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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Die Claisen-Schmidt Kondensationsreaktion ist eine wichtige Methode zur Erzeugung von methin-überbrückten konjugierten bizyklischen aromatischen Verbindungen. Durch die Verwendung einer basisvermittelten Variante der Aldolreaktion kann eine Reihe fluoreszierender und/oder biologisch relevanter Moleküle durch einen allgemein kostengünstigen und operativ einfachen synthetischen Ansatz erreicht werden.

Zusammenfassung

Methin-überbrückte konjugierte bizyklische aromatische Verbindungen sind häufige Bestandteile einer Reihe von biologisch relevanten Molekülen wie Porphyrinen, Dipyrrinonen und Arzneimitteln. Darüber hinaus führt eine eingeschränkte Rotation dieser Systeme oft zu stark bis mäßig fluoreszierenden Systemen, wie sie in 3H,5H-Dipyrrolo[1,2-c:2',1'-f]pyrimidin-3-ones, Xanthoglows, Pyrroloindolizinedion-Analogen, BODIPY-Analogen und den Phenol- und Imidazolinone-Ringsystemen von Green Fluorescent Protein (GFP) beobachtet werden. Dieses Manuskript beschreibt eine kostengünstige und operativ einfache Methode zur Durchführung einer Claisen-Schmidt-Kondensation, um eine Reihe fluoreszierender pH-abhängiger Pyrazol/Imidazol/Isoindolon-Dipyrrinonanaloga zu erzeugen. Während die Methodik die Synthese von Dipyrrinon-Analogen veranschaulicht, kann sie übersetzt werden, um eine breite Palette konjugierter bizyklischer aromatischer Verbindungen zu produzieren. Die bei dieser Methode verwendete Claisen-Schmidt-Kondensationsreaktion ist im Anwendungsbereich auf Nucleophile und Elektrophile beschränkt, die unter Grundbedingungen (Nucleophile Komponente) und nicht-enolizierbaren Aldehyden (elektrophile Komponente) enolizierbar sind. Darüber hinaus müssen sowohl die nucleophilen als auch die elektrophilen Reaktanten funktionelle Gruppen enthalten, die nicht versehentlich mit Hydroxid reagieren. Trotz dieser Einschränkungen bietet diese Methode Zugang zu völlig neuartigen Systemen, die als biologische oder molekulare Sonden eingesetzt werden können.

Einleitung

Eine Reihe konjugierter bizyklischer Systeme, bei denen zwei aromatische Ringe durch eine Monomethinbrücke miteinander verbunden sind, durchlaufen eine Isomerisierung durch Bindungsrotation, wenn sie mit einem Photon angeregt werden (Abbildung 1A)1,2,3,4,5. Das angeregte Isomer wird sich in der Regel durch nicht-radiante Zerfallsprozesse6zum Boden entspannen. Wenn die Energiebarriere für die Bindungsrotation stark genug erhöht wird, ist es möglich, die Photoisomerisierung einzuschränken oder zu verhindern. Stattdessen führt photonische Anregung zu einem aufgeregten Singlet-Zustand, der sich oft über Fluoreszenz anstatt durch nicht-radiativen Zerfall entspannt (Abbildung 1B). Die Eindämmung der Photoisomerisierung wird am häufigsten durch mechanische Einschränkung der Bindungsrotation durch Binden der beiden aromatischen Ringsysteme durch kovalente Verbindungen erreicht, wodurch das Molekül in einen bestimmten isomerischen Zustand gesperrt wird. Dieser Ansatz wurde verwendet, um mehrere verschiedene fluoreszierende trizyklische Dipyrrinon- und Dipyrrolmethananaloga wie: 3H,5H-Dipyrrolo[1,2-c:2',1'-f]pyrimidin-3-ones (1), zu erstellen. xanthoglows (2)6,7, pyrroloindolizinedione analogs (3)8und BODIPYanalogs 9 (4, Abbildung 2), wobei die Pyrrolidin- und/oder Pyrrolringsysteme mit Methylen, Carbonyl, oder Bor-Difluor-Linker. Typischerweise besitzen 1-4> 0,7, was darauf hindeutet, dass diese Systeme als Fluorophoreinheiten sehr effizient sind.

