Verwendung von Immunfluoreszenz zum Nachweis von PM2,5-induziertenDNA-Schäden in Zebrafisch-Embryoherzen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll verwendet einen Immunfluoreszenz-Assay, um PM_{2,5-induzierte}DNA-Schäden in den sezierten Herzen von Zebrafischembryonen nachzuweisen.

Zusammenfassung

Die Exposition gegenüber Feinstaub (PM_2,5)in der Umgebung kann zu einer kardialen Entwicklungstoxizität führen, aber die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sind noch unklar. 8-Hydroxy-2'-Desoxygenase (8-OHdG) ist ein Marker für oxidative DNA-Schäden und γH2AX ist ein empfindlicher Marker für DNA-Doppelstrangbrüche. In dieser Studie wollten wir PM_{2,5-induzierte}8-OHdG- und γH2AX-Veränderungen im Herzen von Zebrafischembryonen mit einem Immunfluoreszenz-Assay nachweisen. Zebrafischembryonen wurden mit extrahierbaren organischen Fasern (EOM) aus PM_2,5 bei 5 μg/ml in Gegenwart oder Abwesenheit von antioxidativem N-Acetyl-L-Cystein (NAC, 0,25 μM) nach 2 h nach der Befruchtung (hpf) behandelt. DMSO wurde als Fahrzeugsteuerung eingesetzt. Bei 72 HPF wurden Herzen mit einer Spritzennadel aus Embryonen seziert und fixiert und permeabilisiert. Nach der Blockierung wurden die Proben mit primären Antikörpern gegen 8-OHdG und γH2AX untersucht. Die Proben wurden dann gewaschen und mit sekundären Antikörpern inkubiert. Die resultierenden Bilder wurden unter Fluoreszenzmikroskopie beobachtet und mit ImageJ quantifiziert. Die Ergebnisse zeigen, dass EOM aus PM_2,5 die 8-OHdG- und γH2AX-Signale im Herzen von Zebrafischembryonen signifikant verbesserte. NAC, das als reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) -Fänger fungierte, wirkte jedoch dem EOM-induzierten DNA-Schaden teilweise entgegen. Hier stellen wir ein Immunfluoreszenzprotokoll zur Untersuchung der Rolle von DNA-Schäden bei PM_{2,5-induzierten}Herzfehlern vor, das zum Nachweis von umweltchemisch induzierten Proteinexpressionsveränderungen in den Herzen von Zebrafischembryonen angewendet werden kann.

Einleitung

Luftverschmutzung ist heute ein ernstes Umweltproblem, mit dem die Welt konfrontiert ist. Feinstaub (PM_2.5),einer der wichtigsten Indikatoren für die Luftqualität, kann eine große Anzahl von Schadstoffen enthalten und in den Blutkreislauf gelangen, was die menschliche Gesundheit ernsthaft schädigt¹. Epidemiologische Studien haben gezeigt, dass eine PM_{2.5-Exposition} zu einem erhöhten Risiko für angeborene Herzfehler (KHK) führen kann^2,3. Beweise aus Tierversuchen zeigten auch, dass PM_2,5 eine abnormale Herzentwicklung bei Zebrafischembryonen und den Nachkommen von Mäusen verursachen^kann,aber die molekularen Mechanismen der kardialen Entwicklungstoxizität von PM_2,5 sind noch weitgehend unbekannt⁴,^5,6.

DNA-Schäden können zu einem Stillstand des Zellzyklus führen und apoptose induzieren, was das Potenzial von Vorläuferzellen weitgehend zerstören und folglich die Herzentwicklung beeinträchtigen kann⁷⁾. Es ist gut dokumentiert, dass Umweltschadstoffe, einschließlich PM_2,5,das Potenzial haben, DNA durch oxidative Stressmechanismen anzugreifen^8,9. Sowohl die herzische Entwicklung des Menschen als auch des Zebrafisches reagiert empfindlich auf oxidativen Stress^10,11,12. 8-OHdG ist ein oxidativer DNA-Schadensmarker, und das γH2AX-Signal ist ein Marker für DNA-Doppelstrangbrüche. N-Acetyl-L-Cystein (NAC), ein synthetischer Vorläufer von intrazellulärem Cystein und Glutathion, wird häufig als antioxidative Verbindung verwendet. In dieser Studie verwenden wir NAC, um die Rolle von oxidativem Stress bei PM_2,5- induzierten DNA-Schäden¹³zu untersuchen.

