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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
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  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
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  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

In einem Exzitotoxizitätsmodell von C. elegans verwendet dieses Protokoll In-vivo-Bildgebung, um die Regulation der nekrotischen Neurodegeneration, die Wirkung von Genen, die für Kandidatenmediatoren kodieren, und die Beteiligung von Mitochondrien zu analysieren. Die Zelldissoziation und -sortierung wird verwendet, um spezifisch gefährdete Neuronen für die zellspezifische transkriptomische Analyse von Neurodegenerations- und Neuroprotektionsmechanismen zu gewinnen.

Zusammenfassung

Die exzitotoxische Nekrose ist eine der führenden Formen der Neurodegeneration. Dieser Prozess der regulierten Nekrose wird durch die synaptische Akkumulation des Neurotransmitters Glutamat und die übermäßige Stimulation seiner postsynaptischen Rezeptoren ausgelöst. Es fehlen jedoch Informationen über die nachfolgenden molekularen Ereignisse, die in der ausgeprägten neuronalen Schwellungsmorphologie dieser Art der Neurodegeneration gipfeln. Andere Aspekte, wie z.B. Veränderungen in bestimmten subzellulären Kompartimenten oder die Grundlage für die unterschiedliche zelluläre Vulnerabilität verschiedener neuronaler Subtypen, sind noch wenig erforscht. Darüber hinaus können eine Reihe von Faktoren, die in Studien zum Tragen kommen, in denen In-vitro- oder Ex-vivo-Präparate verwendet werden, das natürliche Fortschreiten dieser Form der Neurodegeneration verändern und verzerren. Es ist daher wichtig, die exzitotoxische Nekrose bei lebenden Tieren zu untersuchen, indem die Auswirkungen von Eingriffen beobachtet werden, die das Ausmaß der neuronalen Nekrose im genetisch zugänglichen und transparenten Modellsystem des Fadenwurms Caenorhabditis elegans regulieren. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Untersuchung der exzitotoxischen Nekrose in C . elegans-Neuronen , wobei optische, genetische und molekulare Analysen kombiniert werden. Um exzitotoxische Zustände in C. elegans zu induzieren, wird ein Knockout eines Glutamattransporter-Gens (glt-3) mit einem neuronalen sensibilisierenden genetischen Hintergrund (nuls5 [Pglr-1::GαS(Q227L)]) kombiniert, um eine Glutamatrezeptor-Überstimulation und Neurodegeneration zu erzeugen. Nomarski-Differentialinterferenzkontrast (DIC), Fluoreszenz- und Konfokalmikroskopie bei lebenden Tieren sind Methoden, die zur Quantifizierung der Neurodegeneration, zur Verfolgung der subzellulären Lokalisierung fluoreszenzmarkierter Proteine und zur Quantifizierung der mitochondrialen Morphologie in den degenerierenden Neuronen verwendet werden. Neuronal Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) wird verwendet, um gefährdete Neuronen für die zelltypspezifische Transkriptomanalyse der Neurodegeneration eindeutig zu sortieren. Eine Kombination aus Live-Imaging- und FACS-Methoden sowie die Vorteile des Modellorganismus C. elegans ermöglichen es den Forschern, dieses System zu nutzen, um reproduzierbare Daten mit einer großen Stichprobengröße zu erhalten. Die Erkenntnisse aus diesen Assays könnten zu neuen Zielen für therapeutische Interventionen bei neurodegenerativen Erkrankungen führen.

Einleitung

Exzitotoxizität ist die Hauptursache für den neuronalen Tod bei Hirnischämie und ein beitragender Faktor bei mehreren neurodegenerativen Erkrankungen 1,2,3,4,5,6,7,8,9. Eine Störung des sauerstoffreichen Blutflusses zum Gehirn (z. B. aufgrund eines Blutgerinnsels) führt zu einer Fehlfunktion der Glutamattransporter, was zu einer Akkumulation von Glutamat in der Synapse führt. Dieser Überschuss an Glutamat überaktiviert postsynaptische Glutamatrezeptoren (GluRs), was zu einem übermäßigen (katalytischen, nicht-stöchiometrischen) Einstrom von Ca2+ in Neuronen führt (Abbildung 1A). Dieser nachteilige Einstrom führt zu einer fortschreitenden postsynaptischen Neurodegeneration, die morphologisch und mechanistisch von Apoptose bis hin zu regulierter Nekrose reicht 10,11,12. Obwohl sie auf erfolgreichen Interventionen in Tiermodellen basierten, sind mehrere klinische Studien mit GluR-Antagonisten, die darauf abzielten, den Eintritt von Ca2+ zu blockieren und die Zellviabilität zu fördern, im klinischen Umfeld gescheitert 13,14,15,16. Ein wahrscheinlich entscheidender Faktor für dieses Versagen ist die Tatsache, dass (im Gegensatz zu den Tiermodellen) die Behandlung im klinischen Umfeld Stunden nach Beginn des Schlaganfalls verabreicht wird, was dazu führt, dass die Intervention spät wirkende neuroprotektive Mechanismen blockiert, während die degenerative Signalübertragung stromabwärts von GluRs 14,16,17 nicht unterbrochen wird. Ein alternativer Ansatz, der auf der Thrombolyse basiert, kann nur in einem stark eingeschränkten Zeitfenster verabreicht werden, so dass viele Patienten (die zu Hause einen Schlaganfall mit schlecht erkennbarem Erkrankungszeitpunkt erleiden) nicht davon profitieren können17. Diese Rückschläge unterstreichen die Notwendigkeit, die Exzitotoxizitätsforschung auf die Untersuchung von Ereignissen zu konzentrieren, die nach einer GluR-Hyperstimulation auftreten, und nachfolgende degenerative Kaskaden von gleichzeitigen neuroprotektiven Prozessen zu unterscheiden. Dieser Ansatz kann dazu beitragen, Zellschäden zu verhindern und effiziente Wirkstoffziele zu identifizieren, die später nach dem Auftreten der Schädigung verabreicht werden können.

