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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die anpassbare Herstellung und Verwendung von Fluoreszenzsonden zur Markierung antigenspezifischer B-Zellen.

Zusammenfassung

Die Produktion von fluoreszierenden Antigenen ist ein entscheidender Schritt bei der Identifizierung antigenspezifischer B-Zellen. In diesem Artikel haben wir die Herstellung, Reinigung und Verwendung von vierarmigen, fluoreszierenden PEG-Antigen-Konjugaten zur selektiven Identifizierung antigenspezifischer B-Zellen durch avide Interaktion mit verwandten B-Zell-Rezeptoren detailliert beschrieben. Unter Verwendung modularer Click-Chemie und kommerziell erhältlicher Fluorophor-Kit-Chemie haben wir die Vielseitigkeit der Herstellung von kundenspezifischen fluoreszierenden PEG-Konjugaten demonstriert, indem wir unterschiedliche Arrays für Proteolipidprotein (PLP139-151) und Insulin erstellt haben, die wichtige Autoantigene in Mausmodellen für Multiple Sklerose bzw. Typ-1-Diabetes sind. Für jedes fluoreszierende Konjugat in seinem jeweiligen Krankheitsmodell wurden mittels Durchflusszytometrie Assays entwickelt. Antigen-Arrays wurden mit monovalenten Autoantigenen verglichen, um den Nutzen der Multimerisierung auf PEG-Rückgrate zu quantifizieren. Schließlich haben wir den Nutzen dieser Plattform veranschaulicht, indem wir Anti-Insulin-B-Zell-Antworten nach Antigenstimulation ex vivo isoliert und bewertet haben. Die Markierung insulinspezifischer B-Zellen ermöglichte den verstärkten Nachweis von Veränderungen der Co-Stimulation (CD86), die sonst in der aggregierten B-Zell-Analyse gedämpft wurden. Zusammen ermöglicht dieser Bericht die Herstellung und Verwendung von fluoreszierenden Antigen-Arrays als robustes Werkzeug für die Untersuchung von B-Zellpopulationen.

Einleitung

Das adaptive Immunsystem spielt eine entscheidende Rolle bei der Progression oder Rückbildung vieler Krankheitszustände, einschließlich Autoimmunität, Krebs und Infektionskrankheiten1. Für breite Anwendungen, einschließlich der Erforschung der Immunpathologie oder der Entwicklung neuer Präzisionsbehandlungen, ist es oft entscheidend, antigenspezifische B- und T-Zell-Antworten zu bewerten, die dem Fortschreiten der Erkrankung zugrunde liegen 2,3,4. Tetramere des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) sind für die Identifizierung antigenspezifischer T-Zell-Klone weit verbreitet und kommerziell verfügbar5. Diese Fluorophor-markierten Konstrukte präsentieren quadrivalente Peptid-MHC-Komplexe, die eifrig mit verwandten T-Zell-Rezeptoren für Markierungsanwendungen wie Mikroskopie und Durchflusszytometrie interagieren.

