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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt einen Reporter-Assay zur Untersuchung der Regulation der mRNA-Translation in einzelnen Eizellen während der In-vitro-Reifung.

Zusammenfassung

Ereignisse, die mit der Kernreifung der Eizellen verbunden sind, wurden gut beschrieben. Viel weniger ist jedoch über die molekularen Wege und Prozesse bekannt, die im Zytoplasma in Vorbereitung auf die Befruchtung und den Erwerb von Totipotenz stattfinden. Während der Eizellreifung hängen Veränderungen der Genexpression ausschließlich von der Translation und dem Abbau mütterlicher Boten-RNAs (mRNAs) und nicht von der Transkription ab. Die Durchführung des translationalen Programms spielt daher eine Schlüsselrolle bei der Etablierung der Eizellentwicklungskompetenz zur Aufrechterhaltung der Embryonalentwicklung. Diese Arbeit ist Teil eines Schwerpunkts auf der Definition des Programms der mütterlichen mRNA-Translation, das während der meiotischen Reifung und am Übergang von Eizelle zu Zygote stattfindet. In diesem Methodenpapier wird eine Strategie vorgestellt, um die Regulation der Translation von Ziel-mRNAs während der In-vitro-Eizellreifung zu untersuchen. Hier wird ein Ypet-Reporter mit der 3' unübersetzten Region (UTR) des interessierenden Gens verschmolzen und dann zusammen mit polyadenylierter mRNA, die für mCherry kodiert, um das injizierte Volumen zu kontrollieren, in die Eizellen mikroinjiziert. Durch die Verwendung der Zeitraffermikroskopie zur Messung der Reporterakkumulation werden die Translationsraten bei verschiedenen Übergängen während der meiotischen Reifung der Eizellen berechnet. Hier wurden die Protokolle für die Isolierung und Injektion von Eizellen, die Zeitrafferaufzeichnung und die Datenanalyse am Beispiel des UTR-Reporters ypet/interleukin-7 (IL-7)-3' beschrieben.

Einleitung

Eine ausgewachsene Eizelle eines Säugetiers erfährt schnelle Veränderungen in Vorbereitung auf die Befruchtung und den Erwerb von Totipotenz. Diese Veränderungen sind unerlässlich, um die embryonale Entwicklung nach der Befruchtung aufrechtzuerhalten. Obwohl die mit der Kernreifung verbundenen Ereignisse relativ gut beschrieben sind, ist viel weniger über die molekularen Prozesse und Wege im Zytoplasma der Eizelle bekannt. In den letzten Stadien der Eizellreifung sind die Eizellen transkriptionell still, und die Genexpression hängt vollständig von der mRNA-Translation und dem Abbau ab1,2. Die Synthese von Proteinen, die für die Entwicklungskompetenz entscheidend sind, beruht daher auf einem Programm der zeitgesteuerten Translation langlebiger mRNAs, die früher während des Eizellwachstumssynthetisiertwurden 1,3. Im Rahmen eines Schwerpunkts auf der Definition dieses Programms der mütterlichen mRNA-Translation, das während der meiotischen Reifung und am Übergang von Eizelle zu Zygote durchgeführt wird, wird in diesem Artikel eine Strategie zur Untersuchung der Aktivierung und Unterdrückung der Translation von mütterlichen Ziel-mRNAs in einzelnen Eizellen während der in vitro meiotischen Reifung präsentiert.

Bei dieser Methode wird der offene YPet-Leserahmen vor der 3'-UTR des interessierenden Transkripts geklont. Als nächstes werden mRNAs, die diesen Reporter kodieren, zusammen mit polyadenylierten mRNAs, die mCherry kodieren, in Eizellen mikroinjiziert, um das injizierte Volumen zu kontrollieren. Die Reporterakkumulation wird während der meiotischen Reifung von In-vitro-Eizellen mittels Zeitraffermikroskopie gemessen. Die Akkumulation von gelb fluoreszierendem Protein (YFP) und mCherry wird in einzelnen Eizellen aufgezeichnet, und YFP-Signale werden durch das plateauierte Niveau der co-injizierten mCherry korrigiert. Nach der Datenerfassung werden die Translationsraten für verschiedene Zeitintervalle während der meiotischen Reifung von In-vitro-Eizellen berechnet, indem die Steigung der Kurve berechnet wird, die durch Kurvenanpassung erhalten wird.