Ein Ansatz, um nachfolgende Ereignisse in der Exzitotoxizität zu identifizieren, besteht darin, die Zelltod-Signalmechanismen nach der GluR-Hyperstimulation zu untersuchen, wie z. B. diejenigen, die zum Mitochondrienkollaps führen. Eine drastische Fehlfunktion der mitochondrialen Physiologie und Dynamik ist ein Kennzeichen der Neurodegeneration, wie in der Exzitotoxizität 18,19,20 zu sehen ist. Während alle Zellen für das Überleben, die Aktivität und den Zellerhalt auf die Funktion und Verfügbarkeit der Mitochondrien angewiesen sind, sind Neuronen besonders auf die mitochondriale Energieproduktion angewiesen, um die Signalübertragung und -ausbreitung zu unterstützen. Konkret wenden Neuronen ~50% ihres signalbedingten Energieverbrauchs auf, um das Ruhemembranpotenzial nach der Aktivierung postsynaptischer Rezeptoren/Kanälewiederherzustellen 21, mit hoher Abhängigkeit von Sauerstoff und Glukose. Die beim Schlaganfall beobachtete verminderte Verfügbarkeit von Glukose und Sauerstoff führt zu schwerwiegenden mitochondrialen Veränderungen, die zu einer weiteren Verringerung der ATP-Produktion führen 19,22,23,24. Studien zur Identifizierung der Abfolge von Ereignissen, die zum Mitochondrienkollaps führen, führten jedoch zu kontroversen Ergebnissen und es fehlte an Konsens. Die Analyse der mitochondrialen Morphologie kann helfen, diese Ereignisse zu verstehen, die zur mitochondrialen Pathologie führen, da sie ein guter Indikator für die neuronale Gesundheit ist 25,26,27,28,29. Filamentöse Mitochondrien sind repräsentativ für ein gesundes Neuron, während fragmentierte Mitochondrien erhebliche neuronale Schäden aufweisen, die zum Zelltod führen können. Die Analyse der mitochondrialen Morphologie bei lebenden Tieren unter verschiedenen genetischen Bedingungen kann dazu beitragen, sich auf spezifische Gene und Signalwege zu konzentrieren, die an der mitochondrial-abhängigen Neurodegeneration bei Exzitotoxizität beteiligt sind.

Ein weiterer Ansatz zur Identifizierung nachfolgender Ereignisse, die das Ausmaß der exzitotoxischen Neurodegeneration regulieren könnten, besteht darin, die transkriptionellen neuroprotektiven Mechanismen zu untersuchen, die einige der Auswirkungen der Exzitotoxizität abschwächen14,16. Die mangelnde Spezifität der wichtigsten neuroprotektiven Transkriptionsfaktoren und die Divergenz der Versuchsanordnungen behindern jedoch den Erfolg der Bemühungen, die wichtigsten neuroprotektiven Programme (insbesondere bei regulierter Nekrose) eindeutig zu identifizieren.

Daher stießen sowohl die Untersuchung der nachgeschalteten Todessignalwege als auch die Untersuchung der transkriptionellen Neuroprotektion bei Exzitotoxizität auf große Schwierigkeiten und Meinungsverschiedenheiten über die beobachteten Ergebnisse. Ein Großteil dieser Kontroverse dürfte auf die Verwendung von ex vivo- oder in vitro-Modellen der Exzitotoxizität und die Variabilität zurückzuführen sein, die durch die Spezifität verschiedener Versuchsaufbauten entsteht. Es ist daher sehr vorteilhaft, sich auf die Identifizierung von Kernmechanismen zu konzentrieren, die hochkonserviert sind, und sie in vivo zu untersuchen. Das einfache Modellsystem des Fadenwurms C. elegans bietet eine besonders effektive Option, da es eine leistungsstarke und diversifizierte Kombination aus besonders leistungsfähigen und diversifizierten Forschungsinstrumenten, der Konservierung der Kernzelltodwege und den reichhaltigen Informationen über die Struktur und Konnektivität seines Nervensystems bietet 30,31,32,33. In der Tat ist die bahnbrechende Arbeit des Driscoll-Labors zur genetischen Analyse der nekrotischen Neurodegeneration in mechanosensorischen Neuronen ein hervorragender Beweis für die Leistungsfähigkeit dieses Ansatzes34. Wichtig für die Analyse der Exzitotoxizität ist, dass die Konservierung der Signalwege im Nematoden alle Hauptkomponenten der glutamatergen Neurotransmission umfasst35,36.

Das Nematoden-Exzitotoxizitätsmodell baut auf diesen bahnbrechenden Studien auf und ermöglicht es dem Forscher, biochemische Prozesse zu untersuchen, die denen ähneln, die bei Schlaganfällen und anderen neurodegenerativen Erkrankungen auftreten, die von Glutamat-abhängiger Neurotoxizität betroffen sind. Um exzitotoxische Bedingungen in C. elegans zu induzieren, wird in diesem experimentellen Ansatz ein Exzitotoxizitätsstamm verwendet, der die Kombination aus einem Knockout eines Glutamattransporter-Gens (glt-3) und einem neuronalen sensibilisierenden genetischen Hintergrund (nuls5 [Pglr-1::GαS(Q227L)]) ist, um eine GluR-Überstimulation und Neurodegenerationzu erzeugen 37. Dieser Exzitotoxizitätsstamm setzt 30 spezifische (glr-1-exprimierende) Neuronen, die postsynaptisch bis glutamaterge Verbindungen sind, einer exzitotoxischen Neurodegeneration aus. Von diesen 30 gefährdeten Neuronen durchlaufen einzelne Neuronen im Laufe der Entwicklung des Tieres eine Nekrose (mit gemischter Stochastizität und teilweiser Präferenz für bestimmte spezifische Neuronen38), während gleichzeitig auch Zellleichen allmählich entfernt werden. In Kombination mit der Zugänglichkeit vieler mutierter Stämme ermöglicht dieser Ansatz die Untersuchung mehrerer Signalwege, die Neurodegeneration und Neuroprotektion beeinflussen. Diese Ansätze wurden bereits verwendet, um einige der nachgeschalteten Todessignalkaskaden39 und transkriptionellen Regulatoren der exzitotoxischen Neurodegeneration bei Exzitotoxizitätzu analysieren 38,40. Wie bei anderen Fällen nekrotischer Neurodegeneration beim Wurm41 geht es bei der exzitotoxischen Neurodegeneration des Fadenwurms nicht um die klassische Apoptose40.