Antigene für die B-Zell-Abfrage können sehr unterschiedliche Molekulargewichte, Ladungen und Löslichkeiten aufweisen 6,7. Bei der Verwendung von monomeren Antigenen als lösliche B-Zell-Sonden können die physikalisch-chemischen Antigeneigenschaften durch Komplexierung mit dem viel größeren, wasserlöslichen Streptavidin-Molekül nicht stabilisiert werden oder als monomere Reagenzien vor der Konjugation Löslichkeitsprobleme aufweisen. Daher weisen einige Proteine in der Praxis Schwierigkeiten bei der Biokonjugation und unerwartete Ergebnisse auf 7,8. Die direkte Konjugation von Fluoreszenzfarbstoffen kann Konstrukte manchmal wasserunlöslich und lipophil machen. Diese direkten Farbstoff-Antigen-Verbindungen sind anfällig für unspezifische Einbettungen in Zellmembranen, was antigenspezifische Analysen verwirrt 7,8,9. Einige Strategien haben die Herausforderungen der Löslichkeit überwunden, indem sie Antigene und Fluorophore mit anderen funktionellen Gruppen gekoppelt haben. Cambier et al. setzten beispielsweise biotinyliertes Insulin in seiner nativen Form ein, um mit insulinspezifischen B-Zell-Rezeptoren (BCRs) in Kontakt zu treten, bevor sie Fluorophor-markiertes Streptavidin schrittweise hinzufügten10. Während dieser Ansatz die Beurteilung von B-Zellen, die an monomeres Insulin binden, mit hoher Auflösung ermöglichte, waren zwei Markierungsschritte erforderlich. Ein verallgemeinerbares Protokoll für die Herstellung gebrauchsfertiger polymerbasierter B-Zell-Sonden, das sich leicht in gängige Verfahren zur Markierung von fluoreszierenden Antikörpern integrieren lässt, wäre von Vorteil für die weitere Erforschung von B-Zellen bei Krankheiten.

In diesem Protokoll beschreiben wir die Herstellung und Verwendung von fluoreszierenden Antigen-Arrays (FAAs) für die verallgemeinerbare und einstufige Markierung von antigenspezifischen B-Zellen für Mikroskopie- und Durchflusszytometrie-Experimente (Abbildung 1). Lösliche Antigen-Arrays (SAgAs) wurden in den letzten zehn Jahren als B-Zell-gerichtete antigenspezifische Immuntherapien gegen Autoimmunerkrankungen eingesetzt 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 . SAgAs nutzen die multivalente Antigendarstellung auf flexiblen, polymeren Rückgraten, um B-Zell-Rezeptoren eifrig zu aktivieren und immunmodulatorische Effekte hervorzurufen, obwohl ihre Antigenspezifität eine weitere Möglichkeit bietet, B-Zellen von Interesse zu untersuchen, wenn sie an ein Fluorophorgekoppelt sind 23. Das polymere Rückgrat, aus dem SAgAs bestehen, verleiht dem gesamten Biomakromolekül Wasserlöslichkeit und kann die manchmal extremen Antigeneigenschaften dämpfen, die die Sondengenerierung und die Färbespezifität verwirren 6,24. Wir haben zahlreiche Antigene unterschiedlicher Größe und Komplexität mit modularer Click-Chemie auf die SAgA-Plattform gepfropft, was für die Verwendung von kleinen Peptidepitopen und vollständigen Proteinen förderlich ist14,18. Hier zeigen wir FAAs als robuste antigenspezifische B-Zell-Markierungswerkzeuge, die parallel zur typischen Fluoreszenz-Antikörper-Markierung verwendet werden können. Wir erstellten und bewerteten FAAs, bestehend aus humanem Insulin zur Markierung von B-Zellen in einem transgenen Mausmodell für Typ-1-Diabetes (VH125), sowie FAAs, die das Proteolipidprotein 139-151 (PLP), ein Peptidepitop für experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE), das Mausmodell von Multipler Sklerose, enthielten. Unsere Absicht bei der Verwendung dieser Krankheitsmodelle war es, die Vielseitigkeit dieser Plattform zu demonstrieren, sowohl für die modulare Substitution der verwendeten Antigene als auch für die Machbarkeit des Einsatzes mit Peptid-Epitopen (PLP) und Vollproteinen (Insulin). Dieses Protokoll wird mit dem Ziel der Zugänglichkeit vorgelegt, ohne dass umfangreiche Biokonjugationskenntnisse erforderlich sind. Die Reagenzien sowie die Synthese- und Aufreinigungsmethoden sind so konzipiert, dass sie vielseitig einsetzbar sind und in den meisten Forschungslabors mit Schwerpunkt Chemie, Molekularbiologie oder Immunologie leicht implementiert werden können.

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Protokoll

Alle in dieser Arbeit vorgestellten Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee an der University of Kansas genehmigt.

