboprobe Präparation
   1. Linearisieren Sie die Vorlagen-DNA, indem Sie an einer Restriktionsenzymstelle stromabwärts vom klonierten Insert mit einem Restriktionsenzym schneiden, das 5'-Überhänge erzeugt. Nach der Linearisierung reinigen Sie die Vorlagen-DNA durch Phenol / Chloroform-Extraktion und anschließende Ethanolfällung. Verwenden Sie Standardprotokolle.
   2. 1 μg gereinigte Template-DNA in ein RNase-freies Zentrifugenröhrchen geben. Stellen Sie das Zentrifugenrohr auf Eis. Fügen Sie dem Gesamtvolumen von 13 μL genügend DEPC-behandeltes Wasser hinzu.
      1. Fügen Sie dann die folgenden Reagenzien der Reihe nach hinzu: 2 μL 10x NTP-Markierungsmischung, 2 μL 10x Transkriptionspuffer, 1 μL Protektor-RNase-Inhibitor, 2 μL RNA-Polymerase SP6 oder RNA-Polymerase T7.
   3. Mischen Sie die Reaktion durch Pipettieren und zentrifugieren Sie in Kürze. 2 h bei 37 °C inkubieren.
      HINWEIS: Längere Inkubationen erhöhen nicht die Ausbeute an markierter RNA. Ein kurzer Spin (~ 800 U / min), der auf das Reaktionsrohr angewendet wird, ist kritisch, bevor mit dem nächsten Schritt fortgefahren werden kann. Dieser Spin ermöglicht es, dass alle Inhalte, die sich aus der Inkubation ergeben könnten, auf den Boden der Röhre gelangen.
   4. Fügen Sie 2 μL RNase-freie DNase I hinzu, um die Vorlagen-DNA zu entfernen, und inkubieren Sie für 15 min bei 37 °C.
   5. Fügen Sie 2 μL 200 mM EDTA (pH 8,0) hinzu, um die Reaktion zu stoppen.
      HINWEIS: DIG-markierte RNA-Sonden können ein Jahr lang bei -15 bis -25 °C in Ethanol gelagert werden.
2. Prähybridisierung des Drosophila-Embryonenschnitts
   1. Legen Sie Abschnitte des Drosophila-Embryos für 48 h in einen 42 ° C-Ofen.
   2. Deparaffinisieren Sie die Objektträger zweimal für 10 min in 100% Xylol.
   3. Hydratisieren Sie die Objektträger, indem Sie nacheinander in 100% Ethanol, 95% Ethanol, 90% Ethanol, 70% Ethanol und 50% Ethanol für 5 Minuten eintauchen.
   4. Inkubieren Sie die Objektträger in PBS für 5 min 3 mal, um die Fixierlösung / Bouins Lösung aus dem Gewebe zu entfernen.
   5. Waschen Sie die Objektträger mit 100 mmol / L Glycin / PBS-Lösung 2 mal für jeweils 5 Minuten.
   6. Waschen Sie die Dias mit PBS 2 mal für jeweils 5 Minuten.
   7. Inkubieren Sie die Objektträger mit 0,3% Triton X-100 in PBS für 15 Minuten, um die Membranen zu permeabilisieren.
   8. Waschen Sie die Dias mit PBS 3 mal für jeweils 5 Minuten.
   9. Inkubieren Sie die Objektträger in 15 μg/ml RNase-freier Proteinase K für 30 Minuten bei 37 °C.
   10. Inkubieren Sie die Objektträger mit 4% Paraformaldehyd in PBS für 3 Minuten, um die Verdauung zu stoppen.
   11. Waschen Sie die Dias mit PBS 2 mal für jeweils 5 Minuten.
   12. Inkubieren Sie die Objektträger in 100 mM Triethanolamin-Puffer (pH 8,0) mit 0,25% (v/v) Essigsäureanhydrid 2 mal für jeweils 5 min.
   13. Geben Sie DEPC-Wasser in die Feuchtigkeitskammer des Objektträgers. Fügen Sie 20 μL Vorhybridisierungslösung (mit 100 μg/ml Lachssperma-DNA) auf die Objektträger hinzu. Legen Sie die Dias in die Feuchtigkeitskammer des Objektträgers. Inkubieren Sie die Dias bei 42 °C für 4 h.
       HINWEIS: Es ist notwendig, die Dichtheit des Deckels der Nassbox sicherzustellen und sicherzustellen, dass die Nassbox immer in einer Horizontalen gehalten wird, um eine Verflüchtigung und Abweichung vom Gewebe der Vorhybridisierungslösung und der folgenden Hybridisierungslösung zu verhindern.