Es ist auch möglich, die Photoisomerisierung durch andere Mittel als die kovalente Verknüpfung der Ringsysteme zu beschränken. Beispielsweise sind die Phenol- und Imidazolinon-Ringe (Abbildung 2) von Green Fluorescent Protein (GFP) auf die Rotation durch die Proteinumgebung beschränkt; die restriktive Einstellung erhöht die Quantenausbeute um drei Größenordnungen im Vergleich zur gleichen Chromophoreinheit in freier Lösung10. Es wird angenommen, dass das Proteingerüst von GFP eine Rotationsbarriere durch serische und elektrostatische Effekte11bietet. Kürzlich entdeckte unsere Gruppe in Zusammenarbeit mit der Odoh-Gruppe an der University of Nevada ein weiteres Fluorophorsystem, das strukturelle Ähnlichkeit mit den Dipyrrinon-basierten Xanthoglow-Systemen hat (Abbildung 2)12. Diese Dipyrrinon-Analoga unterscheiden sich jedoch vom Xanthoglow-System dadurch, dass intramolekulare Wasserstoffbindungen anstelle von kovalenten Bindungen photoisomerisieren und zu einem fluoreszierenden bizyklischen System führen. Darüber hinaus können die Analoga Pyrazol, Imidazol und Isoindolondipyrrinon in protonierten und deprotonierten Zuständen wasserstoffgebunden werden; Deprotonation führt zu einer Roten Verschiebung sowohl der Anregungs- als auch der Emissionswellenlängen, wahrscheinlich aufgrund einer Änderung der elektronischen Natur des Systems. Während Wasserstoffbindung berichtet wurde, um Quantenrenditen zu erhöhen, obwohl eingeschränkte Rotation13,14,15,16, wir sind uns eines anderen Fluorophorsystems bewusst, in dem eingeschränkte Isomerisierung als Eine Art der Fluoreszenz sowohl in protonierten als auch in deprotonierten Zuständen des Moleküls dient. Daher sind diese pH-abhängigen Dipyrrinon-Fluorophore in dieser Hinsicht einzigartig.

In diesem Video konzentrieren wir uns auf die Synthese und chemische Charakterisierung der fluoreszierenden Dipyrrinon-Analogserie. Insbesondere wird der Schwerpunkt auf die Claisen-Schmidt-Kondensationsmethodik gelegt, mit der die komplette Reihe fluoreszierender Analoga konstruiert wurde. Diese Reaktion beruht auf der Erzeugung eines basisvermittelten Vinylogous-Enolateon-Ions, das eine Aldehydgruppe angreift, um einen Alkohol zu erzeugen, der anschließend eliminiert wird. Für die Analogserie Dipyrrinon wird Pyrrolinon/Isoindolon in ein Enolate umgewandelt, um einen Angriff auf eine Aldehydgruppe zu erleichtern, die an einem Pyrazol- oder Imidazolring befestigt ist (Abbildung 3); nach der Eliminierung bildet sich ein vollständig konjugiertes bizyklisches System, das durch eine Methinbrücke verbunden ist. Bemerkenswert ist, dass die gesamte Serie von Dipyrrinon-Analogen aus leicht verfügbaren kommerziellen Materialien hergestellt werden kann und in einer einzigen Ein-Topf-Reaktionssequenz hergestellt werden kann, die typischerweise in moderaten bis hohen Erträgen erfolgt (Die Erträge reichen von etwa 50-95%). Da die meisten Dipyrrinonanaloga hochkristallin sind, ist für die Herstellung analytisch reiner Proben nur sehr wenig Reinigung außerhalb der Standard-Arbeitsbedingungen erforderlich. Folglich benötigt dieses Fluorophorsystem nur wenige Schritte für den Zugriff aus leicht zugänglichen kommerziellen Materialien und kann in relativ kurzer Zeit synthetisiert, gereinigt und für analytische oder biologische Studien vorbereitet werden.

