Identifizierung von EGFR- und RAS-Inhibitoren mittels Caenorhabditis elegans

Zusammenfassung

Der genetisch traktierbare Fadenwurm Caenorhabditis elegans kann als einfaches und kostengünstiges Modell für die Wirkstoffforschung verwendet werden. Hier wird ein Protokoll zur Identifizierung von Krebsmedikamenten beschrieben, die die nachgeschaltete Signalübertragung von RAS- und EGFR-Proteinen hemmen.

Zusammenfassung

Die Veränderungen in der Plasmamembranlokalisierung des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR) und seines nachgeschalteten Effektors RAS wurden mit mehreren Krankheiten einschließlich Krebs in Verbindung gebracht. Der freilebende Fadenwurm C. elegans besitzt eine evolutionäre und funktionell konservierte EGFR-RAS-ERK MAP-Signalkaskade, die für die Entwicklung der Vulva zentral ist. Der Gewinn von Funktionsmutationen im RAS-Homolog LET-60 und EGFR-Homolog LET-23 induziert die Erzeugung von sichtbaren nicht-funktionellen ektopischen Pseudovulva entlang der ventralen Körperwand dieser Würmer. Bisher wurde gezeigt, dass der multivulvale (Muv) Phänotyp in diesen Würmern durch kleine chemische Moleküle gehemmt wird. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Verwendung des Wurms in einem flüssigkeitsbasierten Assay, um Inhibitoren zu identifizieren, die die Aktivitäten von EGFR- und RAS-Proteinen aufheben. Mit diesem Assay zeigen wir, dass R-Fendalin, ein indirekter Inhibitor von K-RAS, den Muv-Phänotyp unterdrückt, der in den mutierten Würmern let-60(n1046) und let-23(sa62) exprimiert wird. Der Assay ist einfach, kostengünstig, nicht zeitaufwendig einzurichten und kann als erste Plattform für die Entdeckung von Krebstherapeutika verwendet werden.

Einleitung

Die zellulären Wege, die Entwicklungsereignisse innerhalb von Organismen regulieren, sind bei allen Metazoen hoch konserviert. Ein solcher Signalweg ist die EGFR-RAS-ERK-Signalkaskade (MITOGEN Activated Protein Kinase( MAPK), die ein kritischer Signalweg ist, der die Zellproliferation, Differenzierung, Migration und das Überleben steuert^1,2. Defekte in diesem Signalweg können zu pathologischen oder Krankheitszuständen wie Krebs führen. Der epidermale Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) hat sich in menschlichen Tumoren, einschließlich 50% der oralen Plattenepithelkarzinome, als hoch exprimiert erwiesen und trägt zur Entwicklung bösartiger Tumoren bei^3,4,5. Während Mutationen in den drei RAS-Isoformen H-, K- und N-RAS wichtige Treiber für die maligne Transformation bei mehreren menschlichen Krebsarten sind. Unter diesen drei RAS-Isoformen sind onkogene Mutationen in K-RAS am häufigsten^6,7,8. Damit EGFR und RAS funktionieren, müssen sie auf der Plasmamembran (PM) lokalisiert werden. Die Verhinderung der Lokalisierung dieser Moleküle zum PM kann die biologische Aktivität dieses Signalwegs vollständig aufheben^9,10. Daher ist die Hemmung der Lokalisation dieser Proteine zum PM eine therapeutische Strategie, um die nachgelagerte Signalübertragung und die daraus resultierenden unerwünschten Ergebnisse zu blockieren. Mit einem High-Content-Screening-Assay wurde Fendilin, ein L-Typ-Kalziumkanalblocker, als Inhibitor der K-RAS-Aktivität¹¹identifiziert. Die Nanoclusterung von K-RAS auf das innere Blättchen des PM wird in Gegenwart von Fendilin signifikant reduziert. Darüber hinaus wird K-RAS von der Plasmamembran auf das endoplasmatische Retikulum (ER), den Golgi-Apparat, die Endosomen und das Zytosol umverteilt. Noch wichtiger ist, dass die Proliferation von Bauchspeicheldrüsen-, Dickdarm-, Lungen- und Endometriumkarzinomzelllinien, die onkogene mutierte K-RAS exprimieren, durch die Hemmung der nachgeschalteten Signalübertragung durch Fendilin¹¹blockiert wird. Diese Daten deuten darauf hin, dass Fendilin als spezifisches K-RAS-Antikrebstherapeutikum fungiert, das die Fehllokalisierung des RAS-Proteins auf das PM verursacht.