Zebrafisch als Modellwirbeltier wurde häufig verwendet, um die Herzentwicklung und menschliche Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu untersuchen, da Mechanismen der Herzentwicklung bei Wirbeltieren hoch konserviert sind^14,15. Zu den Vorteilen der Verwendung von Zebrafischen als Modell gehören ihre geringe Größe, ihre starke Fortpflanzungsfähigkeit und ihre niedrigen Fütterungskosten. Von besonderem Interesse für diese Studien sind Zebrafischembryonen, die während der frühen Entwicklung nicht vom Kreislaufsystem abhängig sind und schwere Herzfehlbildungen überleben können¹⁴. Darüber hinaus ermöglicht ihre Transparenz die direkte Beobachtung des gesamten Körpers unter dem Mikroskop. Somit bieten Zebrafischembryonen eine hervorragende Gelegenheit, die molekularen Mechanismen zu bewerten, die an der Induktion der kardialen Entwicklungstoxizität infolge der Exposition gegenüber verschiedenen Umweltchemikalien beteiligt sind^5,16,17. Wir haben bereits berichtet, dass PM_{2,5-induzierter}oxidativer Stress zu DNA-Schäden und Apoptose führt, was zu Herzfehlbildungen bei Zebrafischen führt¹⁸. In dieser Studie stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Untersuchung von PM_{2,5-induzierten}DNA-Schäden im Herzen von Zebrafischembryonen zur Verfügung.

Protokoll

Wildtyp-Zebrafische (AB), die in dieser Studie verwendet wurden, wurden vom National Zebrafish Resource Center in Wuhan, China, bezogen. Alle hier beschriebenen Tierverfahren wurden von der Animal Care Institution der Ethikkommission der Soochow University überprüft und genehmigt.

1. PM_2.5 Probenahme und Extraktion organischer Verbindungen

HINWEIS: PM_2.5 wurde in einem städtischen Gebiet in Suzhou, China, vom 1. bis 7. August 2015 gesammelt, wie zuvor^{beschrieben 5}.

1. Backen Sie 47 mm Quarzmembranfilter in einem 500 °C Schalldämpferofen für 2 h, um die organischen Bestandteile zu entfernen.
2. Legen Sie einen Filter in einen PM_{2.5-Probenehmer} für 24 Stunden ununterbrochene Probenahme.
3. Den Filter abnehmen und 24 h bei Raumtemperatur trocknen lassen.
4. Quantifizieren Sie den Filter mit einer Analysenwaage.
5. Extrahieren Sie organische Komponenten aus dem Filter durch Soxhlet-Extraktion unter Verwendung von Dichlormethan als Lösungsmittel¹⁹.
6. Trocknen Sie das EOM durch eine Rotationsverdampfung in einem 60 °C Wasserbad und Stickstoffstrom. EOM in DMSO auflösen und bei -20 °C lagern.