1. Antigen-Array-Synthese (4–6 Tage)

  1. Funktionalisieren Sie das unmodifizierte Antigen mit einem Alkingriff (1 h). 1 äquivalentes Insulin (100 mg, 17,4 μmol) mit einem Rührstab in ein 20-ml-Glasfläschchen geben und in wasserfreiem Dimethylsulfoxid (DMSO) (2 ml) unter sanfter Erhitzung auf 40–50 °C mit einer Heißluftpistole oder einem Wasserbad auflösen.
    1. 1,1,3,3-Tetramethylguanidin (40,2 mg, 348,8 μmol) und 1,35 Äquivalente frisch zubereitete 78,5 mM Propargyl-N-Hydroxysuccinimidester (NHS-Ester)-Stammlösung in wasserfreiem DMSO (0,3 ml, 5,3 mg, 23,6 μmol) zugeben.
    2. 30 Minuten lang bei Raumtemperatur rühren und dann die Reaktion mit 0,05 % HCl (12 mL) abschrecken.
  2. Das einfach modifizierte Insulin-Alkin wird durch Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie (4 h) gereinigt. Verwenden Sie eine präparative C18-Säule (19 mm x 250 mm, 300 A Porengröße, 5 μm Partikelgröße) mit einem 10 min 30–40 % B-Gradienten (A, Wasser mit 0,05 % Trifluoressigsäure (TFA); B, Acetonitril mit 0,05 % TFA) und einer Flussrate von 14 mL/min. Das gewünschte Produkt eluiert unmittelbar nach unmodifiziertem Insulin.
    1. Verdampfen Sie Acetonitril und TFA durch Stickstoffgasstrom oder Rotationsverdampfung unter reduziertem Druck (650 Pascal) und Drehung mit 150 U/min. Die wässrige Lösung einfrieren und bis zur Trockenheit lyophilisieren. Lagern Sie funktionalisiertes Insulin bei -20 °C unter trockener Atmosphäre.
      HINWEIS: Das funktionalisierte Insulin ist unter diesen Lagerbedingungen bis zu einem Jahr lang stabil.
  3. Synthetisieren Sie das Antigen-Array durch kupferkatalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition (CuAAC) (2,5 h)22. Geben Sie 6 Äquivalente Insulin-Alkin (38 mg, 6,3 μmol) mit einem Rührstab in ein 10-ml-Glasfläschchen und lösen Sie es in DMSO (1,2 mL) durch sanftes Erhitzen auf.
    1. Fügen Sie 50 mM Natriumphosphatpuffer (1,8 mL) pH 7,4, 1 Äquivalent 20 kDa 4-armiges PEG-Azid (21 mg, 1,05 μmol), Kupfer(II)-sulfat-Pentahydrat (3,15 mg, 12,6 μmol), Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amin (27,37 mg, 63 μmol) und Natriumascorbat (50,34 mg, 254 μmol) hinzu.
    2. 2 Stunden bei Raumtemperatur rühren, dann DMSO (3 mL) hinzufügen, um alle Ausfällungen zu lösen, und die Lösung mit 0,05 % HCl (4 mL) ansäuern.
  4. Das Antigen-Array wird durch Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie (3 h) gereinigt. Verwenden Sie eine präparative C18-Säule (19 mm x 250 mm, 300 A Porengröße, 5 μm Partikelgröße) mit einem 10 min 20–60 % B Gradienten (A, Wasser mit 0,05 % TFA; B, Acetonitril mit 0,05 % TFA) und einer Flussrate von 14 ml/min. Das gewünschte Produkt eluiert unmittelbar nach Insulin-Alkin.
    1. Verdampfen Sie Acetonitril durch Stickstoffgasstrom oder Rotationsverdampfung unter reduziertem Druck. Die wässrige Lösung einfrieren und bis zur Trockenheit lyophilisieren. Bei -20 °C unter trockener Atmosphäre lagern.
      HINWEIS: Das Insulin-Antigen-Array ist stark hygroskopisch. Die lyophilisierten Fasern können nach wiederholter Einwirkung der Atmosphäre zu einem dichten Pellet verschmelzen. Die Eigenschaften von FAA können je nach verwendetem anwendungsspezifischem Antigen unterschiedlich sein. Das Insulin-Antigen-Array ist unter diesen Lagerbedingungen mehrere Monate lang stabil.