Der Fadenwurm Caenorhabditis elegans wurde im Kontext der Entwicklung umfassend untersucht. Viele der Signalwege, die die Entwicklung im Wurm steuern, sind evolutionär und funktionell konserviert. Beispielsweise bleibt die EGFR-vermittelte Aktivierung von RAS und die anschließende Aktivierung der ERK-MAPK-Signalkaskade im Wurm¹²erhalten. Die Kaskade wird durch folgende Proteine dargestellt: LET-23 > LET-60 > LIN-45 > MEK-2 > MPK-1. LET-60 ist homolog zu RAS, während LET-23 homolog zu EGFR ist. Im Wurm reguliert dieser Weg die Entwicklung der Vulva¹³. Die Vulva ist eine epitheliale Öffnung an der ventralen Körperwand des Wurms, die es ermöglicht, befruchtete Eier zu legen. Die Bildung der Vulva im Wurm ist abhängig von der Exposition der Vulvavorläuferzellen (VPC) gegenüber einem Aktivierungsgradienten der EGFR-RAS-MAPK-Signalkaskade. Während der normalen Entwicklung erhalten die proximalen VPCs starke Signale von den Gonadenankerzellen, um sich in 1° und 2° Zellschicksale zu differenzieren, die zu einer funktionellen Vulva^{führen 12}. Während sich distale VPCs in 3° Zellschicksale differenzieren, die mit dem hypodermalen Synzytium verschmelzen und aufgrund erschöpfter Signalübertragung keine Vulva bilden. In Ermangelung einer Signalübertragung differenzieren sich alle VPCs in 3° Zellschicksale, was zur Bildung keiner Vulva führt. Die konstitutive Signalgebung führt jedoch zur Bildung einer oder mehrerer nichtfunktionaler Vulva aufgrund der Induktion aller VPCs, 1° und 2° Zellschicksale anzunehmen.

Mutationen, die eine fehlerhafte oder übermäßige Vulvainduktion verursachen, wurden für viele der Gene identifiziert, die für Proteine kodieren, die diesen Weg repräsentieren. Eine defekte Vulvainduktion führt zu einem vulvalosen (Vul) Phänotyp, während eine übermäßige Vulvainduktion zu einem Multivulva (Muv) Phänotyp führt, der durch die Entwicklung zahlreicher nichtfunktioneller ektopischer Pseudovulvae in der gesamten ventralen Körperwand dargestellt wird. Der Muv-Phänotyp, der durch den let-60(n1046)-Stamm exprimiert wird, ist auf einen Gewinn der Funktionsmutation in RAS zurückzuführen, während er im let-23(sa62)-Stamm auf eine aktivierende Mutation in EGFR^14,15zurückzuführen ist. Es wurde gezeigt, dass der starke Muv-Phänotyp in diesen mutierten Stämmen durch pharmakologische Eingriffe gestört^wird,wie die Behandlung von let-60(n1046)-Würmern mit dem MEK-1-Inhibitor U0126¹⁶,¹⁷gezeigt hat. Interessanterweise haben wir gezeigt, dass R-Fendilin und Inhibitoren, die den Sphingomyelin-Stoffwechsel beeinflussen, den Muv-Phänotyp im Wurm unterdrücken¹⁸. Um zu demonstrieren, dass diese Inhibitoren die Let-60-Signalisierung auf RAS-Ebene blockieren, wurde der Lin-1-Nullstamm ^{verwendet 17}. Lin-1 ist ein Ets-like inhibitorischer Transkriptionsfaktor, der als Repressor bei der Entwicklung der Vulva^{19 fungiert.} Eine starke Reversion des Muv-Phänotyps bei let-60(n1046)-Würmern und keine Wirkung auf Lin-1-Nullwürmer deuten darauf hin, dass diese Hemmungen auf der Ebene von RAS auftreten.