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Protokoll

1. Allgemeines Verfahren zur Synthese von Dipyrrinon-Analogen 16-25

  1. Pyrrolinon/Isoindolon (1,00 mmol) und das entsprechende Pyrazol/Imidazolaldehyd (1,00 mmol) in 5,0 ml Ethanol in einem rund-Bodenkolben auflösen.
  2. Wässriges KOH (24,0 mmol, 10 M, 2,40 mL) in einem Teil in den Kolben geben.
  3. Rühren und refluxen Sie das Gemisch, bis die Reaktionsvervollständigung durch TLC bestätigt wird (siehe Tabelle 1 für eine Liste der Reaktionszeiten). Es wurde ein TLC-Eluent von 10 % Methanol in Dichlormethan verwendet, und die Analoga wurden beobachtet, um Rf-Werte im oder um den Bereich von 0,62 bis 0,86 zu besitzen. Tragen Sie eine ausreichende Menge Vakuumfett auf oder verwenden Sie eine PTFE-Hülse an der Interphase von Glasfugen, um zu verhindern, dass das Glas des Kondensators und des Rundbodenkolbens unter hohen Temperaturen und Rahmenbedingungen beschlagnahmt werden.
  4. Lassen Sie das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur abkühlen und verdampfen Sie flüchtige Stoffe unter reduziertem Druck mit einem Rotationsverdampfer.
  5. Kühlen Sie die Reaktionsmischung mit einem Eisbad auf 0 °C.
  6. Neutralisieren Sie das restliche ölige Gemisch durch Zugabe von Essigsäure (30,0 mmol, 1,70 ml) in einer Portion.
  7. Reinigen Sie das resultierende Produktmaterial mit Vakuumfiltration (siehe Schritt 2a, für Verbindungen: 17, 18, 20-22, 24 und 25) oder verwenden Sie flüssig-flüssige Extraktion/Säulenchromatographie (siehe Schritt 2b, für Verbindungen: 16, 19und 23).

2. Verfahrensreinigung

  1. über Vakuumfiltration
    1. Passen Sie einen Hirsch-Trichter mit einem eingebauten Gummiadapter an einen Seitenarmkolben an.
    2. Tragen Sie ein Stück rundes Filterpapier auf den Hirsch-Trichter auf und nass mit entionisiertem Wasser, um die Haftung am Trichter zu ermöglichen.
    3. Schließen Sie eine Vakuumquelle an den Seitenarm des Kolbens an und stellen Sie sicher, dass eine ausreichende Vakuumdichtung vorhanden ist, indem Sie sicherstellen, dass keines der Glaswaren unter Vakuum auseinandergezogen werden kann.
    4. Gießen Sie den Kolben, der das kristallisierte Produkt enthält, über den Vakuumfilter und lassen Sie ihn filtern. Spülen Sie die Kristalle mit 10 ml eiskaltem entionisiertem Wasser.
    5. Lassen Sie die gefilterten Kristalle weiterhin auf dem Filterpapier trocknen, während sie nach der Filtration aller Flüssigkeiten noch mit der Vakuumquelle verbunden sind.
    6. Sammeln Sie die gefilterten Kristalle und legen Sie sie in einen 25 ml Rundbodenkolben.
    7. Befestigen Sie den Rundbodenkolben an einem gefransten Gemahlenen Glasverbindungs-/Vakuum-Leitungsadapter. Sichern Sie die Glasverbindung mit einem Keck-Clip.
    8. Am gerippten Ende des Glas-Hochvakuum-Leitungsadapters befestigen Sie eine Vakuumleitung, die an eine Hochvakuumpumpe geleitet wird, und kühlen Sie eine Vakuumfalle (mit Kühlmittel wie flüssigem Stickstoff oder Trockeneis/Aceton) ausreichend, um flüchtige Materialien zu kondensieren, die aus dem kristallinen Material verdampfen können. Schalten Sie die Hochvakuumpumpe ein, um eine vollständige Verdunstung der verbleibenden Spuren von Restlösungsmitteln aus den Kristallen zu gewährleisten.
    9. Lassen Sie die Kristalle unter Hochvakuum für mindestens 1 h trocknen. Entfernen Sie den Rundbodenkolben von der Vakuumleitung/dem Vakuumadapter, schalten Sie die Hochvakuumpumpe aus und reinigen Sie die Vakuumfalle.
  2. Verfahrensreinigung mittels Säulenchromatographie
    1. Den Mitwirkungsgemischgehalt der Essigsäure (ab Schritt 1.6) mit 10 ml entionisiertem Wasser verdünnen und in einen Separatorentrichter geben. 10 ml Dichlormethan in den Trenntrichter geben. Schütteln und entlüften Sie den Trenntrichter vorsichtig, um die beiden Schichten zu trennen.
    2. Extrahieren Sie die wässrige Schicht mit nachfolgenden Teilen von Dichlormethan (3 x 5 ml). Kombinieren Sie die organischen Fraktionen und trocknen Sie mit wasserfreien Na2SO4. Dekantieren und entfernen Sie alle Flüchtigen unter reduziertem Druck mit einem Rotationsverdampfer.
    3. Den Rückstand aus Schritt 2.2.2 verdünnen. mit 5 ml CH2Cl2. Führen Sie die Flash-Säulenchromatographie mit ca. 75 g Kieselgel durch. Die Probe mit einer Lösung von 10% Methanol in Dichlormethan zu senken.
    4. Entfernen Sie die gesammelten Lösungsmittelfraktionen unter reduziertem Druck mit einem Rotationsverdampfer. Den festen Rückstand mit ca. 10 ml CH2Cl2auf einen 25 ml Rundbodenkolben übertragen. Entfernen Sie das Lösungsmittel unter reduziertem Druck mit einem Rotationsverdampfer.
    5. Trocknen Sie den verbleibenden festen Rückstand unter Hochvakuum, wie zuvor in den Schritten 2.1.7 - 2.1.9 beschrieben.