Dieser Ansatz bietet ein Werkzeug, um Veränderungen in der Translation ausgewählter endogener mRNAs experimentell zu bestätigen. Darüber hinaus erleichtert diese Methode die Charakterisierung regulatorischer Elemente, die die Translation während der meiotischen Reifung von Eizellen steuern, indem cis-regulatorische Elemente der 3'-UTR der Ziel-mRNAs4,5,6manipuliert werden. Die Manipulation der Poly(A)-Schwanzlänge ermöglicht auch den Einblick in die Adenylase/Deadenylase-Aktivität in Eizellen5. Mutagenese von cis-wirkenden Elementen oder RNA-Immunpräzipitation kann verwendet werden, um Wechselwirkungen mit verwandten RNA-bindenden Proteinen zu untersuchen6,7. Darüber hinaus kann diese Methode verwendet werden, um wesentliche Komponenten des Translationsprogramms zu identifizieren, die für die Entwicklungskompetenz der Eizellen entscheidend sind, indem die UTR-Translation von Ziel 3' in Modellen gemessenwird,die mit einer verminderten Eizellqualität verbunden sind 8,9,10. Dieses Methodenpapier stellt ein repräsentatives Experiment vor, bei dem entblähte Eizellen von 21 Tage alten C57 / BL6-Mäusen mit einem Ypet-Reporter mikroinjiziert wurden, der mit der 3' UTR von IL-7 verschmolzen ist. Das Setup und protokoll für die Eizellinjektion, die Zeitrafferaufzeichnung und die Datenanalyse wurden beschrieben.

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Protokoll

Die Versuchsverfahren mit Tieren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of California in San Francisco genehmigt (Protokoll AN182026).

1. Vorbereitung der Medien

  1. Fügen Sie alle Komponenten hinzu, wie in Tabelle 1beschrieben, um das grundlegende Eizellentnahmemedium und das Eizellreifungsmedium herzustellen. Stellen Sie für das Basissammelmedium den pH-Wert auf 7,4 ein. Sowohl für das Sammel- als auch für das Reifemedium am Tag der Anwendung 3 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) und 1 μM Cilostamid hinzufügen.

