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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Das aktuelle Protokoll beschreibt eine Methode zur DNA-Isolierung aus Blutproben und Darmbiopsien, die Generierung von TCRβ- und IGH-PCR-Bibliotheken für die Sequenzierung der nächsten Generation, die Durchführung eines NGS-Laufs und die grundlegende Datenanalyse.

Zusammenfassung

Das immunologische Gedächtnis, das Kennzeichen der adaptiven Immunität, wird durch T- und B-Lymphozyten orchestriert. Im Kreislauf und in verschiedenen Organen gibt es Milliarden von einzigartigen T- und B-Zellklonen, und jeder kann ein spezifisches Antigen binden, was zu Proliferation, Differenzierung und / oder Zytokinsekretion führt. Die enorme Heterogenität in T- und B-Zellen wird durch zufällige Rekombination verschiedener genetischer Segmente erzeugt. Next-Generation-Sequencing-Technologien (NGS), die in den letzten zehn Jahren entwickelt wurden, ermöglichen einen beispiellosen detaillierten Einblick in das Immunrepertoire der T- und B-Zellrezeptoren. Studien zu verschiedenen entzündlichen Erkrankungen, Immundefekten, Infektionen und Malignomen zeigten deutliche Veränderungen der Klonalität, der Gennutzung und der biophysikalischen Eigenschaften des Immunrepertoires und lieferten wichtige Erkenntnisse über die Rolle adaptiver Immunantworten bei verschiedenen Erkrankungen.

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für NGS des Immunrepertoires von T- und B-Zellen aus Blut und Gewebe zur Verfügung. Wir präsentieren eine Pipeline, die von der DNA-Isolierung über die Bibliotheksvorbereitung, die Sequenzierung auf NGS-Sequenzierern bis hin zu grundlegenden Analysen beginnt. Diese Methode ermöglicht die Erforschung spezifischer T- und B-Zellen auf Nukleotid- oder Aminosäureebene und kann so dynamische Veränderungen in Lymphozytenpopulationen und Diversitätsparametern bei verschiedenen Erkrankungen identifizieren. Diese Technik kommt langsam in die klinische Praxis und hat das Potenzial für die Identifizierung neuartiger Biomarker, Risikostratifizierung und Präzisionsmedizin.

Einleitung

Das adaptive Immunsystem, bestehend aus T- und B-Lymphozyten, nutzt das immunologische Gedächtnis, um ein zuvor angetroffenes Antigen zu erkennen und eine schnelle Reaktion einzuleiten. Lymphozyten werden im Knochenmark erzeugt und reifen im Thymus (T-Zellen) oder Knochenmark (B-Zellen). Sowohl der T-Zell-Rezeptor (TCR) als auch der B-Zell-Rezeptor (BCR) weisen einzigartige Konfigurationen auf, die die Erkennung spezifischer Antigene ermöglichen. In der Homöostase zirkulieren T- und B-Zellen ständig und untersuchen die Billionen verschiedener Peptide, die auf Antigen-präsentierenden Zellen präsentiert werden. Die TCR- oder BCR-Ligatur eines spezifischen Antigens mit hoher Affinität führt zusammen mit einer geeigneten Co-Stimulation zur Zellaktivierung, was im Falle von B-Zellen zu Zytokinsekretion, klonaler Expansion und Generierung von Antikörpern führt.

Die enorme Vielfalt der verschiedenen T- oder B-Zellen wird zusammenfassend als Immunrepertoire bezeichnet und ermöglicht das Erkennen unzähliger verschiedener Epitope. Um ein so großes Repertoire zu generieren, findet ein komplexer Prozess der zufälligen Anordnung verschiedener Gensegmente statt, wodurch nahezu endlose Kombinationen von Rezeptoren entstehen, die einzigartige Antigene binden können1. Dieser Prozess, der als V(D)J-Rekombination bezeichnet wird, umfasst Umlagerungen verschiedener variabler (V), Diversität (D) und verbindende (J) Gene, begleitet von zufälligen Deletionen und Insertionen von Nukleotiden in den Verbindungen2.