3. Molar Absorptivity Acquisition und UV/Vis pKa Studies for Analogs 16-25

  1. Erstellen Sie Compound-Aktienlösungen für die UV/Vis-Spektrophotometrie für Analoge 16 - 25.
    1. Wiegen Sie 10 mol des ausgewählten Dipyrrinon-Analog (16 - 25) ab und fügen Sie es einem 10 ml-Volumenkolben hinzu.
    2. Fügen Sie DMSO auf die 10,0 ml-Marke auf dem volumetrischen Kolben hinzu.
      HINWEIS: Wenn sich die Verbindung nicht vollständig auflöst, erhitzen Sie den Kolben mit einer Wärmepistole und rühren Sie den Kolben nach Bedarf, um die Verbindung vollständig aufzulösen.
  2. Herstellung von Phosphatgepufferten Saline-Lösungen (PBS) auf verschiedenen pH-Werten. Die Analoga waren in PBS-Puffern im pH-Wert von ca. 4 bis 15 gekennzeichnet.
    1. Mit einem 1 L-Volumenzylinder können Sie 1 L PBS-Lagerlösung erstellen, indem Sie 100 ml PBS (x100) in 900 ml entionisiertem Wasser verdünnen.
    2. 50 ml der vorbereiteten PBS-Lagerlösung (Schritt 3.2.1) auf ein 100 ml Becherglas übertragen und einen magnetischen Rührstab hinzufügen. Dann mit einem kalibrierten pH-Messgerät, um Änderungen des pH-Werts zu überwachen, titieren Sie den PBS-Puffer entweder mit wässrigen 1,0 M NaOH (um Puffer mit pH-> 7,0) oder 1,0 M HCl zu erhalten (um Puffer mit pH-< 7,0 zu erhalten).
      ANMERKUNG: Um Daten zu erhalten, die zu einer genau definierten Titrationskurve führen, empfehlen wir die Erzeugung von pH-Puffern in Schritten von 0,1 pH-Einheiten innerhalb von ± 0,5 des erwarteten Wendepunkts und Inkremente von 0,5 außerhalb des erwarteten Wendepunkts.
  3. Erwerben Sie molaren Absorptivity Spektren für Analoge 16 - 25 in PBS (pH 7.0) und 1,0 M NaOH (pH 14.0) Lösungen.
    1. Bereiten Sie einen "leeren" mit einer sauberen und trockenen Quarzküvette vor und fügen Sie dann 2,0 ml entweder PBS-Lagerlösung (pH 7,0) oder wässrige 1,0 M NaOH mit einer 100 - 1000 L Mikropipette in die Küvette.
      HINWEIS: Es ist wichtig für die Integrität des Datenerfassungsprozesses der Rohlingslösung, um sicherzustellen, dass sich keine Luftblasen in der Küvettenlösung befinden, und die Seiten der Küvette mit einem Kim-Wischmittel gründlich abzuwischen, um Lichtstreuung durch Staub oder Schmutz an der Außenseite der Küvette zu verhindern. Wenn Blasen anhalten, tippen Sie vorsichtig und wiederholt auf die Küvette auf ein Papiertuch, das auf einer harten Oberfläche gelegt wird.
    2. Mit einem UV/Vis Spektralphotometer wird die ausgewählte Lösung für einen Bereich von 200 - 800 nm leer.
    3. In eine zweite saubere und trockene Quarzküvette 2,00 ml pbS (pH 7.0) oder 1,0 M NaOH (pH 14) hinzufügen, gefolgt von 10 l der Dipyrrinon-Analog- (16 - 25) Stammlösung (siehe Schritt 3.1) mit einer 5-50 l Mikropipette. Legen Sie eine Kappe auf die Küvette und schütteln Sie gut zusätzlich zur Umkehrung der Küvette.
      HINWEIS: Es ist wichtig für die Integrität des Datenerfassungsprozesses der Probenlösung, um sicherzustellen, dass sich keine Luftblasen in der Küvettenlösung befinden, und die Seiten der Küvette mit einem Kim-Wischvorgang gründlich abzuwischen, um Lichtstreuungen zu verhindern, die durch Staub oder Schmutz an der Außenseite der Küvette entstehen. Wenn Blasen anhalten, tippen Sie vorsichtig und wiederholt auf die Küvette auf ein Papiertuch, das auf einer harten Oberfläche gelegt wird.
    4. Erfassen Sie mit dem UV/Vis Spektralphotometer ein Absorptionsspektrum für die Analoglösung Dipyrrinon für einen Bereich von 200 - 800 nm.