2. Fluorophor-Konjugation (1–2 Tage)

  1. Konjugieren Sie das Fluorophor an das Antigenarray (2,5 h). Geben Sie 1 äquivalentes tetravalentes Insulin (21,7 mg, 0,5 μmol) in ein 20-ml-Glasfläschchen mit Rührstab und lösen Sie es in DMSO (1,75 mL) durch sanftes Erhitzen auf. Frisch zubereiteten 100 mM Karbonatpuffer (8 ml) mit einem pH-Wert von 9,0 und 5 Äquivalente Fluoresceinisothiocyanat in eine frisch zubereitete 10 mM Stammlösung in DMSO (0,25 ml, 0,97 mg, 2,5 μmol) geben. 2 h im Dunkeln bei Raumtemperatur umrühren.
  2. Reinigen Sie das Produkt durch Dialyse (24 h). Verwenden Sie einen Dialyseschlauch mit einem Molekulargewicht von 3,5 kDa in einem gerührten 5-l-Eimer mit destilliertem Wasser im Dunkeln bei Raumtemperatur. Dialysieren Sie 24 h lang und wechseln Sie die Dialyselösung alle 6–12 h.
  3. Die dialysierte Lösung einfrieren und bis zur Trockenheit lyophilisieren, um das FAA zu erhalten. Im Dunkeln bei trockener Atmosphäre bei -20 °C lagern.
    HINWEIS: Der FAA ist unter diesen Lagerbedingungen mehrere Monate lang stabil.