In diesem Protokoll demonstrieren wir die Verwendung von C. elegans als Modell zur Identifizierung von Inhibitoren von RAS- und EGFR-Proteinen. Mit einem flüssigkeitsbasierten Assay demonstrieren wir die hemmende Wirkung von R-Fendilin, indem wir die Muv-Phänotypen in den let-60(n1046) und let-23(sa62) mutanten Stämmen von C. elegansunterdrücken. Dieser Assay validiert die Verwendung von C. elegans als Werkzeug in der Anfangsphase der Wirkstoffforschung für Krebstherapeutika.

Protokoll

1. Nematodenwachstumsmedium (NGM) Plattenvorbereitung

1. 2,5 g Pepton und 3 g NaCl werden zu 970 ml entionisiertem Wasser in einem 2-L-Erlenmeyerkolben hinzugefügt. Inhalt mit einem magnetischen Rührstab umrühren. Danach 20 g Agar in den Kolben geben. Autoklavieren Sie den Inhalt des Kolbens bei 121 °C und einem Druck von 15 lb/in² für 30 min. Nach der Sterilisation den Kolben auf eine Rührplatte legen und das Medium abkühlen lassen, bis die Temperatur 50 °C erreicht.
2. Zur Herstellung der NGM-Platten werden dem abgekühlten Medium folgende Reagenzien zugesetzt: 25 ml 1 M Kaliumphosphatpuffer (pH = 6,0), 1 ml 1 M_MgSO4,1 ml 1 M_CaCl2,1 ml (5 mg/ml in 95% Ethanol) Cholesterin, 1 ml (10% v/w ethanol) Nystatin und 1 ml 25 mg/ml Streptomycin.
3. Unter einer laminaren Strömung das abgekühlte Medium in 60 mm x 15 mm sterile Petrischalen gießen. Lassen Sie die Platten für 2 h erstarren. Diese Platten können 1 Monat bei 4 °C aufbewahrt werden.

2. Ausbreitung von C. elegans

1. 100 μL über Nacht gewachsenes E. coli OP50 auf die Mitte jeder NGM-Platte aufstellen und die Platten 24 Stunden in einer laminaren Haube trocknen lassen. Anschließend können die Platten in einem Polystyrolbehälter gelagert werden.
   HINWEIS: Die E. coli OP50-Kultur wird vor der Aussaat der Platten in Luria-Bertani (LB)-Medien bei 37 °C-Medien angebaut. Die Kultur kann bei 4 °C für 1–2 Monate gelagert und für die periodische Aussaat von Platten verwendet werden.
2. Sammeln Sie mit einem sterilen Wurmpickel 10-12 gravidierte erwachsene Würmer von einer zuvor gewachsenen Platte unter einem Seziermikroskop. Diese Würmer auf eine frische NGM-Platte mit E. coli OP50 geben und die Platte 24 h bei 20 °C bebrüten.
3. Nach 24 h mit einem sterilen Wurmpickel erwachsene Würmer von den Platten entfernen. Inkubieren Sie die Platten bei 20 °C für ~ 3 Tage. Embryonen entwickeln sich zu graviden erwachsenen Würmern.