Die Architektur des adaptiven Immunsystems interessiert Wissenschaftler in verschiedenen Bereichen seit vielen Jahrzehnten. In der Vergangenheit wurden Sanger-Sequenzierung, komplementär bestimmende Region 3 (CDR3) Spektrentypisierung und Durchflusszytometrie verwendet, um das Immunrepertoire zu charakterisieren, lieferten jedoch eine niedrige Auflösung. In den letzten zehn Jahren ermöglichten Fortschritte bei Next-Generation-Sequencing-Methoden (NGS) einen tiefen Einblick in die Eigenschaften und die Zusammensetzung der TCR- und BCR-Repertoires eines Individuums3,4. Diese Hochdurchsatzsysteme (HTS) sequenzieren und verarbeiten Millionen von neu angeordneten TCR- oder BCR-Produkten gleichzeitig und ermöglichen eine hochauflösende Analyse spezifischer T- und B-Zellen auf Nukleotid- oder Aminosäureebene. NGS bietet eine neue Strategie, um das Immunrepertoire sowohl in den Bereichen Gesundheit als auch Krankheit zu untersuchen. Studien mit HTS zeigten veränderte TCR- und BCR-Repertoires bei Autoimmunerkrankungen5, primären Immundefekten6,7und Malignomen, wie z. B. bei akuter myeloischer Leukämie8. Mit NGS haben wir und andere eine oligoklonale Expansion spezifischer T- und B-Zellklone bei Patienten mit entzündlichen Darmerkrankungen (IBD), einschließlich Colitis ulcerosa und Morbus Crohn,gezeigt 9,10,11,12,13,14. Insgesamt deuten Studien aus verschiedenen Bereichen darauf hin, dass Veränderungen im Repertoire eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese immunvermittelter Störungen spielen.

Das aktuelle Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung von DNA aus Darmbiopsien und Blut, die Generierung von TCRβ- und IGH-PCR-Bibliotheken für NGS und die Durchführung des Sequenzierungslaufs. Wir bieten auch grundlegende Schritte in der Immunrepertoire-Datenanalyse. Dieses Protokoll kann auch für die Generierung von TCRα-, TCRγ- und IGL-Bibliotheken angewendet werden. Die Methode ist auch mit anderen Organen (z.B. Lymphknoten, Tumoren, Synovialflüssigkeit, Fettgewebe etc.) kompatibel, sofern gewebespezifische Verdauungsprotokolle verwendet werden.

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Protokoll

Diese Studie wurde vom institutionellen Prüfungsausschuss des Sheba Medical Center genehmigt und die schriftliche Zustimmung aller teilnehmenden Probanden wurde eingeholt.