3. FAA-Charakterisierung (2–4 h)

  1. Analysieren Sie die Produkte der Schritte 1 und 2 mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach Laemmli25 (2 h). Bereiten Sie Proben vor, die 5 μg gereinigtes monovalentes Antigen, 20 kDa 4-armiges PEG-Azid, Antigen-Array und FAA enthalten.
    1. Visualisieren Sie die Fluorophormarkierung in den FAA-Proben durch Fluoreszenzbildgebung in einem Gel-Imager.
    2. Führen Sie die Coomassie-Blau-Färbung26 durch, um das Antigen sichtbar zu machen.
    3. Führen Sie eine Jodfärbung27 durch, um das PEG-Rückgrat sichtbar zu machen. Spülen Sie das Gel in destilliertem Wasser (3 x 2 min), inkubieren Sie es 10 min lang in 5%iger Bariumchloridlösung (20 mL), spülen Sie es in destilliertem Wasser (3 x 2 min), inkubieren Sie es 1 min lang in 0,1 N Jodlösung (20 mL) und spülen Sie es dann in destilliertem Wasser (3 x 2 min), um Hintergrundflecken vor der Visualisierung zu entfernen.
      HINWEIS: Um 0,1 N Jodlösung herzustellen, Kaliumjodid (2,0 g, 12 mmol) und Jod (1,27 g, 5 mmol) zu 100 ml destilliertem Wasser hinzufügen.
  2. Berechnen Sie den Grad der Farbstoffmarkierung mittels UV-Vis-Spektroskopie (1 h). Lösen Sie eine kleine Menge FAA bei 0,1 mg/ml auf und notieren Sie die Extinktion bei 280 nm und die maximale Absorptionswellenlänge für den Farbstoff. Ermitteln Sie die molaren Extinktionskoeffizienten für das Antigen und den Farbstoff.
    HINWEIS: Einige Farbstoffe sind pH-empfindlich. Stellen Sie sicher, dass Sie bei der Messung der FAA-Absorption eine angemessen gepufferte Lösung wie 100 mM Karbonatpuffer mit einem pH-Wert von 8,3 verwenden, um sicherzustellen, dass der angegebene Farbstoffauslöschungskoeffizient genau ist.
    1. Die folgende Berechnung28 ist durchzuführen, wobei AFarbstoff, maxλ die FAA-Absorption bei der maximalen Absorptionswellenlänge für den Farbstoff EFarbstoff, maxλ der molare Extinktionskoeffizient bei der maximalen Absorptionswellenlänge für den Farbstoff ist, undE-Antigen, 280 nm der molare Extinktionskoeffizient für monovalentes Antigen bei 280 nm ist:
      Korrekturfaktor (CF) =A-Farbstoff, 280 nm /A-Farbstoff, maxλ 0,25 * (A-Farbstoff, maxλ /E-Farbstoff, maxλ) * (E-Antigen, 280 nm / (A280 nm – (A-Farbstoff, maxλ * CF))) = Farbstoff/FAA
  3. Analyse der FAA auf freie Farbstoffe oder potentielle Abbauprodukte mittels RP-HPLC (1 h).
    1. Eine kleine Menge FAA bei 1,0 mg/ml lösen und mit einer analytischen C18-Säule (4,6 mm x 150 mm, 300 A Porengröße, 2,5 μm Partikelgröße) unter Verwendung eines 10 min 5–95 % B-Gradienten (A, Wasser mit 0,05 % Trifluoressigsäure: B, Acetonitril mit 0,05 % Trifluoressigsäure) mit einer Flussrate von 1 mL/min analysieren. Stellen Sie den UV-Vis-Detektor so ein, dass er die maximale Absorptionswellenlänge des Farbstoffs überwacht (437 nm für FITC).
      HINWEIS: Bei pH-empfindlichen Farbstoffen kann die HPLC-Analyse in angesäuerten Lösungsmitteln eine Verschiebung der überwachten Wellenlänge von der maximalen Absorptionswellenlänge des Farbstoffs unter neutralen, wässrigen Bedingungen erfordern. Bei 0,05 % TFA liegt der pH-Wert bei etwa 3 und die maximale Absorption für FITC hat sich verschoben.

4. Entwicklung des Assays durch FAA-Titration (3–5 h)

HINWEIS: Die Verwendung der FAA für die Durchflusszytometrie wird vorgestellt, aber die gleichen Schritte können für die Verwendung in anderen Formaten wie Immunhistochemie oder Fluoreszenzmikroskopie modifiziert werden. Bei der Anwendung von FAAs für ein neues Format muss ein neuer Optimierungsassay durchgeführt werden. Gemischte oder isolierte Zellpopulationen können durch Blut- oder lymphatische Organaufbereitungsverfahren gewonnen werden23,29. Die Ernte durch enzymatische Verdauung von Gewebe wird nicht empfohlen, da Zelloberflächenmarker abgestoßen werden können.