3. Herstellung einer synchronen C. elegans Kultur

1. Sammeln Sie gravide erwachsene Würmer in einem konischen 15-ml-Röhrchen, indem Sie 2-4 Platten mit M9W waschen.
   1. Herstellung von M9W: 5 g NaCl, 6 g_Na2HPO4und 3 g_KH2PO4in entionisiertem Wasser zu_einem Endvolumen von 1 L auflösen. Autoklaven Sie die Lösung bei 121 °C bei einem Druck von 15 lb/in² für 30 min. 1 ml 1 M MgSO₄ wird der gekühlten Lösung hinzugefügt.
2. Pelletieren Sie die Würmer, indem Sie das Röhrchen bei 450 x g für 1 min zentrifugieren. Dekantieren Sie den Überstand, ohne das Wurmpellet zu stören.
3. Bereiten Sie die Wurmlyselösung vor, indem Sie 400 μL 8,25% Natriumhypochlorit (Haushaltsbleiche) und 100 μL 5 N NaOH kombinieren. Fügen Sie diese Lösung dem Wurmpellet hinzu und streichen Sie das Röhrchen, um den Inhalt des Röhrchens zu mischen. Verhindern Sie ein Überblenken der Embryonen in der Röhre, indem Sie die Lyse der Würmer unter einem Seziermikroskop beobachten.
4. Fügen Sie 10 ml M9W in das konische Röhrchen hinzu, um die Lysemischung zu verdünnen, wenn 70% der erwachsenen Würmer lysiert haben.
5. Zentrifugen Sie das Röhrchen bei 450 x g für 1 min. Ersetzen Sie den Überstand durch 10 ml M9W.
6. Wiederholen Sie Schritt 3.5 zweimal.
7. Nach Abschluss der Waschschritte 3-5 ml M9W hinzufügen, um das Eierpellet wieder zu resuspendieren. Drehen Sie das Rohr über Nacht mit einer Drehzahl von 18 U/ min auf einem Rohrrotator bei Raumtemperatur (RT).
8. Nach der Inkubation über Nacht das Röhrchen aus dem Rotator entfernen, die L1-Larven pelletieren, indem Sie das Röhrchen bei 450 x g für 1 min zentrifugieren. Saugen Sie den M9W an, bis 250 μL im Röhrchen verbleiben.
9. Schütteln Sie das Röhrchen, um die Larven wieder zu besieden. Geben Sie drei 5 μL Tropfen mit den Larven auf einen Petrischalendeckel. Mit einem Seziermikroskop zählen Sie die Anzahl der Würmer in jedem Tropfen und bestimmen Sie die Anzahl der Würmer in 1 μL.

4. Erstellung von Drug Assays

HINWEIS: Die Schritte in diesem Assay sind in Abbildung 1 dargestellt.

1. 30 ml E. coli OP50 in einem konischen 50 mL Rohr bei 37 °C über Nacht in einem Orbitalschüttler bei 150 U/min züchten.
2. Über Nacht gewachsene E. coli OP50-Kultur bei 4.000 x g für 10 minuten spinnen, um die Zellen zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand und schleudern Sie das Pellet in 3 ml M9W wieder auf, um die Kultur zu konzentrieren.
3. Bevor Sie die Arbeitslösungen für den Wirkstofftest vorbereiten, fügen Sie 0,1 ml (5 mg / ml in 95% Ethanol) Cholesterin in 100 ml M9W hinzu.
4. Bereiten Sie Arbeitslösungen jedes experimentellen Arzneimittels vor, indem Sie jedes Arzneimittel plus Vehikel (Dimethylsulfoxid; DMSO) in 4,8 ml M9W mit Cholesterin ergänzt, um die entsprechenden Konzentrationen zu erhalten. Lösen Sie DMSO in 4,8 ml M9W auf, ergänzt mit Cholesterin, um die Fahrzeugkontrolle vorzubereiten.
5. Fügen Sie 200 μL konzentrierte E. coli OP50-Kultur zu jedem Röhrchen hinzu, das die Fahrzeugkontrolle oder Medikamente und Wirbelröhrchen enthält, um sicherzustellen, dass sie gemischt werden.
6. Um das Experiment durchzuführen, fügen Sie 2 ml jeder funktionierenden Arzneimittellösung oder Fahrzeugkontrolle zu jeder Vertiefung in einer 12-Well-Gewebekulturplatte hinzu. Testen Sie jede Arzneimittelkonzentration und Fahrzeugkontrolle in doppelter Ausfertigung.
7. Fügen Sie ~ 100 L1-Larven pro Vertiefung hinzu (siehe synchrone C. elegans-Kulturschritte) mit einer sterilen Mikropipette. Begrenzen Sie das Volumen der Würmer auf 10 μL.
8. Inkubieren Sie die Platten bei 20 °C.
9. Ergänzen Sie die Vertiefungen bei Bedarf am Tag 3 des Assays mit 50 μL 10x konzentriertem E. coli OP50.