2. Herstellung der mRNA-Kodierung für Ypet-3' UTR und mCherry

  1. Erhalten Sie die 3′ UTR-Sequenzen der interessierenden mRNAs.
    HINWEIS: Für diese Studie wurden zuvor Sequenzen aus der Eizell-cDNA der Maus erhalten.
  2. Entwerfen Sie Primer zur Amplifizierung der Ziel-3'-UTRs aus der Eizell-cDNA und Teilen des pcDNA 3.1-Vektors, die eine Ypet-Kodierungssequenz, ein V5-Epitop-Tag und einen T7-Promotor enthalten.
  3. Amplifizieren Sie mit einem High-Fidelity-DNA-Polymerase-Kit. Führen Sie die Polymerase-Kettenreaktionsprodukte (PCR) auf einem Gel aus, um zu überprüfen, ob die Fragmente die richtige Größe haben, schneiden Sie die Bänder aus und extrahieren Sie die DNA aus dem Gel mit einem Gelextraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  4. Verschmelzen Sie die PCR-Fragmente mit einem PCR-Klonkit zu einem Vektor.
    HINWEIS: PCR-Fragmente wurden 4 h lang auf Eis inkubiert, um einen effizienteren Rekombinationsprozess zu ermöglichen. Dies widerspricht den Anweisungen des Herstellers, die eine Inkubationszeit von nur 45 min empfehlen.
  5. Transfizieren Sie PCR-Fragmente in kompetente 5-α Escherichia coli-Bakterien.
    1. Fügen Sie die Mischung und das Plasmid zu den Bakterien hinzu und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang auf Eis.
    2. Schocken Sie die Mischung und das Plasmid, indem Sie die Mischung für 45 s in ein Wasserbad bei 42 ° C geben und sofort für 3 min auf Eis abkühlen.
    3. 500 μL Super Optimal Brühe mit Catabolite Repression (SOC) Medium hinzufügen und 1 h bei 37 °C inkubieren.
    4. Drehen Sie bei 7000 × g für 2 minuten herunter und entfernen Sie den größten Teil des Überstands. Resuspend und Platte auf einer Luria Brühe (LB) Agarplatte mit dem entsprechenden Auswahlantibiotikum.
      HINWEIS: Carbenicillin wurde in dieser Studie verwendet.
    5. Über Nacht bei 37 °C inkubieren. Isolieren Sie die Kolonien, indem Sie eine Pipettenspitze leicht auf eine der Kolonien drücken und in 3 ml LB-Medium mit 100 μg / ml Carbenicillin legen. 12-24 h bei 37 °C inkubieren.
    6. Extrahieren Sie die DNA der Plasmide mit dem Plasmid-DNA-Isolationskit nach Herstellerangaben und bestätigen Sie die Sequenzen mittels DNA-Sequenzierung.
  6. Für Ypet/3' UTR:
    1. Erstellen Sie eine lineare PCR-Vorlage für die In-vitro-Transkription. Verwenden Sie eine Vorwärtsgrundierung vor der Ypet-Sequenz und eine Rückwärtsprimierung mit 20 zusätzlichen Thyminrückständen. Siehe Tabelle 2 für die Sequenz von Ypet/IL-7 3' UTR und die Sequenzen der Vorwärts- und Rückwärtsprimer.
      HINWEIS: Diese zusätzlichen Thyminreste fügen der linearen mRNA nach der In-vitro-Transkription Oligo(A)hinzu.
    2. In vitro transkribieren Sie das PCR-Produkt mit einem T7-Transkriptionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    3. Reinigen Sie die resultierende komplementäre RNA (cRNA) mit einem Transkriptions-Clean-up-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    4. Eluieren Sie die gereinigte cRNA in RNAse-freiem Wasser, messen Sie die Konzentration und bewerten Sie die Integrität durch Agaroseelektrophorese. Bei −80 °C lagern.
  7. Für mCherry:
    1. Herstellung einer linearen PCR-Vorlage für die In-vitro-Transkription unter Verwendung eines High-Fidelity-Restriktionsenzyms; Verwenden Sie das Restriktionsenzym mfEI-HF, wenn Sie dieses Beispiel replizieren. Über Nacht bei 37 °C in einem Verdauungspuffer verdauen.
    2. Führen Sie ein Gel aus, um die Probe zu reinigen, und extrahieren Sie die lineare DNA mit einem Gelextraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    3. In vitro transkribieren Sie das PCR-Produkt mit einem T7-Transkriptionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    4. Polyadenylat der cRNA (150-200 Nukleotide) mit einem Poly(A)-Tailing-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    5. Reinigen Sie die resultierende cRNA mit einem Transkriptions-Clean-up-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    6. Eluieren Sie die gereinigte cRNA in RNAse-freiem Wasser, messen Sie mRNA-Konzentrationen und bewerten Sie die Nachrichtenintegrität durch Gelelektrophorese. Bei −80 °C lagern.

3. Experimentelles Verfahren

HINWEIS: Eine schematische Übersicht über die Mikroinjektion von Eizellen und die anschließende Zeitraffermikroskopie ist in Abbildung 1 dargestellt.