3. Hybridisierung des Drosophila-Embryonenschnitts
   1. Entfernen Sie die Vorhybridisierungslösung und waschen Sie die Objektträger mit 0,2x SSC (150 mM Natriumchlorid, 15 mM Natriumcitrat, pH 7,0) 3 mal für jeweils 5 Minuten. Wischen Sie überschüssige 0,2x SSC um die Gewebeproben ab.
   2. 30 μL Sondenhybridisierungslösung (mit 2-6 ng Digoxin-markierter RNA-Sonde durch Verdünnung in Vorhybridisierungslösung) mit einer Pipette auftragen. Inkubieren Sie die Objektträger in der Objektträgerfeuchtekammer bei 42 °C für ca. 20 h.
      HINWEIS: Achten Sie auf die Dichtheit der Kappe als Vorschlag der letzten Note. Andernfalls erzeugt die Austrocknung, die durch das Auslaufen von entweder vor der Hybridisierung oder vor der Hybridisierung verursacht wird, einen schmutzigen Hintergrund, einschließlich pseudopositiver Folien.
4. Hybridisierung
   1. Entfernen Sie die Hybridisierungslösung und waschen Sie die Objektträger mit 4x SSC-Lösung 4 mal für jeweils 15 min bei 37 °C.
   2. Waschen Sie die Objektträger in 2x SSC-Lösung mit 20 μg/ml RNase A für 30 min bei 37 °C.
   3. Waschen Sie die Objektträger in 1x SSC-Lösung für 15 min bei 37 °C.
   4. Waschen Sie die Objektträger in 0,5x SSC-Lösung für 15 min bei 37 °C.
   5. Waschen Sie die Objektträger in 0,1x SSC-Lösung für 15 min bei 37 °C.
   6. Waschen Sie die Dias mit PBS 3 mal für jeweils 5 Minuten.
   7. Waschen Sie die Objektträger in Waschpuffer (100 mM Maleinsäure, 150 mM NaCl, 0,3% (v/v) Tween 20, pH 7,5) für 1 min.
   8. Die Objektträger in 100 ml frisch zubereiteter Blockierlösung (2% Schafserum in Maleinsäurepuffer ohne Tween 20) 30 Minuten lang inkubieren.
   9. Inkubieren Sie die Objektträger in 20 ml Antikörperlösung für 45 Minuten.
      1. Zentrifugieren Sie den Antikörper vor jedem Gebrauch 5 min bei 10.000 U / min in der Originaldurchstechflasche und pipettieren Sie die erforderliche Menge vorsichtig von der Oberfläche. Verdünnen Sie Anti-Digoxigenin-AP 1:5000 (150 mU/ml) in blockierender Lösung.
   10. Waschen Sie die Objektträger in 100 ml Waschpuffer 2 Mal für jeweils 15 Minuten, um ungebundenes Antikörperkonjugat zu entfernen.
   11. Ausgleich der Objektträger in 20 mL Detektionspuffer (100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 9,5) für 2-5 min.
   12. Bebrüten Sie die Objektträger mit 10 ml frisch zubereiteter farbiger Substratlösung in der Objektträgerfeuchtekammer. Die Reaktion beginnt innerhalb weniger Minuten und ist nach 16 h abgeschlossen. Nicht schütteln oder mischen, während sich Farbe entwickelt.
   13. Waschen Sie die Objektträger mit 50 ml destilliertem Wasser für 5 Minuten, um die Reaktion zu stoppen.
   14. Trocknen Sie die Probe über Nacht im Dunkeln.
   15. Dehydrieren Sie die Objektträger in 70% Ethanol, 80% Ethanol, 90% Ethanol, 95% Ethanol, 100% Ethanol I und 100% Ethanol II für jeweils 3 Minuten.
   16. Löschen Sie die Objektträger in 100% Xylol I, 100% Xylol II und 100% Xylol III für jeweils 20 Minuten.
   17. Montieren Sie die Dias mit neutralem Balsam.
   18. Dokumentieren Sie Bilder und analysieren Sie sie mit der invertierten Mikroskopie- und Herstellersoftware. Führen Sie eine Verteilungsanalyse mit ImageJ entsprechend der Dichte des positiven Signals entweder entlang der Längsachse oder innerhalb der differentiellen Zone von Embryonen durch.