5. Agarose-Pad-Vorbereitung für die Mikroskopie

1. Bereiten Sie eine 2% ige w / v-Lösung von Agarose vor, indem Sie 0,1 g Agarose in 5 ml deionisiertem Wasser auflösen. Erhitzen Sie den Inhalt in einer Mikrowelle, um die Agarose aufzulösen. Aus 5 ml Agaroselösung können 20 Objektträger hergestellt werden.
2. Legen Sie Streifen von Laborband entlang zweiErglasobjektträger. Das Band fungiert als Abstandshalter, die die Dicke der Agarose-Pads begrenzen. Danach legen Sie ein drittes sauberes Glasobjektträger zwischen die geklebten Dias.
3. Um ein Agarose-Pad herzustellen, stellen Sie 100 μL geschmolzene Agarose auf die Mitte des sauberen Objektträgers. Legen Sie einen weiteren sauberen Glasträger über und auf die Agarose und drücken Sie vorsichtig nach unten, um ein Pad zu bilden. Entfernen Sie den oberen Schlitten, wenn das Pad erstarrt ist.

6. Beobachtung des Muv-Phänotyps in den Stämmen let-60, let-23 und lin-1

HINWEIS: Nur Kandidatenmedikamente, die die Muv-Phänotypen in let-23- und let-60-Stämmen unterdrücken, werden mit dem lin-1-Stamm untersucht, um festzustellen, ob die Hemmung auf der Ebene von RAS oder EGFR auftritt.

1. Wenn das entsprechende Stadium des Lebenszyklus erreicht ist (3 Tage für die Stämme let-60 und let-23, 5 Tage für den lin-1-Stamm), entfernen Sie die Platten aus dem Inkubator. und sammeln Sie die Würmer in 15 ml konischen Röhrchen mit einer Pipette.
2. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 450 x g für 1 min. Entfernen Sie M9W, ohne das Wurmpellet zu stören, und fügen Sie 5 mL frisches M9W hinzu.
3. Wiederholen Sie Schritt 6.2 zweimal.
4. Ohne das Wurmpellet zu stören, entfernen Sie alle verbleibenden M9W durch Aspiration. Danach 500 μL 2 mM Natriumazid oder 2 mM Tetramisolhydrochlorid hinzufügen. Lassen Sie die Röhrchen bei RT für 15 min. 2 mM Natriumazid oder 2 mM Tetramisolhydrochlorid anästhesieren die Würmer für die Bildgebung.
   ACHTUNG: Achten Sie darauf, beim Umgang mit Natriumazid persönliche Schutzausrüstung (PSA) zu tragen. Die Lösung muss unter einer chemischen Haube hergestellt werden.
5. Fügen Sie 10 μL der anästhesierten Wurmsuspension auf die Mitte eines Agarose-Pads hinzu. Legen Sie einen #1,5-Abdeckel vorsichtig über die Schneckenaufhängung. Bei Bedarf den Abdeckklip mit etwas Nagellack fixieren, um ein Austrocknen zu verhindern.
6. Verwenden Sie ein DIC-Mikroskop, um die Stämme let-60(n1046), let-23(sa62) und lin-1(sy254) zu beobachten. Stellen Sie sich die Würmer bei den 10- und 20-fachen Vergrößerungen vor.
7. Für let-60(n1046) und let-23(sa62) bewerten Sie die erwachsenen Würmer basierend auf dem Vorhandensein oder Fehlen des Muv-Phänotyps. Zählen Sie für den Lin-1-Stamm die Anzahl der VPCs, die 1 ° oder 2 ° -Zellschicksale auf der ventralen Seite der L4-Larven mit einem hochauflösenden DIC-Mikroskop angenommen haben.
8. Nachdem Sie die Mikroaufnahmen für jeden Stamm und jede medikamentöse Behandlung bewertet haben, führen Sie den t-Testdes Schülers durch, um die statistischen Unterschiede zwischen den Behandlungen zu bestimmen.