  1. Suspendieren Sie die FAA-Brühe auf 1 mg/ml in FACS-Puffer (1x PBS + 5 % fötales Rinderserum und 0,1 % Natriumazid). Bis zu 10 % DMSO können eingearbeitet werden, um die Auflösung zu beschleunigen.
  2. Erhalten Sie Zellen, die positiv auf antigenspezifische B-Zellen von Interesse sind, und geben Sie sie in Mikrozentrifugenröhrchen ab. Insgesamt werden ca. 1 x 10 7 Zellen benötigt.
    HINWEIS: Für die vorliegende Demonstration wurden Splenozyten von VH125- und EAE-Mäusen gemäß den von der IACUC zugelassenen Protokollen an der University of Kansas entnommen. Forscher können die hierin beschriebenen Verfahren für Zellproben anwenden, die spezifisch für ihre eigene Anwendung und FAA-Vorbereitung sind.
    1. Geben Sie 5 x 105 Zellen für die Titration ab, markieren Sie Replikate (mindestens 3 Replikate pro Titration).
    2. Dispensieren Sie 1 x 105 Zellen für die Kontrolle von Einzelflecken sowie eine ungefärbte Kontrolle.
      HINWEIS: Antikörper-Isotypen und Fluoreszenz minus eine Kontrolle können ebenfalls verwendet werden, um den Assay vollständig zu validieren.
  3. Waschen Sie die Zellen, indem Sie jedem Röhrchen 1 ml FACS-Puffer hinzufügen. Bei 200 x g 5 min zentrifugieren.
  4. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellpellets in 50 μl FACS-Puffer.
  5. Fügen Sie jeder Probe CD3- und CD19-Fluoreszenzantikörper in den vom Hersteller empfohlenen Konzentrationen sowie titrierten FAA-Dosen hinzu.
    HINWEIS: Die Arbeitskonzentrationen der fluoreszierenden Antikörper können unabhängig titriert werden, um die Integrität der Charge zu bestätigen. Die geeigneten FAA-Dosisbereiche variieren je nach Anwendung, aber ein guter Ausgangspunkt sind 50, 25, 10, 5 und 1 μg pro Probe. 1 μl FAA-Stammlösung entspricht 1 μg Dosis.
  6. Jede Probe gut mischen und zugedeckt 30 Minuten lang auf Eis inkubieren.
  7. Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation, indem Sie 1 ml FACS-Puffer in jedes Röhrchen geben. Zentrifugieren Sie die Proben bei 200 x g für 5 min.
  8. Aspirieren Sie den Überstand und wiederholen Sie die Wäsche, indem Sie 1 ml FACS-Puffer in jedes Röhrchen geben. Zentrifugieren Sie die Proben bei 200 x g für 5 min.
  9. Der Überstand wird aspiriert und die Proben werden in 200 μl frischem FACS-Puffer resuspendiert. Legen Sie die Proben auf Eis und gehen Sie zum Zytometer.
  10. Führen Sie die Proben auf dem Zytometer aus und erfassen Sie mindestens 50.000 Ereignisse.

5. FAA-Titrationsanalyse und Dosisoptimierung bei der Markierung (1–2 h)

  1. Mit der Durchflusszytometrie-Analysesoftware für einzelne Zellen ein Gate.
  2. Platzieren Sie auf einzelnen Zellen Gates für CD19+ (B-Zellen) und CD3+ (T-Zellen).
  3. Innerhalb der CD19+- und CD3+-Elternpopulationen wird das Gate für FAA+-Ereignisse im relevanten Fluorochromkanal verwendet.
  4. Erfassen Sie den Prozentsatz der FAA+-Ereignisse innerhalb der CD19+- und CD3+-Elternpopulationen.
  5. Berechnen Sie ein Spezifitätsverhältnis, indem Sie den Anteil der FAA+-Ereignisse in der CD19+-Population (spezifisch) durch den Anteil der FAA+-Ereignisse in der CD3+-Population (unspezifisch) dividieren. Das Spezifitätsverhältnis sollte für einen erfolgreichen FAA-Einsatz maximiert werden.
  6. Verwenden Sie die Markierungsdosis, die dem höchsten Spezifitätsverhältnis entspricht, für zukünftige Experimente.