1. DNA-Isolierung und Quantifizierung

  1. Verdauung und Zelllyse von Darmbiopsien
    1. Rufen Sie Darmbiopsien ab, die entweder frisch gesammelt oder bei -20 °C oder -80 °C gelagert werden. Wenn Sie gefrorene Biopsien verwenden, tauen Sie auf Eis auf.
    2. 600 μL Kernlyselösung in ein steriles 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen geben, das auf Eis gekühlt wird.
    3. Die Biopsie in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit Lyselösung geben und bei 65 °C für 15-30 min inkubieren.
    4. 17,5 μL 20 mg/ml Proteinase K 17,5 ml hinzufügen und über Nacht bei 55 °C unter sanftem Schütteln inkubieren.
    5. Lassen Sie die Probe 5 Minuten lang auf Raumtemperatur abkühlen, bevor Sie mit Schritt 1.3 fortfahren.
  2. Zelllyse von Vollblut
    1. Erhalten Sie 3 ml Vollblut in EDTA-, Heparin- oder Citrat-haltigen Röhrchen.
    2. Rühren Sie das Röhrchen vorsichtig, bis es gründlich vermischt ist, und übertragen Sie das Blut in ein steriles 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit 9 ml Zelllyselösung. Mehrmals während einer 10-minütigen Inkubationszeit bei Raumtemperatur umkehren.
    3. Zentrifugieren Sie bei 2.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur und entsorgen Sie dann so viel Überstand wie möglich, ohne das sichtbare weiße Pellet zu stören. Etwa 50–100 μL Restflüssigkeit verbleiben.
    4. Wirbelrohr kräftig für 15 s bis zur vollständigen Reuspendation. Fügen Sie 3 ml Kernlyselösung hinzu und pipetieren Sie mehrmals. Die Lösung sollte viskos werden.
  3. Proteinausfällung
    1. Fügen Sie 200 μL Proteinfällungspuffer zum Gewebe oder 1 ml zum Blut hinzu. 20 s kräftig vortexen und 5 min auf Eis inkubieren. Kleine Proteinklumpen können nach dem Wirbeln sichtbar sein.
    2. Zentrifuge bei 16.000 x g für 4 min. Ein dichtes Pellet, das gefällte Proteine enthält, sollte sich bilden.
    3. Den Überstand vorsichtig, ohne das Pellet zu stören, in ein neues 1,7-ml-Rohr geben.
      HINWEIS: Wenn das Pellet nicht dicht ist, sollten Sie eine andere Zentrifuge bei 16.000 x g für 4 min in Betracht ziehen.
  4. DNA-Ausfällung und Rehydratation
    1. Fügen Sie 1 ml 2-Propanol in das Röhrchen mit dem Überstand hinzu und mischen Sie es vorsichtig durch Invertieren. DNA sollte als weiße schwimmende Substanz sichtbar werden.
    2. Zentrifuge bei 16.000 x g für 1 min. Entfernen Sie den Überstand vollständig mit einer Pipette.
    3. Fügen Sie 1 ml frisch zubereitetes 70% Ethanol hinzu und kehren Sie das Röhrchen mehrmals um. Zentrifuge bei 16.000 x g für 1 min bei Raumtemperatur. Überstand vorsichtig verwerfen.
    4. Wiederholen Sie Schritt 1.4.3.
    5. Offenes Rohr invertiert auf sauberes saugfähiges Papier für 10-15 min legen. Schlauch erneut umkehren und vollständige Hydratation bestätigen. Bei Bedarf für weitere 10-15 min an der Luft trocknen lassen.
      HINWEIS: Es ist wichtig, dass das Pellet vollständig trocknet.
    6. Fügen Sie 50 μL Reinstwasser (UPW) hinzu. Bei Bedarf kann die DNA nach der Quantifizierung weiter verdünnt werden.
    7. 1 h auf Hitzeblock bei 65 °C inkubieren, zur DNA-Rehydratation.
  5. DNA-Quantifizierung
    HINWEIS: Die DNA wurde mit einem Fluorometer und ausgewiesenen Reagenzien quantifiziert, wie in der Materialtabelle angegeben.
    1. Bringen Sie die Standards auf Raumtemperatur und bereiten Sie das Kit vor, einschließlich der 0,5 ml Röhrchen.
    2. Bereiten Sie Puffer und Farbstoffmischung in einem 15-ml-Röhrchen vor, je nach Anzahl der Proben. Fügen Sie 200 μL Puffer und 1 μL Farbstoff pro Probe hinzu. Fügen Sie 2 Beispiele für Standards bei. Es wird empfohlen, eine zusätzliche Probe zu berechnen, um zu vermeiden, dass der Puffer nicht ausreicht.
      1. Für die 2 Standards 190 μL der oben hergestellten Mischung in ein 0,5 ml Röhrchen geben. Fügen Sie 10 μL des Standards hinzu.
      2. Für jede Probe werden 199 μL der oben hergestellten Mischung in ein Röhrchen von 0,5 ml gegeben. Fügen Sie 1 μL der DNA hinzu.
    3. Lesen Sie die Beispiele. Das Ergebnis zeigt die DNA-Konzentration der Probe an.
    4. Wenn die Proben über dem Grenzwert liegen, verdünnen Sie die DNA 1:10 mit UPW und wiederholen Sie das Lesen.

2. Bibliotheksvorbereitung

HINWEIS: Das aktuelle Protokoll verwendet ein Multiplex-PCR-basiertes Assay-Kit, das mit NGS-Sequenzern kompatibel ist. Das Kit enthält 24 verschiedene Indizes, die jeweils auf konservierte Regionen innerhalb der Regionen Vβ und Jβ abzielen. Dies ermöglicht eine einstufige PCR-Reaktion und die Bündelung verschiedener Proben. Siehe Materialtabelle für Details.

  1. Bereiten Sie DNA-Proben vor. Erhalten Sie 150 ng DNA und fügen Sie UPW für insgesamt 5 μL hinzu.
    HINWEIS: Es ist möglich, weniger als 150 ng DNA für die Bibliotheksvorbereitung mit einer Mindestkonzentration von 10 ng / μL zu verwenden.
  2. Legen Sie Pipetten und Spitzen für 15 Minuten in die Haube mit UV-Licht, um Rest-DNA abzubauen. Lassen Sie in der Zwischenzeit verschiedene Indexröhrchen (für die Bibliotheksvorbereitung) und DNA-Polymerase auf Eis auftauen.
  3. In einer biologischen Haube 45 μL aus den verschiedenen Indexröhrchen in PCR-Röhrchen geben. Um zu folgen, fügen Sie 0,2 μL der DNA-Polymerase und die 5 μL DNA, die in Schritt 2.1 hergestellt wurden, in PCR-Röhrchen hinzu.
  4. Führen Sie die PCR-Reaktion mit einem voreingestellten Programm gemäß den Anweisungen des Herstellers aus.