Ergebnisse

Wir zeigen zunächst, dass R-Fendilin in der Lage ist, den Muv-Phänotyp im let-60(n1046)-Mutantenstamm im Vergleich zu den DMSO-behandelten Würmern zu unterdrücken. Unsere Daten zeigen, dass R-Fendilin in der Lage ist, den Muv-Phänotyp im let-60(n1046) dosisabhängig zu blockieren (Abbildung 2A,B). Eine Nichtumkehr des Muv-Phänotyps wurde jedoch im lin-1-Nullmutantenstamm als Reaktion auf steigende Konzentrationen von R-Fendilin beobachtet

Diskussion

Die Assays, die wir mit dem Wurm beschreiben, sind einfach und kostengünstig, um Inhibitoren der EGFR- und RAS-Funktion zu identifizieren. C. elegans ist ein attraktives Modell für die Wirkstoffforschung, da es aufgrund des kurzen Lebenszyklus (3 Tage bei 20 °C) und der Fähigkeit, eine große Anzahl von Larven zu erzeugen, leicht im Labor zu züchten ist. Noch wichtiger ist, dass der EGFR-RAS-ERK-MAPK-Signalweg evolutionär und funktionell konserviert wird, wobei Säugetiere ein genetisch handhabbares System...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Media and chemicals
Agarose	Millipore Sigma	A9539-50G
Bacto Peptone	Fisher Scientific	DF0118-17-0
BD Difco Agar	Fisher Scientific	DF0145-17-0
BD Difco LB Broth	Fisher Scientific	DF0446-17-3
Calcium Chloride	Fisher Scientific	BP510-500
Cholesterol	Fisher Scientific	ICN10138201
Magnesium Sulfate	Fisher Scientific	BP213-1
Nystatin	Acros organics	AC455500050
Potassium Phosphate Dibasic	Fisher Scientific	BP363-500
Potassium pPhosphate Monobasic	Fisher Scientific	BP362-500
R-Fendiline			Commercially Synthesized (Pharmaceutical grade)
Sodium Azide	Millipore Sigma	S2002-25G
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-1
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	SS266-1
8.25% Sodium Hypochlorite			Bleach
Sodium Phosphate Dibasic	Fisher Scientific	BP332-500
Streptomycin Sulfate	Fisher Scientific	BP910-50
(−)-Tetramisole Hydrochloride	Millipore Sigma	L9756
UO126 (MEK inhibitor)	Millipore Sigma	19-147
Consumables
15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	12-565-269
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	12-565-271
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL	Fisher Scientific	07-200-574
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL	Fisher Scientific	07-200-575
No. 1.5  18 mm X 18 mm Cover Slips	Fisher Scientific	12-541A
Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm)	Fisher Scientific	FB0875713A
Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm)	Fisher Scientific	FB0875712
Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm)	Fisher Scientific	12-544-4
12- Well Tissue Culture Plates	Fisher Scientific	50-197-4804
Software
Prism	Graphpad
Bacterial Strains
E. coli OP50
Worm Strains
Strain	Genotype	Transgene	Source
MT2124	let-60(n1046) IV.		CGC
MT7567	lin-1(sy254) IV.		CGC
PS1839	let-23(sa62) II.		CGC