Diese Methodenarbeit beschreibt das grundlegende System zur Induktion, Quantifizierung und Manipulation der exzitotoxischen nekrotischen Neurodegeneration in C. elegans. Darüber hinaus werden zwei Hauptprotokolle beschrieben, die derzeit verwendet werden, um Studien zu spezifischen Aspekten der Nematoden-Exzitotoxizität zu rationalisieren. Durch die Verwendung von fluoreszierenden Reportern und Live-In-vivo-Bildgebung kann der Forscher die mitochondriale Beteiligung und Dynamik im Nematodenmodell der exzitotoxischen Neurodegeneration untersuchen. Um die Wirkung spezifischer neuroprotektiver Transkriptionsfaktoren zu bestimmen, kann der Forscher die zelltypspezifische Expression von Fluoreszenzmarkern, die Dissoziation von Tieren in einzelne Zellen und FACS verwenden, um spezifische Neuronen zu isolieren, bei denen das Risiko einer Nekrose durch Exzitotoxizität besteht. Diese zelltypspezifisch isolierten Neuronen können dann für die RNA-Sequenzierung in Stämmen verwendet werden, die Mutationen in wichtigen Transkriptionsfaktoren aufweisen. Zusammengenommen können diese Methoden es Forschern ermöglichen, die molekularen Grundlagen der exzitotoxischen Neurodegeneration und Neuroprotektion in vivo mit großer Klarheit und Präzision zu entschlüsseln.

Protokoll

1. Stämme, die zur Untersuchung der exzitotoxischen Neurodegeneration und Neuroprotektion verwendet werden

  1. Verwenden Sie den Nematoden-Exzitotoxizitätsstamm ZB1102 als Referenzpunkt für die standardmäßige exzitotoxische Neurodegeneration.
    HINWEIS: Die Glutamat-abhängige Exzitotoxizität in C. elegans wird im Stamm ZB1102 durch Kombination eines Knockouts (ko) eines Glutamattransporters mit einem Transgen erzeugt, das Neuronen in diesen Tieren für Neurotoxizität sensibilisiert und in einer Untergruppe von Neuronen postsynaptisch zu glutamatergen Verbindungen exprimiertwird 37. Diese genetische Kombination wird als Nematoden-Exzitotoxizitätsstamm bezeichnet und ist vom Caenorhabditis Genetics Center (CGC) frei erhältlich.
  2. Um die Wirkung von Genen zu untersuchen, die für Kandidatenregulatoren der exzitotoxischen Nekrose kodieren, kombinieren Sie eine Mutation in solchen Genen (z. B. dapk-1 oder crh-1) mit dem Nematoden-Exzitotoxizitätsstamm.
  3. Durchführung genetischer Kreuzungen nach Standardmethoden von C. elegans 30, wie in wormbook.org42,43 beschrieben.
  4. Da die molekularen Grundlagen der Mutation in der Regel dokumentiert sind, verfolgen Sie die Kreuzungsnachkommenschaft durch Genotypisierung des spezifischen Locus mittels PCR. Unterscheidung von WT und Mutante anhand der Fragmentgröße (für Deletionen) oder der Sequenzierung (für Punktmutationen).
    HINWEIS: Tabelle 1 zeigt Stämme, die speziell für dieses Protokoll zur Untersuchung unterschiedlicher Signalwege der Neurodegeneration und Neuroprotektion verwendet wurden.
  5. Leiten Sie alle kritischen Stämme von zwei unabhängigen Linien ab und testen Sie sie separat, um die Gültigkeit des beobachteten Phänotyps zu bestätigen.

2. Wachstumsmedien und Tierhaltung

  1. Züchten Sie Würmer bei 16-25 °C entweder auf Standard-NGM-Platten 30,37,42 oder MYOB-Platten 38,44, die mit OP50 E.coli nach Standardmethoden besät sind.
    HINWEIS: MYOB-Platten liefern identische Ergebnisse wie NGM-Platten, sind aber etwas einfacher zuzubereiten.
  2. Halten Sie die experimentellen Stämme konstant gut gefüttert.
    HINWEIS: Hunger kann die Neurodegeneration beeinflussen und die Anzahl der absterbenden Kopfneuronen verringern. Wenn Würmer schlecht gefüttert oder verhungert sind, legen Sie sie auf frische Teller und warten Sie einige Generationen, bevor Sie die Experimente fortsetzen. Der transgenerationale Effekt des Hungers wird nach einigen Generationen nachlassen.