2. Entnahme und Behandlung von Zebrafischembryonen

1. Halten Sie den Zebrafisch bei 28,5 ± 0,5 °C in einem rezirkulierenden Aquakultursystem mit einem 14 h hellen und 10 h dunklen Photoperiodenzyklus.
2. Legen Sie gesunde erwachsene Zebrafische in einem Verhältnis von 2: 1 männlich zu weiblich in ein Becken.
3. Sammeln Sie am nächsten Tag die Embryonen und waschen Sie sie mit Systemwasser (z. B. Zebrafischbrutwasser).
4. Auswahl und zufällige Aufteilung von Zebrafischembryonen, die eine normale Entwicklung zeigen (gleichmäßige Größe, volle Körner und keine Eigerinnung), in 4 Gruppen in einzelnen Glas-Petrischalen mit einem Durchmesser von 7 cm (ca. 50 Embryonen pro Gericht).
5. Behandeln Sie die Embryonen mit PM_2,5 (5 mg/L) in Gegenwart oder Abwesenheit von NAC bei 0,25 μM von 2 hpf bis 72 hpf. Verwenden Sie DMSO als Fahrzeugsteuerung bis zu einer Endkonzentration von 0,1% (v/v).

3. Morphologische Beobachtung von Zebrafischembryonen und Herzdissektion

1. Bei 72 PSf embryonieren Sie sie auf Glasobjektträger und beobachten unter einem Stereomikroskop. Zeichnen Sie Herzfehlbildungen wie Perikardödeme, veränderte Schleifen und verminderte Größe auf.
2. Berechnen Sie die Fehlbildungsraten (den Prozentsatz der Embryonen mit Herzfehlern an den gesamten lebenden Embryonen) und analysieren Sie die Unterschiede zwischen den Gruppen mitHilfe der Einweg-ANOVA, gefolgt vom türkischen Multiple Comparison Test (p < 0,05 = statistisch signifikant).
3. Betäuben Sie die Embryonen mit 0,6 mg/ml MS-222, um sie auf Glasobjektträgern zu immobilisieren.
4. Zeichnen Sie Herzschläge für 30 s auf und quantifizieren Sie die Herzfrequenz mit der ImageJ-Software^5,20.
5. Sezieren Sie Herzen aus Zebrafischembryonen mit einer Einwegspritzennadel unter einem Stereomikroskop. Achtung: Vermeiden Sie es, die Herzform zu zerstören.

4. Immunfluoreszenz-Assay

1. Um einen Immunfluoreszenz-Assay zum Nachweis von PM_{2,5-induzierten} DNA-Schäden im Herzen von Zebrafischembryonen zu verwenden, verwenden Sie einen hydrophoben Barrierestift, um einen Kreis auf einer sauberen Glasseite zu zeichnen.
2. Fügen Sie 50 μL 4% Paraformaldehyd zu 1,25 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) hinzu, um eine fixierende Lösung herzustellen.
3. 3 sezierte Herzen in einen hydrophoben Barrierestiftkreis geben und 20 min bei Raumtemperatur inkubieren.
4. Dekantieren Sie die Lösung unter dem Mikroskop und trocknen Sie die Proben bei Raumtemperatur für mindestens 5 min, so dass die Herzen vollständig an den Glasobjektträgern haften.
5. Waschen Sie die Dias dreimal in PBS mit 0,1% Tween 20 (PBST) für 5 min pro Waschgang.
6. Fügen Sie 50 μL Rinderserumalbumin (BSA) zu 1000 μL PBST hinzu, um eine 5% ige BSA-Lösung zu erhalten, und inkubieren Sie die Objektträger in einer feuchten Kammer für 1 h, um die unspezifische Antikörperbindung zu blockieren.
7. Dekantieren Sie die Lösung und waschen Sie die Proben dreimal mit PBST für 5 Minuten pro Waschgang.
8. Verdünnen Sie 2 μL monoklonalen Antikörper der Maus gegen 8-OHdG und 2 μL polyklonaler Antikörper gegen γH2AX in 296 μL PBST, um eine funktionierende primäre Antikörper-Cocktaillösung zu erhalten.
9. Inkubieren Sie die Herzproben mit 50 μL der primären Antikörper-Cocktaillösung gegen 8-OHdG und γH2AX in einer befeuchteten Kammer für mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C (Inkubation über Nacht kann die Signalintensität erhöhen).
10. Dekantieren Sie die Lösung und waschen Sie die Proben dreimal mit PBST für 5 Minuten pro Waschgang.
11. Verdünnen Sie 1 μL FITC-markierten sekundären Ziegen-Anti-Maus-Antikörper und 1 μL cy3 Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper in 498 μL PBST, um eine funktionierende sekundäre Antikörper-Cocktaillösung zu erhalten, und inkubieren Sie die Proben mit den sekundären Antikörpern (1:500 in PBST) für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln.
12. Dekantieren Sie die Lösung und waschen Sie die Proben dreimal mit PBS für 5 minuten pro Lichtschutz.
13. 20 μL DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindol) werden den Proben zur Kernfärbung für 30 min bei Raumtemperatur zugeführt.
14. Tragen Sie einen Abdecklip auf, um ihn zu gleiten und mit Nagellack zu versiegeln, um Trocknung und Bewegung zu verhindern. Dann bilden Sie die Proben unter einem Fluoreszenzmikroskop und quantifizieren Sie das Fluoreszenzsignal des Herzbereichs mit der ImageJ-Software. Berechnen Sie die relativen Änderungen mit dem Durchschnitt der DMSO-Kontrollproben. Bestimmen Sie die statistische Signifikanz der Daten wie in Schritt 3.2.