3. Amplicon-Reinigung und Quantifizierung

  1. Verwenden Sie magnetische Perlen zur Entfernung von überschüssigen Primern, Nukleotiden und Enzymen.
    1. Erwärmen Sie die Perlen mindestens 30 min auf Raumtemperatur. Bereiten Sie genügend frisches 80% Ethanol für 400 μL pro Probe vor.
    2. 50 μL (IGH) oder 35 μL (TCRβ) der Perlen in jedes PCR-Röhrchen geben und 10 Mal durch Pipettieren mischen. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    3. Legen Sie die gemischte Probe für 5 min auf den Magnetständer.
    4. 95 μL (IGH) oder 80 μL (TCRβ) der klaren Flüssigkeit absaugen und entsorgen. Restflüssigkeit mit einer 10 μL-Spitze absaugen.
    5. Fügen Sie jeder Probe 200 μL 80% Ethanol hinzu. Inkubieren Sie 30 s. 195 μL Ethanol absaugen und entsorgen. Restflüssigkeit mit 10 μL Spitze absaugen.
    6. Wiederholen Sie Schritt 3.1.5. Öffnen Sie die Kappen der Rohre und lassen Sie die Luft 5 min trocknen.
    7. Unmittelbar nach den 5 minuten aus dem Magnetständer entfernen und 25 μL Elutionspuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0) hinzufügen. Durch Pipettieren homogen mischen. Bei Raumtemperatur für 2 min inkubieren.
    8. Legen Sie die Röhren für 5 min auf den Magnetständer. 22 μL in eine neue PCR-Röhre überführen. Messung der DNA-Konzentration (Schritt 1.5).
  2. Amplicon-Quantifizierung
    HINWEIS: Das aktuelle Protokoll verwendet eine automatisierte Elektrophoresemaschine zur Qualitätskontrolle von DNA-Konzentration, -Größe und -Integrität. Siehe Materialtabelle für Details.
    1. Reagenzien und Screentape mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur platzieren.
    2. In einem neuen 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen werden die in Schritt 3.1.8 mit UPW quantifizierten DNA-Proben mit 1 ng/μL für ein Gesamtvolumen von mindestens 3 μL verdünnt.
    3. Vortex verdünnte DNA vor Gebrauch. Legen Sie 2 μL Puffer zusammen mit 2 μL der verdünnten DNA in die vormarkierten spezialisierten PCR-Streifen (im Kit enthalten) und setzen Sie die Kappen ein. Für 1 minute auf den Shaker legen, gefolgt vom Spin-Down der PCR-Streifen.
      HINWEIS: Stellen Sie aufgrund der Viskosität des Puffers sicher, dass überschüssiger Puffer von der Spitze entfernt wird, bevor Sie in die Probenröhrchen übergehen.
    4. Legen Sie das Screentape und die PCR-Streifen ohne die Kappen in die Maschine. Öffnen Sie den Deckel der Tip Box in der Maschine. Weisen Sie die Position mit den entsprechenden Beschriftungen zu. Starten Sie den Computer.
      HINWEIS: Das Ausgangshetogramm sollte ein einzelner Peak in der gewünschten Größe der Amplicons sein (Abbildung 1A). In Proben von schlechter Qualität werden zusätzliche Peaks beobachtet (Abbildung 1B), die auf eine schlechte Perlenreinigung oder Bildung von Primerdimeren hinweisen.