  1. Tag 1
    1. Intraperitoneal injizieren 21 Tage alte Mäuse 5 IE Serum gonadotropin der trächtigen Stute, um das Follikelwachstum bis zum antralen Stadium11zu fördern.
  2. Tag 3
    1. Eizellentnahme
      1. Opfere Mäuse 44-48 h nach der Grundierung, um die Eierstöcke zu sammeln, und lege sie in eine Kunststoff-Petrischale mit basischem Eizellensammelmedium.
      2. Öffnen Sie die Antralfollikel vorsichtig, indem Sie mit einer 26 G-Nadel einen kleinen Schnitt in der Follikelwand machen. Isolieren Sie intakte kumulusumschlossene Eizellen (COCs) mit mehreren Schichten von Kumuluszellen mit einer mundbetriebenen Glaspipette.
      3. Verwenden Sie eine kleinere Pipette (etwas größer als der Durchmesser der Eizelle) und enthöhlen Sie die COCs mechanisch durch wiederholtes Pipettieren.
        HINWEIS: Alternativ können Sie eine Mikroinjektion auf intakte COCs durchführen.
      4. Mit einer größeren Pipette die entkernten Eizellen absaugen und in eine Petrischale mit Reifungsmedium geben, das mit 1 μM des Phosphodiesterasehemmers Cilostamid ergänzt ist, um die Wiederaufnahme der meiotischen Reifung zu verhindern12. Stellen Sie die Schale für 2 h in den Inkubator, damit sich die Eizellen von dem Stress erholen können, der durch die Isolierung der Eizellen aus den Follikeln verursacht wird.
    2. Eizell-Mikroinjektion
      1. Bereiten Sie die Injektionsnadeln vor, indem Sie ein 10 cm langes Kapillarrohr aus Borosilikatglas in einen mechanischen Abzieher legen. Für eine optimale Injektion biegen Sie die Nadelspitze in einem Winkel von 45° mit einem erhitzten Filament.
      2. Bereiten Sie Polystyrolschalen mit 20 μL Tröpfchen des basischen Eizellensammelmediums zu und bedecken Sie die Tröpfchen mit leichtem Mineralöl.
      3. Bereiten Sie einen Reporter-Mix vor, indem Sie 12,5 μg/μL Ypet-3' UTR und 12,5 μg/μL mCherry hinzufügen. Bereiten Sie ein größeres Volumen vor und machen Sie Aliquoten für zukünftige Experimente, um ähnliche Reporterkonzentrationen zu gewährleisten. Lagern Sie diese Aliquoten bei -80 °C. Nach dem Auftauen zentrifugieren Sie zuerst das Aliquot für 2 min bei 20.000 x gund werden in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführen.
        HINWEIS: Diese Zentrifugation verhindert, dass die Injektionsnadel durch potenzielle Aggregate im Reportermix verstopft wird.
      4. Laden Sie die Injektionsnadel kapillarität mit ca. 0,5 μL Reportermischung.
      5. Legen Sie die Haltepipette und die geladene Injektionsnadel in die Halter und positionieren Sie sie in der Tröpfchenzelle des Eizellensammelmediums. Saugen Sie einen Teil des Mediums in die Haltepipette ab.
      6. Öffnen Sie die Injektionsnadel, indem Sie sie vorsichtig gegen die Haltepipette klopfen.
      7. Legen Sie die Eizellen in ein Tröpfchen aus basischem Sammelmedium und injizieren Sie 5-10 pL der Reportermischung.
      8. Inkubieren Sie die Eizellen im Reifemedium mit 1 μM Cilostamid für 16 h, damit das mCherry-Signal ein Plateau erreicht.