    5. Fügen Sie der gleichen Küvette eine zusätzliche 10 L der analogen Dipyrrinon-Stammlösung hinzu und wiederholen Sie die Schritte 3.3.3 und 3.3.4.
    6. Wiederholen Sie Schritt 3.3.5, bis der Küvette insgesamt 50 l Dipyrrinon-Analog-Stock-Lösung zugesetzt wurden, um mindestens fünf Anregungswellenlängen-Datenpunkte zu erhalten. Wiederholen Sie die Schritte 3.3.1 - 3.3.6, bis alle Lagerlösungen von 16 - 25 sowohl in PBS (pH 7.0) als auch in 1,0 M NaOH erhalten wurden.
  4. Erhalten Sie molaren Absorptivity-Werte für 16 - 25 in PBS (pH 7.0) und 1,0 M NaOH mit der besten passenden linearen Regressionsanalyse.
    1. Zeichnen Sie mit einem Graphikprogramm wie GraphPad Prism 7 die gemessene Absorption (y-Achse) gegen die Analogkonzentration Dipyrrinon (x-Achse) auf. Erstellen Sie eine am besten passende lineare Regressionsanalyse für die fünf geplotteten Punkte. Eine lineare Beziehung sollte beobachtet werden, und die statistische Analyse sollte einenR2-Wert ≥ 0,98 aufweisen.
    2. Wiederholen Sie Schritt 3.4.1 für analoge 16 - 25 in PBS (pH 7.0) und 1,0 M NaOH.
    3. Berechnen Sie die molare Absorptivity für 16 - 25 in PBS (pH 7.0) und 1,0 M NaOH unter Verwendung des extrapolierten Neigungswertes aus der linearen Kurve, die am besten passt.
  5. Bestimmen Sie diepK-Werte von 16 - 25 Studien mit UV/Vis Spectrophotometrie
    1. In eine saubere und trockene Quarzküvette 1.900 l des PBS-Puffers auf dem ausgewählten pH-Wert (in Schritt 3.2) mit einer Mikropipette von 100 - 1000 l übertragen.
      HINWEIS: Wir haben bei der Lagerung bemerkt, dass sich in einigen Puffern ein weißer Niederschlag bilden kann. Um sicherzustellen, dass der Puffer vollständig homogen ist und wenn ein Niederschlag sichtbar ist, verwenden Sie die Schwerkraftfiltration, um alle Ausscheidungen unmittelbar vor der Verwendung zu entfernen. Siehe die Notiz nach Schritt 3.3.1.
    2. Leeren Sie mit dem UV/Vis-Spektralphotometer die ausgewählte PBS-Pufferlösung für einen Bereich von 200 - 800 nm aus.
    3. In eine zweite saubere und trockene Quarzküvette 1.900 l des ausgewählten PBS-Puffers übertragen und dann 100 l der ausgewählten analogen Stofflösung mit einer 5-50-L-Mikropipette hinzufügen. Legen Sie eine Kappe auf die Küvette und schütteln Sie gut zusätzlich zur Umkehrung der Küvette.
      HINWEIS: Siehe die vorherige Anmerkung nach Schritt 3.3.3.
    4. Erfassen Sie mit dem UV/Vis Spektralphotometer das Absorptionsspektrum für das Dipyrrinon-Analogfür für einen Bereich von 200 - 800 nm.
    5. Wiederholen Sie die Schritte 3.5.1 - 3.5.4 für 16 - 25 in jedem der in Schritt 3.2 generierten PBS-Puffer.
  6. Bestimmen Sie denpK-Wert für 16 - 25 mit einer am besten passenden sigmoidalen Kurvenanpassungsfunktion.
    1. Mit Hilfe eines Graphikprogramms grafisch die gemessene Absorption vs. Wellenlänge (nm) für 16 - 25 bei den verschiedenen pH-Werten.
    2. Wählen Sie eine Wellenlänge zwischen 380-415 nm, wo bei niedrigeren pH-Werten (< 7,0) die Absorption gering ist (0-0,1 Einheiten) und bei einem höheren pH-Wert (> 12,0) ist die Absorption deutlich größer (0,8-1,0 Einheiten). Zeichnen Sie die Absorption bei der gewählten Wellenlänge im Vergleich zum pH-Wert.
    3. Erzeugen Sie mit einer sigmoidalen Kurvenfunktion für jedes der Analoga 16 - 25eine optimale Passungskurve. Melden Sie den extrapolierten pH-Wert in halber Höhe der Kurve. Dies ist der gemeldetepK-Wert.