3. Quantifizierung degenerierender Kopfneuronen durch Nomarski-Differentialinterferenzkontrast (DIC) und Scoring

  1. Für die Quantifizierung wird der Nematoden-Exzitotoxizitätsstamm (ZB1102: glt-3(bz34) IV; nuIs5 V) als experimentelle Kontrolle verwendet, der die normalen Exzitotoxizitätswerte darstellt. Das Protokoll verfolgt nicht dasselbe Tier durch verschiedene Entwicklungsstadien. Stattdessen gibt es eine Momentaufnahme einer gemischten Population von Tieren, so dass man insgesamt Informationen von verschiedenen Tieren sammelt, um alle Entwicklungsstadien zu repräsentieren.
    HINWEIS: Das nuls5-Transgen[Pglr-1::GαS(Q227L). Pglr-1::GFP]45 (das aktivierte Gαs und GFP in Neuronen postsynaptischer bis glutamaterger Verbindungen exprimiert) erzeugt ein Hintergrund-GluR-unabhängiges nekrotisches Neurodegenerationsniveau von ~1 sterbendem Kopfneuron/Tier (zu jedem Zeitpunkt während der Entwicklung). Die Zugabe von glt-3 (ko) erhöht die nekrotische Neurodegeneration der postsynaptischen nuIs5-exprimierenden Neuronen in einer GluR-abhängigen Weise, bis zu 4-5 absterbende Kopfneuronen/Tier im dritten Larvenstadium (L3)37.
  2. Für die Prüfstämme sind Tiere aus einer kürzlich abgeschlossenen genetischen Kreuzung zu verwenden oder interessante Stämme aus -80 °C gefrorenen Beständen aufzutauen, die aus frischen Kreuzungen hergestellt wurden. Warten Sie einige Generationen (≥4), bevor Sie einen Phänotyp und eine Neurodegeneration ermitteln.
  3. Schneiden und entfernen Sie ein kleines Stück Agar von einer Platte einer gemischten Population gut genährter Tiere und befestigen Sie es auf einem Deckglas, indem Sie das Agar-Stück umdrehen, so dass die Tiere, die auf der Oberfläche des Agars kriechen, nun dem Deckglas zugewandt sind.
    HINWEIS: Die Tiere können sich noch bewegen, sind aber jetzt etwas gefesselt und können ohne Betäubung beobachtet werden. Ein solches Stück kann ~1 Stunde lang verwendet werden, bevor es durch ein frisches ersetzt wird.
  4. Mit einem invertierten DIC-Zielfernrohr mit x10-Okular und wahlweise x40- oder x63-Objektiv scannen Sie die Tiere nach dem Zufallsprinzip, indem Sie das Deckglas manuell verschieben. Während andere im Folgenden beschriebene bildgebende Schritte entweder an inversen oder aufrechten Mikroskopen durchgeführt werden können, erfordert die Untersuchung von Würmern im Agarblock ein invertiertes Oszilloskop.
  5. Identifizieren Sie das Entwicklungsstadium jedes Tieres anhand der Form seiner Gebärmutter (siehe Gebärmutterdiagramme in wormbook.org).
  6. Notieren Sie für jedes Tier sein Entwicklungsstadium und die Anzahl der sterbenden (d. h. vakuolierten) Neuronen. Zählen und notieren Sie die Gesamtzahl der sterbenden Neuronen im Kopf, die Anzahl der sterbenden Neuronen im retrovesikulären Ganglion (was eine einfache Identifizierung bestimmter Zellen ermöglicht) und die Anzahl der sterbenden Neuronen im Schwanz (der von Glutamat nicht beeinflusst wird und als interne Kontrolle dient, um zu bestätigen, dass das sensibilisierende Transgen nuIs5 voll aktiv ist).
  7. Notieren Sie diese Daten in einer Tabelle, in der die Tiere eines bestimmten Stammes nach Kategorien des Entwicklungsstadiums gruppiert sind.
  8. Sammeln Sie in jeder Sitzung nach dem Zufallsprinzip Daten von Würmern aus verschiedenen Entwicklungsstadien. Führen Sie mehrere Scoring-Sitzungen über mehrere Tage durch, um genügend Daten für die statistische Analyse zu sammeln. Zeichnen Sie die Neurodegenerationsstufen in mehreren Stadien auf und erstellen Sie ein Balkendiagramm ähnlich wie in Abbildung 1C.
    HINWEIS: Mit dieser Methode kann festgestellt werden, ob eine bestimmte Behandlung oder Mutation die Neurodegeneration in allen Stadien erhöht/verringert (Verschiebung der Verteilung nach oben/unten) oder den Höhepunkt der Neurodegeneration in ein früheres oder späteres Entwicklungsstadium verschiebt (Verschiebung der Verteilung nach links/rechts).
  9. Führen Sie eine Datenerfassung durch, während Sie für die Identität des Genotyps blind sind. Bestätigen Sie in zwei unabhängigen Isolaten der genetischen Linie (um die Gefahr unbeabsichtigter Auswirkungen anderer/unerwarteter genetischer Unterschiede zwischen den Isolaten zu minimieren) und poolen Sie die Daten für die Analyse.
  10. Berechnen Sie für jeden Stamm den Durchschnitt und das SEM der Anzahl der degenerierenden Neuronen im Kopf (einschließlich des retrovesikulären Ganglions) in jedem Entwicklungsstadium (Abbildung 1D). Führen Sie bei Bedarf eine ähnliche Analyse von absterbenden retrovesikulären Ganglien und Schwanzneuronen durch.

4. Identifizierung spezifischer degenerierender Kopfneuronen

  1. Setzen Sie einzelne Tiere (oder kleine Gruppen von-) Tieren auf ein Agarpad46 und lähmen Sie den Wurm mit Tetramisol (siehe unten, Abschnitt 5).
  2. Mit einem kombinierten Fluoreszenz- und DIC-Oszilloskop (aufrecht oder invertiert) können spezifische vakuolisierte Neuronen lokalisiert werden.
  3. Bestimmen Sie die spezifische Neuronenidentität des vakuolisierten Neurons, indem Sie seine GFP-markierten Prozesse verfolgen und die Lage des Zellkörpers und die Form der Prozesse mit denen der Neuronen vergleichen, von denen bekannt ist, dass sie glr-1 exprimieren, indem Sie WormAtlas47 verwenden.
    HINWEIS: Alternativ kann die Identifizierung durch neue Methoden zur schnellen Identifizierung von Neuronen durch mehrfarbige Markierung unterstützt werden, die in Kürze aus dem Hobert-Labor48 kommen.

5. Live-Bildgebung der neuronalen mitochondrialen Morphologie durch Fluoreszenzmikroskopie von Reporterstämmen

  1. Zur Bildgebung von mitochondrialen Veränderungen in degenerierenden postsynaptischen Neuronen (die im ursprünglichen Exzitotoxizitätsstamm mit zytoplasmatischem GFP markiert sind) untersuchen Sie die mito-mCherry-Fluoreszenz.
  2. Kreuzen Sie den Test-Exzitotoxizitätsstamm mit Stämmen, die Mitochondrien postsynaptischer Neuronen mit roter Fluoreszenz markieren (durch Expression einer Fusion zwischen dem fluoreszierenden Protein und dem N-Terminus von TOM-20 unter glr-1-Promotor ; für Details zu Konstrukten und Stämmen siehe49). Tiere können nun mit einem normalen Epifluoreszenzmikroskop (aufrecht oder invers) oder einem konfokalen Mikroskop abgebildet werden.
  3. Um den Wurm zu lähmen, ohne das Überleben der Neuronen zu beeinträchtigen, pipettieren Sie 5 μl 10 mM Tetramisol auf ein frisch vorbereitetes Agarose-Pad. Siehe Arnold et al.46 für ein detailliertes Protokoll zur Pad-Vorbereitung.
  4. Setzen Sie die Tiere in die Mitte des Tetramisols, lassen Sie sie fallen und montieren Sie sie mit einem Deckglas.
  5. Versiegeln Sie die Seiten des Deckglases mit Nagellack und lassen Sie den Nagellack trocknen.
  6. Innerhalb von 20 Minuten nach der Tetramisolbehandlung und unter Verwendung eines Zielfernrohrs mit DIC und Fluoreszenzbildgebung können Würmer mit einer 20-fachen Objektivlinse lokalisiert werden.
  7. Sobald der Kopf des Wurms (oder die Neuronen von Interesse) lokalisiert sind, begeben Sie sich zu einem 100-fachen Ölobjektiv und konzentrieren Sie sich auf die Fluoreszenzmarkierung der Mitochondrien im Soma.
  8. Erfassen Sie Z-Stack-Bilder mit den Filtereinstellungen DIC, GFP und TxRed.