      9. Bereiten Sie eine Petrischale vor, die für die Zeitraffermikroskopie mit mindestens zwei 20 μL-Tröpfchen Reifungsmedium für jeden injizierten Reporter verwendet wird: ein Tröpfchen mit 1 μM Cilostamid zur Kontrolle von Prophase I-arrestierten Eizellen und ein Tröpfchen ohne Cilostamid für reifende Eizellen. Die Tröpfchen mit leichtem Mineralöl abdecken und in den Inkubator geben.
    3. Zeitraffermikroskopie
      1. Nach der Inkubation die injizierten Eizellen aus dem Inkubator entfernen und viermal im Reifemedium ohne Cilostamid waschen. Halten Sie einige Eizellen im Reifemedium mit 1 μM Cilostamid als Prophase I-arrestierte Eizellkontrollgruppe.
      2. Übertragen Sie die injizierten Eizellen auf ihre jeweiligen Tröpfchen auf der zuvor vorbereiteten Zeitraffermikroskopschale. Clustern Sie die Eizellen mit einer geschlossenen Glaspipette (eine geschlossene Pipette kann vorbereitet werden, indem die Spitze für einige Sekunden in einer Flamme gehalten wird).
        HINWEIS: Das Clustering der Eizellen hilft, ihre Bewegung während der Aufnahme zu verhindern.
      3. Stellen Sie die Schüssel unter das Mikroskop, das mit einem Leuchtdiodenbeleuchtungssystem und einer motorisierten Bühne ausgestattet ist, die mit einer Umweltkammer ausgestattet ist, die bei 37 °C und 5% CO2gehalten wird. Um diese Studie zu replizieren, verwenden Sie die folgenden Parameter: Filterset: dichroitischer Spiegel YFP/CFP/mCherry 69008BS; YFP-Kanal (Excitation (Ex): S500/20 × 49057; Emission (EM): D535/30 m 47281), mCherry-Kanal (Ex: 580/25 × 49829; Em: 632/60 m).
      4. Geben Sie die entsprechenden Einstellungen für das Zeitrafferexperiment ein (siehe Materialtabelle für die in dieser Studie verwendete Software): Klicken Sie auf Apps | Mehrdimensionale Erfassung. Wählen Sie die erste Registerkarte Haupt und wählen Sie Zeitraffer, mehrere Stufenpositionenund mehrere Wellenlängen.
      5. Wählen Sie die Registerkarte Speichern, um den Speicherort des Experiments einzugeben.
      6. Wählen Sie die Registerkarte Zeitraffer, um die Anzahl der Zeitpunkte, die Dauer und das Zeitintervall einzugeben.
        HINWEIS: Die Dauer des Zeitrafferexperiments hängt von der untersuchten Tierart ab, da der Zeitpunkt der meiotischen Reifung der Eizellen von Spezies zu Spezies unterschiedlich ist. In diesem Experiment mit Maus-Eizellen wurden Eizellen alle 15 Minuten für 16 Stunden aufgezeichnet.
      7. Wählen Sie die Registerkarte Bühne. Schalten Sie das Hellfeld ein und lokalisieren Sie die Position der Eizellen, indem Sie ein neues Fenster öffnen, indem Sie | Erwerben Sie | Live zeigen. Sobald die Eizellen lokalisiert sind, wechseln Sie zurück zum Fenster MultiDimensionale Erfassung und drücken Sie +, um die Position der Eizellen festzulegen.
      8. Wählen Sie die Registerkarte Wellenlängenund stellen Sie 3 verschiedene Wellenlängen für Hellfeld (Belichtung 15 ms), YFP (Belichtung 150 ms für Ypet/IL7 3' UTR) und mCherry (Belichtung 75 ms für Ypet/IL7 3' UTR) ein.