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Ergebnisse

Die gereinigte Ausbeute an Insulinalkin (Abbildung 2, oberes Bild), bestimmt durch das Gewicht, schwankte typischerweise zwischen 50 und 65 %. Ausbeuten von weniger als 40 % wurden wahrscheinlich durch Wasserverunreinigungen im wasserfreien DMSO und/oder Hydrolyse des Propargyl-NHS-Esters verursacht. Bei der Antigen-Multimerisierung (Abbildung 1B) schwankte die gereinigte Ausbeute des Insulin-Antigen-Arrays (

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Diskussion

Wir haben ein Protokoll (Abbildung 1) entwickelt, um maßgeschneiderte FAAs zur Identifizierung antigenspezifischer B-Zellen zu konstruieren und so die Generierung von B-Zell-Sonden für schwierige Antigenziele zu vereinfachen. Wir wählten 4-armige PEG-Polymere mit terminalen Azidgruppen als einfaches Substrat für den Aufbau von FAAs, da PEG Wasserlöslichkeit verleiht, während die funktionellen Azidgriffe einfache Klick-Konjugationsreaktionen ermögliche...

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Offenlegungen

CJB ist Mitbegründer von Orion Bioscience, Inc., einem Unternehmen, das die SAgA-Technologie für die Erforschung ihrer therapeutischen Anwendungen lizenziert. Dieser Bericht basiert auf Arbeiten, die vom National Science Foundation Graduate Research Program im Rahmen des Stipendiums Nr. 1946099 unterstützt wurden. Alle Meinungen, Ergebnisse und Schlussfolgerungen oder Empfehlungen, die in diesem Material geäußert werden, sind die der Autoren und spiegeln nicht unbedingt die Ansichten der National Science Foundation wider.

Danksagungen

Wir danken Colette Worcester für die Hilfe bei der Datenerfassung. Diese Arbeit wurde von der PhRMA Foundation (JDG), dem National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (KDA) und von NIH-Stipendien R21AI143407, R21AI144408 und DP5OD023118 unterstützt.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
1,1,3,3-tetramethylguanidineAlfa AesarAAA12314AC
12 M hydrochloric acidFisher ChemicalA508-4
12% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 ulBio-Rad4561043
20 kDa 4-arm PEG azideJenkem USAA7185-1
3.5 kDa MWCO dialysis tubing (regenerated cellulose)Fisher Scientific25-152-10
Acetonitrile, HPLC gradeFisher ChemicalA998-4
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD19 AntibodyBioLegend115522
anhydrous dimethylsulfoxideACROS OrganicsAC610420010
barium chlorideACROS Organics203135000
Brilliant Blue G-250 DyeFisher BioReagentsBP100-50
Cell Prime r-insulinEMD Millipore4512-01Recombinant human insulin for insulin FAA synthesis
Copper (II) sulfate pentahydrateACROS OrganicsAC197722500
dimethylsulfoxideFisher ChemicalS67496
fluorescein isothiocyanate (FITC) isomer 1Sigma-AldrichF7250-1G
Glacial acetic acidFisher ChemicalA38-212
GlycerolACROS Organics15892-0010
GlycineFisher ChemicalG46-500
homopropargyl-PLPBiomatikNACustom synthesis (sequence: homopropargyl-HSLGKWLGHPDKF; purity: 97.29%)
iodineSigma-Aldrich207772-100G
Methanol, HPLC gradeFisher ChemicalA452-4
NHS-Rhodamine (5/6-carboxy-tetramethyl-rhodamine succimidyl ester), mixed isomerThermo Scientific46406A commercially available analog of the Rhodamine-B NHS ester used in the paper
PE/Cyanine7 anti-mouse CD3 AntibodyBioLegend100220
potassium iodideSigma-Aldrich30315
propargyl N-hydroxysuccinimide esterSigma-Aldrich764221
sodium ascorbateSigma-AldrichA7631
sodium biocarbonateSigma-AldrichS5761-1KG
sodium dodecyl sulfateFisher BioReagentsBP166-100
Sodium phosphate monobasic monohydrateFisher ChemicalS468-500
trifluoroacetic acidSigma-Aldrich302031-10x1mL
Tris baseFisher BioReagentsBP152-500
Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amineClickChemTools1010-1000
xBridge BEH C18 3.5 um, 4.6 x 150 mm columnWaters186003034
xBridge BEH C18 5um OBD Prep Column, 19 x 250 mmWaters186004021

Referenzen

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