6. Bewertung und Quantifizierung der Morphologie der neuronalen Mitochondrien

  1. Analysieren Sie die mitochondriale Morphologie entweder während der Live-Bildgebung des Wurms oder nach der Bildaufnahme mit ImageJ oder einer anderen Bildgebungssoftware.
  2. Zur einfachen Identifizierung und wiederholten Analyse spezifischer Neuronen identifizieren Sie die drei Neuronen im retrovesikulären Ganglion, RIGL/R und AVG (in einigen Fällen sind aufgrund der Zellleichenbeseitigung bei Exzitotoxizität nur zwei vorhanden).
  3. Kategorisieren Sie Mitochondrien in drei Hauptgruppen: filamentös, intermediär und fragmentiert 50,51,52.
    HINWEIS: Filamentöse Mitochondrien erscheinen als durchgehende dünne Strukturen im Soma von Neuronen, die normalerweise den Zellkern umgeben. Intermediäre Mitochondrien erscheinen als eine Kombination aus mindestens einem scheinbaren filamentösen Netzwerk, wenn auch mit Brüchen, und einer gewissen Fragmentierung im Soma. Fragmentierte Mitochondrien weisen vollständige Brüche im mitochondrialen Netzwerk auf, haben ein geschwollenes Aussehen und sind über das gesamte Soma verstreut (Abbildung 2A).
  4. Bewerten Sie für jeden Wurm den Prozentsatz der Neuronen mit filamentösen, intermediären oder fragmentierten Mitochondrien für insgesamt mindestens 30 Würmer.
  5. Führen Sie eine statistische Analyse unter Verwendung einer unidirektionalen ANOVA durch, gefolgt von einem Post-hoc-Tukey-Test für jede mitochondriale Morphologie zwischen den Stämmen53.

7. Puffer- und Reagenzpräparation für die Wurmdissoziation bei FACS von Neuronen mit Neurodegenerationsrisiko

  1. M9-Puffer wie folgt zubereiten: 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, H2O bis 1 L. Durch Autoklavieren sterilisieren. 1 ml filtersterilisiertes 1 M MgSO4 zugeben. Bei Raumtemperatur lagern.
  2. Bereiten Sie den Eipuffer wie folgt vor: 118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 ; Autoklav zum Sterilisieren. 2 M HEPES pH 7,3 Stammlösung (zuvor mit einem 0,2 μm Flaschenfilter filtriert) auf eine Endkonzentration von 25 mM geben. Stellen Sie den pH-Wert mit 1 N NaOH (nicht mehr als 10 ml) auf 7,3 ein. Verwenden Sie das Osmometer, um sicherzustellen, dass die endgültige Osmolarität zwischen 335 und 345 mOsm liegt. Filter sterilisieren Eipuffer mit 0,2 μm Flaschenaufsatzfiltern. Bei 4 °C lagern.
    HINWEIS: Die Salze lösen sich leichter auf, wenn MgCl2 ·6H2O und CaCl2·2H2O zur Herstellung von MgCl2 und CaCl2 Stammlösungen verwendet werden. Sie können auch einen Vorrat von 10x Eipuffer herstellen und ihn bei Bedarf in sterilem entionisiertem Wasser verdünnen.
  3. SDS-DTT wie folgt herstellen: 20 mM HEPES pH 8,0, 0,25 % SDS, 200 mM DTT, 3 % Saccharose. In einer Gewebekulturhaube wird SDS-DTT mit einem 0,2 μm Spritzenvorsatzfilter sterilisiert. Lagern Sie 300 μl Aliquots bei -20 °C in Folie zum Schutz vor Licht.
  4. Bereiten Sie die Pronaselösung wie folgt vor: Bereiten Sie am Tag der Dissoziation 15 mg/ml Pronase in Eipuffer vor. Auf Eis lagern.

8. Alterssynchronisation für neuronenspezifische FACS

  1. Verwenden Sie Tiere, die den Exzitotoxizitätsgenotyp (und andere Mutationen, falls gewünscht) mit der transgenen Expression eines starken Fluoreszenzmarkers kombinieren, der leicht für die Sortierung verwendet werden kann (z. B. FJ1244: pzIs29 [Pglr-1::NLS::LAC-Z::GFP::glr-1 3'UTR] X)54. Züchten Sie die Tiere auf zwei oder drei 100 mm NGM/MYOB-Platten bei 20 °C, bis die Platte mit überwiegend trächtigen Würmern gefüllt ist.
  2. Waschen Sie die Würmer mit M9-Puffer von den Platten. Übertragen Sie die Würmer mit einer serologischen 10-ml-Glaspipette in konische 50-ml-Röhrchen.
  3. Bei Raumtemperatur 2,5 min bei 250x g zentrifugieren und den Überstand entfernen.
  4. Resuspendieren Sie das Wurmpellet in 10 ml Bleichlösung (2 % 10 N NaOH und 5 % frisches Haushaltsbleichmittel in sterilem entionisiertem Wasser).
  5. Platzieren Sie die Rohre horizontal auf einem Shaker und schaukeln Sie mit niedriger Geschwindigkeit. Achten Sie darauf, dass sich die Würmer nicht am Boden des Rohres absetzen. Das Bleichmittel reißt die Kutikula des Wurms auf, greift aber die Embryonen nicht an, die durch die Eischale geschützt sind.
    1. Dieser Bleichschritt dauert ca. 5 Minuten, variiert jedoch. Um sicherzustellen, dass es nicht zu einem Überbleichen kommt, überwachen Sie den Prozess, indem Sie jede Minute eine Probe entnehmen: Pipettieren Sie vorsichtig 10 μl aus jedem Röhrchen auf einem Glasobjektträger und untersuchen Sie die Würmer mit einem Präpariermikroskop.
  6. Sobald die meisten trächtigen Würmer aufgebrochen, aber nicht vollständig aufgelöst sind, stoppen Sie den Bleichschritt, indem Sie die konischen Röhrchen mit Eipuffer füllen.
  7. Um die Eizellen/Embryonen zu entnehmen, zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 250x g für 2,5 min, entfernen Sie den Überstand und waschen Sie sie erneut mit Eipuffer.
  8. Wiederholen Sie vier weitere Wäschen.
  9. Resuspendieren Sie die Eier, indem Sie das Pellet vorsichtig pipettieren und auf vier 100 mm besäte NGM/MYOB-Platten verteilen. Lassen Sie die Embryonen 3 Tage lang bei 20 °C schlüpfen und wachsen.
    HINWEIS: Die Platten sollten nun mit überwiegend trächtigen Würmern gefüllt sein.
  10. Wiederholen Sie die Alterssynchronisierung, indem Sie dieses Bleich-/Alterssynchronisierungsprotokoll wiederholen.
  11. Pipettieren Sie die Eier auf acht 100 mm NGM/MYOB-Platten. Lassen Sie das Tier schlüpfen und wachsen bei 20 °C bis zum gewünschten Larvenstadium.