        HINWEIS: Passen Sie die Belichtung für jeden Ypet/3' UTR-Reporter basierend auf dem Grad der Reporterakkumulation und der injizierten Lautstärke an. Stellen Sie sicher, dass das YFP-Signal zu Beginn des Experiments in die Mitte des Erfassungsbereichs fällt, um eine Unterschätzung oder Sättigung im Falle einer Aktivierung der Translation zu verhindern. Passen Sie für mCherry die Exposition für jede Charge von mCherry an, da das Signal von der Anzahl der Adeninnukleotide abhängt, die während des Polyadenylierungsverfahrens hinzugefügt wurden. Aufgrund der unterschiedlichen Polyadenylierungseffizienz sollten Sie die gleiche Charge mCherry in verschiedenen Experimenten verwenden, um einen besseren Vergleich zwischen experimenten zu ermöglichen.
      9. Starten Sie das Zeitrafferexperiment, indem Sie auf Erwerbenklicken. In Abbildung 2 und der Zusatzdatei finden Sie ein Beispiel für eine Zeitrafferaufzeichnung in einer einzelnen Eizelle.
    4. Analyse der Ypet-3' UTR-Übersetzung
      1. Führen Sie für diese Analyse (siehe Materialtabelle für die in dieser Studie verwendete Software) zwei Regionsmessungen für jede Eizelle durch: die Eizelle selbst - klicken Sie auf die Ellipsenregion und umgeben Sie die Eizelle - und eine kleine Region in der Nähe der Eizelle, die für die Hintergrundsubtraktion verwendet werden soll - klicken Sie auf die rechteckige Region.
        HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sich die Eizellen während der Zeitrafferaufnahme nicht aus der ausgewählten Region bewegen. Achten Sie besonders auf die Platzierung der Regionsmessung um die Polkörperextrusion, da dies zu Bewegungen in der Eizelle führt und die Aufnahme verzerren kann.
      2. Exportieren Sie die Regionsmessdaten in eine Tabelle, indem Sie zuerst auf Protokoll öffnen und dann auf Protokolldaten klicken, um die Datenanalysesoftware zu exportieren.
      3. Subtrahieren Sie für jede einzelne Eizelle und für alle gemessenen Zeitpunkte die Hintergrundbereichsmessung von der Eizellbereichsmessung. Tun Sie dies für YFP- und mCherry-Wellenlängen separat.
      4. Zeichnen Sie den Zeitpunkt des Keimbläschenabbaus (GVBD) und der Polkörperextrusion (PBE) zur späteren Bezugnahme auf.
        HINWEIS: Schließen Sie reifende Mause eizellen aus, wenn GVBD 2 h überschreitet.
      5. Zeichnen Sie die YFP- und mCherry-Expression im Laufe der Zeit für jede Eizelle auf, um nach Ausreißern zu suchen.
        HINWEIS: Dies sollte eine glatte Kurve sein, wenn dies nicht der Fall ist, kann dies darauf hindeuten, dass sich die Eizelle während der Aufnahme bewegt hat.
      6. Berechnen Sie für jede einzelne Eizelle die durchschnittliche mCherry-Expression für die letzten zehn Zeitpunkte der Aufzeichnung. Dividieren Sie für jeden Zeitpunkt die YFP-Expression durch die gemittelte mCherry-Expression, um das injizierte Volumen zu korrigieren, um zu jedem Zeitpunkt für jede einzelne Eizelle ein YFP/mCherry-Verhältnis zu erhalten.
      7. Berechnen Sie die Übersetzungsraten für ein bestimmtes Zeitintervall, indem Sie die Steigung der Kurve durch lineare Regression anpassen. Bewerten Sie die Unterschiede in den Übersetzungsraten mithilfe statistischer Inferenz.