       HINWEIS: Während der Inkubation mit der frisch zubereiteten Farbsubstratlösung im Schritt 7.4.12 ist die Reaktionsfarbe bereits mit bloßem Auge zu erkennen. Diese Beobachtung, wie die Farbentwicklung unter Stereoskop inspiziert werden kann. Sobald die Reaktionsfarbe angemessen ist und der Schritt 7.4.13 durchgeführt werden kann, um die Reaktion zu stoppen.

Ergebnisse

Die Abbildungen beschreiben Protokolle, die verwendet werden, um die Herausforderung zu meistern, hochlipidreiche und chitinhaltige Chorion-Drosophila-Embryonen (Tabelle 1) zur Untersuchung und zum Experimentieren an der Glasobjektträgeroberfläche zu befestigen. Unter Verwendung der in Abbildung 1 gezeigten Chromalaun-Gelatine-Objektträgermethode haben wir die Bindung von Drosophila-Embryonen an die Oberfläche von Objektträgern verbessert, während die...

Diskussion

Die durch RyRs und IP3Rs vermittelte Kalziumsignalisierung ist ein grundlegender Weg in vielen physiologischen und pathologischen Prozessen von Wirbeltieren und wirbellosen Tieren1,2,3,4. Beim Menschen führen Punktmutationen, wie die CPVT-assoziierte R4496C-Mutation, im RyR2-Gen zu einem Kalziumverlust aus dem sarkoplasmatischen Retikulum des Kardiomyozyten, was zu einer Herzfunktionsstörung ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
-20°C Refrigerator	Meiling Biology &Medical	DW-YL270	Used for regent storage
-80°C Ultra low temperature refrigerator	Thermo	Forma 90 Series	Used for regent storage
Agar	Sigma-Aldrich	WXBB6360V	Preparation of grape juice agar plates
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments	Roche	11093274910	For the detection of digoxigenin-labeled compound
Biochemical incubator	Shanghai Bluepard Instruments	LRH-250	In-situ Hybridization
Bouin's solution	Sinopharm Chemical Reagent at Beijing	69945460	Drosophila Embryo Embedding
Centrifuge	Eppendorf	540BH07808	In-situ Hybridization
Centrifuge tube	Denville	C-2170	Drosophila Embryo Collection
Chrome Alum	Sinopharm Chemical Reagent at Beijing	10001018	Coating Slides
Constant temperature water bath	Jintan Henfeng Instruments	KW-1000DC	Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Dako REAL EnVision Detection System	Dako	K5007	In immunohistochemical reaction or in situ hybridization reaction, it binds to the primary antigen antibody, and the target is labeled by staining.
DEPC	Sigma-Aldrich	D5758	In-situ Hybridization
DIG RNA Labeling Kit	Roche	11093274910	RNA labeling with diagoxigenin-UTP by in vitro transcription with SP6 and T7 RNA polymerase
Drosophila melanogaster	Bloomington Stock Center	BDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664	The stocks of Drosophila melanogaster mutant
Electric blast drying oven	Tianjin Taiste Instruments	101-0AB	For coating slides and paraffin embedding
Eosin	Sigma-Aldrich	230251	Hematoxylin-Eosin Staining
Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent at Beijing	100092680	Paraffin Embedding, Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Gelatin	Sinopharm Chemical Reagent at Beijing	10010328	Coating Slides
Gold chloride	Sigma-Aldrich	379948	Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Hematoxylin	Sigma-Aldrich	H3136	Hematoxylin-Eosin Staining
High Pure PCR Product Purification Kit	Roche	11732668001	For purification of PCR products
Intelligent constant temperature and humidity box	Ningbo Jiangnan Instruments	HWS	For fly maintenance
LE Agarose	HyAgarose	14190108029	Pre-embedding
Methanol	Sinopharm Chemical Reagent at Beijing	10014108	Drosophila Embryo Collection
Microscope	ZEISS	Observer.A1	Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Microscope Slides	MeVid Labware Manufacturing	P105-2001	Coating Slides
Neutral Gum	Sinopharm Chemical Reagent at Beijing	10004160	Hematoxylin-Eosin Staining
N-heptane	Sinopharm Chemical Reagent at Beijing	40026768	Drosophila Embryo Collection
Paraffin slicer	Huahai science instrument	HH-2508III	In-situ Hybridization
Paraffin	Sinopharm Chemical Reagent at Beijing	69019461	Paraffin Embedding
pH/mV Meter	Sartorius	PB-10	For determing the pH value of a solution
Silver nitrate	Sinopharm Chemical Reagent at Beijing	10018461	Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Ultrapure water meter	Thermo	AFXI-0501-P	In-situ Hybridization
Xylene	Sinopharm Chemical Reagent at Beijing	10023418	Paraffin Embedding