4. Sequenzierung der nächsten Generation

  1. Quantifizierung und Bündelung von Bibliotheken
    1. Berechnen Sie die endgültige DNA-Konzentration in nM unter Verwendung des DNA-Wertes aus Schritt 3.1.8 und der Größe des Peaks des Produkts in Basenpaaren (bp), die aus den Ergebnissen der Elektrophoresemaschine erhalten wird (siehe Abbildung 1).
    2. Berechnen Sie für jede Probe das DNA-Volumen für eine Endkonzentration von 4 nM in einem Endvolumen von 10-20 μL Elutionspuffer.
    3. Bereiten Sie für jede Probe eine neue Verdünnungsmischung vor und nehmen Sie 2 μL davon in eine neue Poolmischung.
      HINWEIS: Für Proben mit weniger als 4 nM fügen Sie die maximal mögliche Probenmenge hinzu.
  2. NGS-Lauf der Bibliothek
    HINWEIS: Das aktuelle Protokoll verwendet eine Bench-Top-Sequenzer-Plattform. Siehe Materialtabelle für Details.
    1. Bereiten Sie eine frische Lösung von 0,2 N NaOH vor. 10 μL 0,2 N NaOH werden der in Schritt 4.1.3 hergestellten verdünnten Bibliothek hinzugefügt. 5% PhiX kurz in Röhre und Wirbel geben. Drehen Sie das Rohr herunter, um sicherzustellen, dass sich die gesamte Lösung auf dem Boden des Rohrs abgesetzt hat.
    2. 5 minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um die doppelsträngige DNA zu denaturieren. Fügen Sie 980 μL vorgekühlten Puffer aus dem Kit in das Röhrchen mit DNA und Wirbel kurz hinzu.
    3. Legen Sie die verdünnte Bibliothek auf Eis und bereiten Sie die Bibliothek wie folgt vor. Für eine Mischung von 17 pM werden 425 μL DNA aus Schritt 4.2.2 und 575 μL Puffer hinzugefügt. Bibliothek mehrmals umkehren und herunterfahren. Legen Sie 600 μL der endgültigen Bibliothek auf die vorgesehene Patrone und legen Sie die Proben in die Maschine.
    4. Starten Sie den Lauf gemäß den Softwareanweisungen.

5. Sequenzierungsanalyse

  1. Laden Sie Sequenzierungsmetriken vom Sequenzer herunter und überprüfen Sie, ob die Sequenzierungsdaten innerhalb der folgenden Bereiche liegen (spezifisch für das im aktuellen Protokoll verwendete Kit). Beispiele, die diese Kriterien nicht erfüllen, werden wiederholt ausgeführt:
    Clusterdichte (Dichte (K/mm2)): 945K – 1800K
    Prozentsatz der Lesevorgänge, die den Filter passieren (ClusterPF (%)): >90 %
    Qualitätsbewertungen (%>=Q30): >85%
    PhiX-Ausrichtung (Ausgerichtet %): 1,5% - 10%
    PhiX-Fehlerrate (%): <1,0%

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Ergebnisse

Hier beschreiben wir eine Methode zur DNA-Isolierung aus Darmgewebe und Blut, die Vorbereitung von Bibliotheken für NGS und grundlegende Schritte eines Sequenzierungslaufs zur Immunrepertoire-Sequenzierung. Der Lauf generiert fastq-Dateien, die weiter in fasta-Dateien für die Verwendung in der internationalen ImMunoGeneTics (IMGT) / HighV-QUEST-Plattform konvertiert werden können. Dieses HTS führt viele Analysen von Zehntausenden von neu angeordneten TCRβ- und IGH-Sequenzen auf der Nukleotidebene15...

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Diskussion

Veränderungen in Der Häufigkeit und Funktion von B- und T-Lymphozyten treten häufig bei verschiedenen Malignomenauf 18, chronisch entzündlichen Erkrankungen (z. B. Colitis ulcerosa und rheumatoide Arthritis)10,19und in verschiedenen Immundefekten17,20. Die aktuelle Methode nutzt NGS, um einen detaillierten Überblick über TCR- und BCR-Repertoires zu ermöglichen, was den Nachw...

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Offenlegungen

Alle Autoren haben nichts preiszugeben.

Danksagungen

nichts.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
2-propanolSigmaI9516-500ML
1.7 mL micro-centrifuge tubesAxygen8187631104051
15 mL centrifuge tubesGreiner188261
Absolute ethanolMerck1.08543.0250
Amplitaq GoldThermo FisherN8080241
AMPure XP BeadsBeckman CoulterA63881
Heat blockBioerNot applicable
High Sensitivity D1000 Sample BufferAgilent5067-5603For Tapestation
High Sensitivity D1000 ScreenTapeAgilent5067-5584For Tapestation. Tubes sold seperately
Lymphotrack Assay kitInvivoscribeTRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019Each includes 24 indexes
MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle)IlluminaMS-102-2003Includes standard flow cell type and all reagents required
MiSeq SequencerIlluminaSY-410-1003
PCR strips4titude4ti-0792
Proteinase KInvitrogenEO0491
Qubit 4 FluorometerThermo FisherQ33226
Qubit dsDNA HS Assay KitThermo FisherQ32854Includes buffer, dye, standards, and specialized tubes
ShakerBiosanNot applicable
Tapestation 2100 BioanalyzerAgilentG2940CA
ultra pure waterBio-lab7501
Wizard DNA isolation kitPromegaA1120Includes cell lysis solution, nuclei lysis solution, and protein precipitation buffer

Referenzen

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