4. Quantenertragserwerb und Fluoreszenzstudien

  1. Erstellen Sie Fluoreszenz-Studienstofflösungen für Dipyrrinonanaloge 16 - 18 und 20 - 25.
    1. Führen Sie mit einer analogen Dipyrrinon-Stammlösung, die in Schritt 3.1 erstellt wurde, eine Verdünnung der Stammlösung durch, indem Sie 10 l der Stammlösung zu einem 1 ml Volumetkolben mit einer 2 - 20-L-Mikropipette hinzufügen und dann den PBS-Puffer (pH 7,0) zur 1 ml-Marke hinzufügen. Legen Sie eine Kappe auf den Volumetric Kolben und mischen Sie gut durch Invertieren und Schütteln des Kolbens. Diese verdünnte Stammlösung wird zur Erzeugung der Fluoreszenzspektren verwendet und als Fluoreszenz-Stocklösung bezeichnet.
    2. Wiederholen Sie Schritt 4.1.1 für analoge 16 - 18 und 20 - 25.
  2. Erfassen Sie Fluoreszenz-Emissionsspektren in unterschiedlichen Konzentrationen, für Analoga 16 - 18 und 20 - 25. Für alle Analoga mit Ausnahme von 18erwerben sie fünf Spektren für jedes Analoge in Lösungen von pH 7 und 14 in Konzentrationen von: 19,96, 39,84, 59,64, 79,37 und 99,01 nM. Für analog 18 fünf Spektren in einer Lösung von pH 7 bei Konzentrationen von: 49,75, 99,01, 147,8, 196,1 und 243,9 nM erwerben. In einer Lösung von pH 14 fünf Spektren für analog 18 bei Konzentrationen von: 99,01, 196,1, 291,3, 384,6, 476,2 nM erwerben.
    1. In eine transparente vierseitige Quarzküvette 3,00 ml PBS (pH 7,0) oder 1,0 NaOH mit einer 100 -1.000 L Mikropipette in drei 1.000-L-Schritten hinzufügen.
      HINWEIS: Siehe Hinweis nach Schritt 3.3.1.
    2. Mit dem Fluorometer und dem Fluorometer-Softwareprogramm FluorEssence erhalten Sie ein Emissionsspektrum für die gewählte Lösung und kennzeichnen dies als Lösung als "leer".
    3. Fügen Sie der gleichen Küvette 6 l Fluoreszenz-Stammlösung für das ausgewählte Dipyrrinon-Analog (Teil 4.1) mit einer 0,5-10-L-Mikropipette hinzu. Legen Sie die Kappe auf die Küvette und mischen Sie gut durch Inverting und sanft schütteln die Küvette.
      HINWEIS: Siehe Hinweis nach Schritt 3.3.3.
    4. Erfassen Sie mit Dem Fluorometer ein Emissionsspektrum für die ausgewählte Verbundlösung, indem Sie als Anregungswellenlänge dasMaximum abs verwenden. Die Anregungsintensität wurde über einen Bereich von 200 nm gemessen, beginnend bei 15 nm über die Anregungswellenlänge hinaus (in der Regel ist ein 200 nm Bereich erforderlich, damit die Fluoreszenzintensität zur Basiszurücknung zurückkehrt).
    5. Wiederholen Sie die Schritte 4.2.3 - 4.2.4, bis der Küvette insgesamt 30 l Fluoreszenz-Stammlösung zugesetzt wurde.
    6. Wiederholen Sie die Schritte 4.2.1 - 4.2.5 für Analoge 16 - 25 in PBS (pH 7.0) und 1,0 M NaOH.
      ANMERKUNG: Die Küvettenkonzentrationen wurden für analoge 18 geändert und Daten wurden mit folgenden 2,0 ml PBS mit fünf aufeinanderfolgenden 10-L-Schritten von Fluoreszenz-Stock-Lösung für eine neutrale (protonierte 18) Lösung und 2,0 ml von 1,0 M NaOH mit fünf 20-L-Schritten von zugesetzten zusammengesetzten Lagerlösung für eine basisstäbige (deprotonierte 18)Lösung erfasst.