9. Dissoziation ganzer Wurmzellen bei FACS

  1. Züchten Sie synchronisierte Würmer bis zum gewünschten Entwicklungsstadium. Waschen Sie die 100-mm-Platten vorsichtig mit M9-Puffer und serologischen Glaspipetten ab und geben Sie sie in konische 50-ml-Röhrchen.
  2. Fügen Sie kaltes M9 bis zu 45 ml hinzu. Legen Sie die Röhrchen 30 Minuten lang auf Eis, damit sich die Würmer durch die Schwerkraft am Boden ansiedeln können, während alle bakteriellen Rückstände von den Platten im Überstand schwimmen.
  3. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Würmer mit frischem M9.
  4. Wiederholen Sie das 30-minütige Absetzen der Schwerkraft auf dem Eis.
  5. Entfernen Sie den Überstand, fügen Sie M9 bis zu 45 ml hinzu und zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 250 x g .
  6. Übertragen Sie das Pellet in ein Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie M9 bis zu 1 mL hinzu.
  7. Bei 14.000 U/min auf einer Tischzentrifuge drehen und den Überstand entfernen.
  8. Um die Kutikula zu zerstören, resuspendieren Sie das Wurmpellet mit SDS-DTT mit (ungefähr) dem doppelten Volumen des Pellets und inkubieren Sie es unter Schaukeln bei Raumtemperatur für 4 Minuten für L2-adulte Stadien.
    HINWEIS: Überschreiten Sie nicht die Inkubationszeit von 4 Minuten in SDS-DTT, da das fluoreszierende Proteinsignal bei längerer Behandlung mit SDS-DTT drastisch abnimmt. Da das SDS-DTT lichtempfindlich ist, sollte es nicht älter als 3 Monate sein, da die Lösung mit der Zeit an Wirksamkeit verloren haben kann. Dissoziationen funktionieren am besten mit einer kürzlich erstellten SDS-DTT-Lösung.
  9. Fügen Sie 1x Eipuffer (pH 7,3, 335-345 mOsm) bis zu 1 mL hinzu, um die SDS-DTT-Behandlung zu stoppen.
  10. Bei 14.000 U/min auf einer Tischzentrifuge 1 Minute lang drehen und den Überstand entfernen.
  11. Um die Kutikula weiter zu zerstören und die Zellen der Tiere zu dissoziieren, resuspendieren Sie das Pellet mit Pronaselösung bei Raumtemperatur, wobei das dreifache Volumen des Pellets verwendet wird.
  12. Bei Raumtemperatur 15-30 min inkubieren.
  13. Pipettieren Sie alle 5 Minuten 40 Mal mit einer P-200- oder P-1000-Pipette auf und ab und berühren Sie mit der Pipettenspitze den Boden des Röhrchens.
    HINWEIS: Der Druck, der durch die Spitze erzeugt wird, die den Boden des Rohrs berührt, erleichtert die Dissoziation der Schnecken. Verwenden Sie eine Filterspitze, damit die Würmer beim schnellen Pipettieren nicht versehentlich in den Pipettenschaft gelangen.
  14. Überprüfen Sie nach 15 Minuten den Fortschritt der Wurmdissoziation, indem Sie 5 μl vorsichtig auf einen Objektträger pipettieren und den Fortschritt unter einem Präpariermikroskop beobachten. Wenn die meisten (~90%) der intakten Würmer geplatzt sind, ist der Prozess abgeschlossen.
    HINWEIS: Die Pronase-Inkubation kann verlängert werden, wenn viele Würmer intakt bleiben.
  15. In einer Zellkulturhaube 1x Eipuffer bis zu 1,5 ml hinzufügen, um die Pronasebehandlung zu stoppen.
  16. In FACS-Röhrchen umfüllen, 5 ml Eipuffer hinzufügen und 5 Minuten lang bei 800 x g schleudern.
  17. Überstand entfernen und in 3 ml Eipuffer resuspendieren.
  18. Setzen Sie eine 70-μm-Zellsiebkappe auf neue FACS-Röhrchen, pipettieren Sie die Zellsuspension auf das Sieb und drehen Sie sie 1 Minute lang bei 800 x g . Sammeln Sie die Efflux-Zellsuspension.
  19. Setzen Sie eine 5-μm-Zellsiebkappe auf neue FACS-Röhrchen, pipettieren Sie die Zellsuspension auf das Sieb und drehen Sie sie 1 Minute lang bei 800 x g .
  20. DAPI für eine Endkonzentration von 0,5 μg/ml in Eipuffer geben und zum Schutz vor Licht mit Deckel/Abdeckung auf Eis legen.
  21. Führen Sie FACS so schnell wie möglich durch. Das fluoreszierende Proteinsignal nimmt mit der Zeit und der Lichteinwirkung ab, daher ist es wichtig, das Dissoziationsprotokoll so schnell wie möglich durchzuführen und die FACS unmittelbar nach Abschluss der Dissoziation durchzuführen.
    HINWEIS: Das Wurmdissoziationsprotokoll wurde von Protokollen aus dem Miller-Labor55, 56, 57, dem Murphy-Labor58 und dem Shaham-Labor59 angepasst.