Ergebnisse

Dieser Immunfluoreszenz-Assay ist eine empfindliche und spezifische Methode zur Messung von Proteinexpressionsänderungen in den Herzen von Zebrafischembryonen, die Umweltchemikalien ausgesetzt sind.

In dieser repräsentativen Analyse wurden Embryonen, die in Abwesenheit oder Anwesenheit des Antioxidans NAC pm_2,5 ausgesetzt waren, auf das Vorhandensein von Herzfehlbildungen untersucht (Abbildung 1...

Diskussion

Obwohl Zebrafische ein ausgezeichnetes Wirbeltiermodell für die Untersuchung der kardialen Entwicklungstoxizität von Umweltchemikalien sind, ist es aufgrund der geringen Größe des Embryoherzes schwierig, genügend Protein für die Western-Blot-Analyse zu erhalten. Daher präsentieren wir eine empfindliche Immunfluoreszenzmethode zur Quantifizierung der Proteinexpressionsniveaus von DNA-Schadensbiomarkern in den Herzen von Zebrafischembryonen, die PM_2,5ausgesetzt sind.

Während d...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-OHdG Antibody	Santa Cruz Biotechnology, USA	sc-66036	Primary antibody
Analytical balance	Sartorius,China	BSA124S
BSA	Solarbio,Beijing,China	SW3015	For blocking
DAPI	Abcam, USA	ab104139	For nuclear counterstain.
DMSO	Solarbio,Beijing,China	D8371
Fluorescence microscope	Olympus, Japan	IX73	For imaging fluorescence signals/
Goat Anti-Rabbit IgG Cy3	Carlsbad,USA	CW0159	Secondary antibody
Goat Anti-Rabbit IgG FITC	Carlsbad,USA	RS0003	Secondary antibody
N-Acetyl-L-cysteine(NAC)	Adamas-Beta, Shanghai, China	616-91-1
Orbital shaker	QILINBEIER,China	TS-1
Paraformaldehyde	Sigma,China	P6148	Make 4% paraformaldehyde for fixation.
Phosphate Buffered Saline	HyClone,USA	SH30256.01	Prepare 0.1% Tween in PBS for washing.
PM2.5 sampler	TianHong,Wuhan, China	TH-150C	For 24-hr uninterrupted PM2.5 sampling.
Re-circulating aquaculture system	HaiSheng,Shanghai,China		The zebrafish was maintained in it.
Soxhlet extractor	ZhengQiao,Shanghai, China	BSXT-02	For organic components extraction.
Stereomicroscope	Nikon,Canada	SMZ645	For heart dissection from zebrafish embryos.
Tricaine methanesulfonate (MS222)	Sigma,China	E10521	To anesthetize zebrafish embryos
Tween 20	Sigma,China	P1379
γH2AX Antibody	Abcam, USA	ab26350	Primary antibody