  3. Bestimmen Sie die Quantenausbeute mit der Methode von Williams, A. T. et al.17
    1. Importieren Sie mit Hilfe eines Tabellenkalkulationssoftwareprogramms (d. h. Microsoft Excel) die Daten (Emissionsintensitätsdatenpunkte) für die Emissionsspektren für ein einzelnes Dipyrrinon-Analog (entweder in PBS [pH 7.0] oder 1,0 M NaOH) auf den verschiedenen Konzentrationsstufen.
    2. Importieren Sie die Datenpunkte aus den Emissionsspektren für die "leere" Lösung (Schritte 4.2.1 - 4.2.2) und subtrahieren Sie die "leeren" Emissionsintensitätsdatenpunkte von den Emissionsintensitätsdatenpunkten bei den entsprechenden Wellenlängen, die bei verschiedenen Konzentrationsstufen erfasst werden.
    3. Übertragen Sie die "leeren" korrigierten Emissionsintensitätsdatenpunkte in ein Graphikprogramm, z. B. GraphPad Prism 7, und zeichnen Sie die Emission vs. Wellenlänge. Berechnen Sie die Fläche unter der Kurve für jede der Kurven, die bei den verschiedenen Konzentrationen von Dipyrrinon analog erhalten werden.
    4. Nach der von Williams, A. T. et al. skizzierten Technik berechnen Sie einen extrapolierten Absorptionswert für jeden der unterschiedlichen Konzentrationen von Dipyrrinon analog. Dies wird erreicht, indem der berechnete molare Absorptivity-Wert (aus der am besten passenden linearen Regressionsanalyse, siehe Schritt 3.4) mit jeder Konzentration von Dipyrrinonanalog multipliziert wird, die in den Schritten 4.2.3-4.2.5 verwendet wird.
    5. Erstellen Sie mit einem Graphikprogramm wie GraphPad Prism 7 ein Diagramm der extrapolierten Absorption (x-Achse) des Analogs gegen die berechnete Fläche unter jeder Konzentrationskurve (Schritt 4.3.4) für die Emissionswellenlänge, die dem größten Emissionswert entspricht. Eine lineare Beziehung zu einem r2 ≥ 0,96 sollte beobachtet werden.
    6. Führen Sie Schritte analog zu 3.1-3.4 und 4.1-4.3.5 für Chinin in 0,5 M H2SO4 (xF = 0,55)18 und Anthracen in Ethanol(NF = 0,27)18,19 aus, um Daten für Normen zu erhalten.
    7. Erhalten Sie die Quantenertragswerte für 16 - 25 in PBS (pH 7.0) und 1,0 M NaOH, indem Sie die extrapolierten Steigungen aus den Schritten 4.3.5 und 4.3.6 in der folgenden Gleichung verwenden:
      x =st(Gradx/Gradst)(η2x/η2st)
      wobeidie Quantenausbeute des Standards,x die Quantenausbeute des Unbekannten darstellt, Grad die Steigung der besten linearen Passung und η der Brechungsindex des verwendeten Lösungsmittels ist (das Brechungsindexverhältnis wurde mit η = 1,36 für Ethanol und η = 1,35 für 0,5 M H2SO4) berechnet.
    8. Melden Sie die Quantenerträge für 16 - 18 und 20 - 25 in PBS (pH 7,0) und 1,0 M NaOH als Durchschnitt des x für Chinin und Anthracen erhaltenenx.