10. Modifikationen des FACS-Maschinenbetriebs zur Identifizierung von C. elegans-Neuronen

  1. Verwenden Sie beim Sortieren der Neuronen von C. elegans 4 Liter gekühlten (4 °C) Eipuffer anstelle der üblichen Scheidenflüssigkeit.
    HINWEIS: Die Osmolarität von C. elegans-Zellen ist viel höher als die von Säugetierzellen und die Standard-Scheidenflüssigkeit lässt die Neuronen platzen. Alle Maschineneinstellungen und Kalibrierungen werden nach der Zugabe des Eipuffers vorgenommen, da sich die Viskosität des Eipuffers von der der Standardscheidenflüssigkeit unterscheidet. Der Sortiertechniker führt die Diagnoseperlen durch die Maschine, um sicherzustellen, dass die Laser ordnungsgemäß funktionieren.
  2. Wenn sortierte Neuronen in nachfolgenden Transkriptomik-Studien verwendet werden sollen, sortieren Sie mindestens 100.000 GFP+-Zellen direkt in 800 μl Trizol-LS + 10 μl RNase-Inhibitor.
  3. Invertieren Sie die Zellen in Trizol 15 Mal, um sie zu mischen.
  4. In einem Trockeneis-/Ethanolbad einfrieren und bei -80 °C lagern, bis die RNA aus allen Proben für ein RNA-Sequenzierungsexperiment extrahiert werden kann.
    HINWEIS: Während die meisten sortierten Zellen für die Transkriptomanalyse direkt in Trizol gesammelt werden, stellen Sie sicher, dass Sie eine kleine Probe von GFP+-sortierten Zellen (von jedem Stamm) entnehmen, die in Eipuffer gesammelt wurden, um die Effizienz der Sortierung mikroskopisch zu validieren.

11.FACS-Gating-Strategie

  1. Zur Identifizierung des positiven GFP-Signals verwenden Sie den 488-nm-Laser mit dem 530/30-Filter und dem 502-Langpass (LP).
  2. Zur Identifizierung von DAPI-positiven und -negativen Zellen wird der 405-nm-Laser mit dem 450/50-Filter verwendet.
  3. Zur Identifizierung von autofluoreszierenden Zellen, die mit GFP-positiven Zellen verwechselt werden könnten, verwenden Sie den 488-nm-Laser mit dem 610/20-Filter und 595 LP (persönliche Mitteilung, Stanka Semova, Operations Manager, Flow Cytometry Resource Center, Rockefeller University).
  4. Führen Sie eine standardmäßige Gating-Strategie aus, und entfernen Sie Ereignisse mit einer großen seitlichen Streufläche (SSC-A) und einer kleinen vorderen Streufläche (FSC-A), die wahrscheinlich Klumpen von Zellen und Ablagerungen darstellen.
  5. Isolieren Sie die Vorwort-Scatter-Unterhemden und dann die Seiten-Scatter-Singuletts.
  6. Isolieren Sie Zellen mit hohem GFP-Signal und niedrigem Autofluoreszenzsignal.
    HINWEIS: Zellen mit einer hohen Autofluoreszenz und einem niedrigeren GFP-Gehalt sind keine echten GFP-positiven Zellen.
  7. Der Schwellenwert für das GFP+-Gate wird durch den Vergleich von GFP-Zellen (d.h. N2) mit GFP+-Zellen bestimmt55,56.
  8. Entfernen Sie alle toten Zellen mit einem Lebend-/Totgatter, basierend auf der selektiven Permeabilität von DAPI für tote Zellen: Der Schwellenwert für das Lebendentor wird durch den Vergleich von ungefärbten Zellen mit DAPI-gefärbten Zellen bestimmt.
    HINWEIS: Wenn Sie mehrere Proben sortieren, spülen Sie den Strom zwischen den Proben, um sicherzustellen, dass keine Kreuzkontamination vorliegt.

12. Mikroskopie von sortierten Neuronen zur Validierung der Effizienz der FACS-Gating-Strategie

  1. Zeichnen Sie mit einem flüssigkeitsabweisenden Stift einen Kreis auf einen Objektträger aus Glas.
  2. Pipettieren Sie 10 μl der sortierten Zellen in Eipuffer innerhalb des Kreises. Legen Sie ein Deckglas über die Probe und versiegeln Sie es mit Nagellack.
  3. Nachdem der Nagellack getrocknet ist, überprüfen Sie unter dem aufrechten/inversen Fluoreszenzmikroskop, ob es sich bei den sortierten Zellen tatsächlich hauptsächlich um GFP+-Zellen handelt.
    HINWEIS: Führen Sie diese Prüfung nach jeder Sortiersitzung durch, um die FACS-Gating-Strategie57 zu validieren.

13. RNA-Extraktion und Quantifizierung der RNA-Qualität auf einem automatisierten Elektrophoresesystem zur Qualitätskontrolle

HINWEIS: Alle RNA-Arbeiten sollten mit äußerster Sorgfalt durchgeführt werden, um eine Kontamination mit RNase zu vermeiden (einschließlich der sorgfältigen Vorbereitung von Reagenzien, Verbrauchsmaterialien und der besten RNase-sicheren Praktiken).

HINWEIS: Führen Sie alle Schritte durch, bei denen Proben Phenol und/oder Chloroform in einem Abzug enthalten.

  1. Fläschchen mit Zellen in Trizol bei Raumtemperatur auftauen.
  2. Pipettenspitze P200 mit einer Filterspitze mehrmals auf und ab pipettieren, um die Probe zu homogenisieren.
  3. 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
  4. Fügen Sie 0,2 ml Chloroform pro 1 ml Trizol-Reagenz hinzu, das für die Lyse verwendet wird, und verschließen Sie dann das Röhrchen fest.
  5. Die Röhrchen 15 Mal umdrehen und 2-3 Minuten (bei 20-25 °C) inkubieren.
  6. Die Probe wird 15 Minuten lang bei 12.000 × g bei 4 °C zentrifugiert. Das Gemisch trennt sich in eine untere rote Phenol-Chloroform, eine Interphase und eine farblose obere wässrige Phase.
  7. Entnehmen Sie ausschließlich die obere wässrige Phase, die die RNA enthält, und übertragen Sie sie in ein neues 1,5-ml-Röhrchen mit niedriger DNA/RNA-Bindung.
    HINWEIS: In einigen Fällen, wenn das Verhältnis der Zellen im Eipuffer, die aus dem Zellsortierer in Trizol gefallen sind, größer als ein Verhältnis von 1:3 Probe zu Trizol-LS ist, kann der hohe Salzgehalt des Eipuffers dazu führen, dass die Schichten invertiert werden. In diesem Fall fügen Sie mehr Trizol-LS hinzu und wiederholen Sie die Umkehrung und Zentrifugation. Dies kann auch vermieden werden, wenn Sie die Zunahme des Probenvolumens nach der Sortierung beachten; Wenn das Verhältnis von 1:3 nicht eingehalten wird, fügen Sie ausreichend Trizol hinzu, bevor Sie mit der RNA-Extraktion beginnen.
  8. Um die RNA weiter zu reinigen, verwenden Sie die Chemie der RNA-Extraktionssäulen.
  9. Verwenden Sie das automatisierte Elektrophoresesystem der Qualitätskontrolle, um die RNA-Integritätszahl (RIN) zu messen und eine RNA-RIN von 8,0 oder höher für die Eingabe in nachfolgende RNA-Sequenzierungsexperimente zu bestätigen.