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Ergebnisse

Denuded prophase I-arrestierte Eizellen von 21 Tage alten C57/BL6-Mäusen wurden mit einer Reportermischung injiziert, die mRNA enthielt, die für den Ypet-Reporter kodiert war, der mit der 3'-UTR von IL-7 und mRNA-kodierender mCherry verschmolzen war. YFP- und mCherry-Expression wurde in 39 Eizellen aufgezeichnet, von denen 30 gereift waren und 9 in Prophase I als Negativkontrolle verhaftet wurden. Drei reifende Eizellen wurden für die Analyse ausgeschlossen, da sie entweder eine verzögerte GVBD (N=2) hatten oder sich...

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Diskussion

Die vorgestellte Methode beschreibt eine Strategie zur Untersuchung der Aktivierung und Unterdrückung der Translation von Ziel-mRNA an verschiedenen Übergängen während der in vitro Oozytenmionischen Reifung. IL-7, ein von der Eizelle freigesetztes Zytokin, das an der Kommunikation zwischen Eizelle und Kumuluszell beteiligt sein kann8,13, wurde ausgewählt, um diese Methode zu beschreiben. Es ist bekannt, dass IL-7 während der Eizellreifung

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von NIH R01 GM097165, GM116926 und Eunice Kennedy Shriver NICHD National Centers for Translational Research in Reproduction and Infertility P50 HD055764 an Marco Conti unterstützt. Enrico M. Daldello wurde durch ein Stipendium der Lalor Foundation und Natasja G. J. Costermans durch ein Rubicon-Stipendium der Niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO) unterstützt.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Preparation of media
Bovine Serum Albumin Powder BioxtraSigma-AldrichSIAL-A3311
CilostamideEMD Millipore231085
MEM alphaGibco12561-056
Minimum Essential Medium Eagle Sigma-AldrichM2645
Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile FilteredGenesee Scientific Corporation (GenClone)25-512
Sodium Bicarbonate JT-Baker3506-1
Sodium PyruvateGibco 11360-070
Ultrapure distilled waterInvitrogen10977-015
Preparation of mRNA encoding YFP/3' UTR and mCherry
AgaroseApex Biomedical 20-102QD
Carbenicillin disodium saltSigma-AldrichC1389-1G
Choo-Choo Cloning KitMcLabCCK-20
CutSmart Buffer (10x)New England BiolabsB7204
DNA loading dye (6x)Thermo ScientificR0611
dNTP SolutionNew England BiolabsN0447S
DpnINew England BiolabsR0176
GeneRuler 1 kb DNA ladderThermo FisherSM1333
LB Agar Plates with 100 µg/mL Carbenicillin, Teknova TeknovaL1010
LB Medium (Capsules)MP Biomedicals3002-021
MEGAclear Transcription Clean-Up KitLife TechnologiesAM1908
MfeI-HF restriction enzymeNew England BiolabsR3589
mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription KitInvitrogenAM1344
Phusion High Fidelity DNA polymeraseNew England BiolabsM0530
Poly(A) Tailing kitInvitrogenAM1350
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen27106
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704
S.O.C. mediumThermo Fisher15544034
TAE buffer Apex Biomedical 20-193
Ultrapure Ethidium Bromide SolutionLife Technologies15585011
Oocyte collection
Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettesSigma-AldrichA5177-5EA
Calibrated micro-pipettesDrummond Scientific Company2-000-025 
PMSG- 5000MybiosourceMBS142665
PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2BD305111
Syringe 1 mlBD309659
Oocyte micro-injection
35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | UncoatedMatTekP35G-0-20-CFor time-lapse microscopy
Borosilicate glass with filamentSutter InstrumentBF100-78-10
Oil for Embryo CultureIrvine Scientific9305
Petri DishFalcon351006For micro-injection
Tissue Culture DishFalcon353001For oocyte incubation
VacuTip Holding CapillaryEppendorf5195000036
Software
BiorenderBioRenderPreparation of Figure 1S
MetaMorph, version 7.8.13.0 Molecular Devices For time-lapse microscopy, analysis of 3' UTR translation 