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Ergebnisse

Die Verdichtungsreaktion Claisen-Schmidt bot Zugang zu Dipyrrinonanaloga (16-25, Abbildung 4) mit dem im Protokollabschnitt beschriebenen Ein-Topf-Verfahren (siehe Schritt 1). Analoge 16-25 wurden alle durch Kondensieren von Pyrrolinon 9, Bromoisoindolon 10oder Isoindolon 11 mit 1 H-Imidazol-2-Carboxaldehyd (12), 1H-Imidazol-5-Carboxaldehyd(...

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Diskussion

Der Claisen-Schmidt-Kondensationsansatz bietet ein ziemlich robustes Mittel zur Erzeugung von Pyrazol, Imidazol und Isoindolon-Dipyrrinonfluorophoren durch ein relativ operativ vereinfachendes Protokoll. Während die Synthese der fluoreszierenden Dipyrrinonanaloga im Mittelpunkt dieser Studie stand, ist zu beachten, dass ähnliche Bedingungen auf andere bizyklische Methin-verbundene Ringsysteme wie Dipyrrinone23,24,25 und Pyrrol...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Z.R.W. und N.B. danken dem NIH (2P20 GM103440-14A1) für ihre großzügige Finanzierung sowie Jungjae Koh und der University of Nevada, Las Vegas für ihre Unterstützung beim Erwerb von 1H und 13C NMR. Darüber hinaus möchten wir uns bei den Studenten der visuellen Medien von NSC, Arnold Placencia-Flores, Aubry Jacobs und Alistair Cooper für ihre Hilfe bei den Film- und Animationsprozessen innerhalb der Kinematografie-Teile dieses Manuskripts bedanken.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
3-ethyl-4-methyl-3-pyrrolin-2-oneCombi-Blocks [766-36-9]Yellow solid reagent
isoindolin-1-oneArkPharm [480-91-1]Off-white solid reagent
5-bromoisoindolin-1-oneCombi-Blocks [552330-86-6]Pink solid reagent
2-formylimidazoleCombi-Blocks [10111-08-7 ]Off-white solid reagent
Imidazole-4-carbaldehydeArkPharm [3034-50-2]Solid reagent
1-H-pyrazole-4-carbaldehydeOakwood Chemicals [35344-95-7]Solid reagent
1-H-pyrazole-5-carbaldehydeMatrix Scientific [3920-50-1]Solid reagent
Solid KOH PelletsBeanTown Chemicals[1310-58-3]White solid pellets
Siliflash Silica GelScilicycleR12030BFine white powder
Phosphate Buffered Saline (PBS) (x10)GrowcellsMRGF-6235Colorless translucent liquid
Beckman Coulter DU-800 UV/Vis Spectrophotometer and SoftwareBeckman CoulterN/ASpectroscopy Instrument and Software
Fluoromax-4 SpectrofluorometerHoriba ScientificN/ASpectroscopy Instrument
FluorEssence Fluoremetry Software V3.5Horiba ScientificN/ASpectroscopy Software
Finnpipette II Micropipette (sizes: 100-1,000, 20-200, and 0.5-10 µL)FischerbrandN/AEquipment
Wilmad-LabGlass Rotary Evaporator (Model: WG-EV311-V-PLUS)SP SciencewareN/AEquipment
DuoSeal Vacuum Pump (Model Number: 1405)WelchN/AEquipment
GraphPad Prism 4GraphPadN/AData Analysis Software
SympHony pH Meter (Model: Sb70P)VWRN/AEquipment

Referenzen

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