Ergebnisse

Nematodenmodell der Exzitotoxizität und Identifizierung vakuolisierter degenerierender Neuronen
Die hier gezeigten Daten stammen aus früheren Veröffentlichungen37,38. Um die exzitotoxisch induzierte Neurodegeneration nachzuahmen, wird ein Glutamat-Transporter-Gen-Knockout (glt-3) mit einem neuronalen sensibilisierenden transgenen Hintergrund kombiniert (nuls5

Diskussion

Während die vorherrschenden Kontroversen und Misserfolge darauf hindeuten, dass Exzitotoxizität ein außergewöhnlich schwer zu entschlüsselnder Prozess ist, bietet die Analyse der Exzitotoxizität im Fadenwurm eine besonders attraktive Strategie, um konservierte neuronale Zelltodwege bei dieser kritischen Form der Neurodegeneration zu beleuchten. Der Untersucher kann sich auf die reichhaltige Sammlung von Forschungsinstrumenten verlassen, die in diesem System zur Verfügung stehen, i...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken allen Mitgliedern des Mano Lab und des Li Labs (aktuell und aktuell) für ihre Hilfe und Unterstützung. Wir danken Dr. Monica Driscoll (Rutgers Univ.) für ihre Pionierarbeit bei der Analyse der nekrotischen Neurodegeneration bei Nematoden und die kontinuierliche Unterstützung; Dr. Chris Li (CCNY) für Unterstützung und Beratung; Jeffery Walker (CCNY Flow Cytometry Core Facility), Dr. Bao Voung (CCNY) und Stanka Semova (Rockefeller Univ. Sorting Faculty Core) für praktische Unterstützung und Beratung bei der Zellsortierung; Dr. Chris Rongo (Rutgers Univ.) für Reagenzien; Dr. David Miller (Vanderbilt Univ.), Coleen Murphy (Princeton Univ.), Shai Shaham, Menachem Katz und Katherine Varandas (alle drei von der Rockefeller Univ.) für C. elegans-Dissoziationsprotokolle.

Das Mano-Labor erhielt Mittel von NIH NINDS (NS096687, NS098350, NS116028) an I.M. und durch eine NIH U54 CCNY-MSKCC-Partnerschaft (CA132378/CA137788).

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
AgarVWRAAA10752-0E
BactopeptoneVWR90000-264
BD FACSAriaIII BD
BleachAny household
CaCl2VWR97062-586
CaCl2·2H2O BioExpress0556-500G
Cell Strainer, PluriStrainer mini 70umPluriSelect43-10070-40
Cell Strainer, PluriStrainer mini 5umPluriSelect43-10005-60
Centrifuge - 15-50 mL Sorval benchtop  LEGENDX1R TC Fisher Sci75618382
Centrifuge - microfuge ; Ependorff 5424VWRMP022629891
ChloroformVWR97064-680
CholesterolSigmaC8667-25G
DAPIFisher SciEN62248
Dry iceUnited City Ice Cube
DTTVWR97061-340
E. coli OP50CGCOP50
Ethanol (100%)VWREM-EX0276-1S
Ethanol (90%)VWRBDH1160-4LP
FACS tubesUSA Sci1450-2810
Filter tips USA Sci1126-7810
Glass 10 mL serological pipettes USA Sci1071-0810
Heating block BioExpressD-2250
Hepes VWR97061-824
Immersion Oil - Carl Zeiss ImmersolFisher Sci12-624-66A
IsopropanolVWREM-PX1830-4
KClVWRBDH9258-2.5KG
KH2PO4VWRBDH9268-2.5KG
Low bind 1.5mL tubesUSA Sci4043-1021
Metamorph Imaging SoftwareMolecular Devices
MgCl2VWR97063-152
MgCl2·6H2OBioExpress0288-500g
MgSO4VWR97061-438 
Microscope, Confocal, for Fluorescence ImagingZeissLSM 880
Microscope, Inverted, for Fluorescence ImagingZeissAxiovert 200 M
Microscope  CameraQ-ImagingRetiga R1
Microscope Light Source for Fluorescence ImagingLumencorSOLA SE Light Engine
Microscope, Nomarski DICZeissAxiovert Observer A1
Microscope, Nomarski DICNikonEclipse Ti-S
Na2HPO4VWR97061-588
NaClVWRBDH9286-2.5KG
NaOHVWR97064-476
Petri dishes, 100mmFisher SciFB0875712
Petri dishes, 60mmTriTechT3308
Pipet ControllerTEquipmentP2002
Pipettor P10 TipsUSA Sci1110-3000
Pipettor P1000 TipsUSA Sci1111-2020
Pipettor P200 TipsUSA Sci1110-1000
PronaseSigmaP8811-1G
RNAse away sprayFisher Sci7000TS1
RNAse free serological pipettesUSA Sci1071-0810
RNAse-free 50 mL tubesUSA Sci5622-7261
RNeasy microQiagen74004
SDSVWR97064-496
Streptomycin sulfateSigmaS6501-100G
SucroseVWRAAJ63662-AP
SUPERase·in RNase inhibitorFisher SciAM2694
Quality Control automated electrophoresis system: Tapestation - High Sensitivity RNA ScreenTape Agilent5067-5579 
Tapestation - High Sensitivity RNA ScreenTape Ladder Agilent5067-5581 
Tapestation - High Sensitivity RNA ScreenTape Sample Buffer Agilent5067-5580
Tapestation - IKA MS3 vortexerAgilent/IKA4674100
Tapestation - IKA vortexer adaptor at 2000 rpm Agilent/IKA3428000
Tapestation - Loading tips Agilent5067- 5152 or 5067- 5153
Tapestation - Optical Cap 8x StripAgilent401425
Tapestation - Optical Tube 8x StripAgilent401428
Quality Control automated electrophoresis system: TapeStation 2200AgilentG2964AA
TetramisoleSigmaL9756-10G
Tris baseFisher SciBP152-500
Tris hydrochlorideFisher SciBP153-500
Trizol-LSFisher Sci10296-010
Wescor Vapro 5520 Vapor Pressure OsmometerFisher SciNC0044806
Wheaton Unispense μP DispenserVWR25485-003

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