Referenzen

  1. Clarke, H. J. Post-transcriptional control of gene expression during mouse oogenesis. Results and Problems in Cell Differentiation. 55, 1-21 (2012).
  2. Gosden, R., Lee, B. Portrait of an oocyte: our obscure origin. Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 973-983 (2010).
  3. Conti, M., Sousa Martins, J. P., Han, S. J., Franciosi, F. Translational control in the germ line. Posttranscriptional Mechanisms in Endocrine Regulation. Menon, K. M. J., Goldstrohm, A. , Springer, Cham. 129-156 (2015).
  4. Dai, X. -X., et al. A combinational code for mRNA 3'UTR-mediated translational control in the mouse oocyte. Nucleic Acids Research. 47 (1), 328-340 (2019).
  5. Luong, X. G., Daldello, E. M., Rajkovic, G., Yang, C. R., Conti, M. Genome-wide analysis reveals a switch in the translational program upon oocyte meiotic resumption. Nucleic Acids Research. 48 (6), 3257-3276 (2020).
  6. Yang, C. R., et al. The RNA-binding protein DAZL functions as repressor and activator of mRNA translation during oocyte maturation. Nature Communications. 11, 1399(2020).
  7. Chen, J., et al. Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition. Genes & Development. 25 (7), 755-766 (2011).
  8. Cakmak, H., Franciosi, F., Musa Zamah, A., Cedars, M. I., Conti, M. Dynamic secretion during meiotic reentry integrates the function of the oocyte and cumulus cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (9), 2424-2429 (2016).
  9. Daldello, E. M., Luong, X. G., Yang, C. R., Kuhn, J., Conti, M. Cyclin B2 is required for progression through meiosis in mouse oocytes. Development. 146 (8), (2019).
  10. Franciosi, F., Manandhar, S., Conti, M. FSH regulates mRNA translation in mouse oocytes and promotes developmental competence. Endocrinology. 157 (2), 872-882 (2016).
  11. Peters, H., Byskov, A. G., Himelstein-braw, R., Faber, M. Follicular growth: the basic event in the mouse and human ovary. Reproduction. 45 (3), 559-566 (1975).
  12. Shu, Y., et al. Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes. Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).
  13. Cheng, Y., et al. Oocyte-expressed Interleukin 7 suppresses granulosa cell apoptosis and promotes oocyte maturation in rats. Biology of Reproduction. 84 (4), 707-714 (2011).
  14. Ma, J., Fukuda, Y., Schultz, R. M. Mobilization of dormant Cnot7 mRNA promotes deadenylation of maternal transcripts during mouse oocyte maturation. Biology of Reproduction. 93 (2), 1-12 (2015).
  15. Sha, Q. Q., et al. CNOT 6L couples the selective degradation of maternal transcripts to meiotic cell cycle progression in mouse oocyte. The EMBO journal. 37 (24), 99333(2018).
  16. Yartseva, V., Giraldez, A. J. The maternal-to-zygotic transition during vertebrate development: A model for reprogramming. Current Topics in Developmental Biology. 113, 191-232 (2015).
  17. Mašek, T., Valášek, L., Pospíšek, M. Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients. Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).
  18. Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302(2013).
  19. Martins, J. P. S., et al. DAZL and CPEB1 regulate mRNA translation synergistically during oocyte maturation. Journal of Cell Science. 129 (6), 1271-1282 (2016).
  20. Yang, Y., et al. Maternal mRNAs with distinct 3' UTRs define the temporal pattern of Ccnb1 synthesis during mouse oocyte meiotic maturation. Genes & development. 31, 1302-1307 (2017).
  21. Cheng, Z., et al. Pervasive, coordinated protein-level changes driven by transcript isoform switching during meiosis. Cell. 172 (5), 910-923 (2018).
  22. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
  23. Piqué, M., López, J. M., Foissac, S., Guigó, R., Méndez, R. A combinatorial code for CPE-mediated translational control. Cell. 132 (3), 434-448 (2008).
  24. Morgan, M., et al. mRNA 3' uridylation and poly(A) tail length sculpt the mammalian maternal transcriptome. Nature. 548 (7667), 347-351 (2017).
  25. Yang, F., Wang, W., Cetinbas, M., Sadreyev, R. I., Blower, M. D. Genome-wide analysis identifies cis-acting elements regulating mRNA polyadenylation and translation during vertebrate oocyte maturation. RNA. 26 (3), 324-344 (2020).
  26. Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).
  27. Chen, J., et al. Somatic cells regulate maternal mRNA translation and developmental competence of mouse oocytes. Nature Cell Biology. 15 (12), 1415-1423 (2013).

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