Drei- und vierdimensionale Visualisierungs- und Analyseansätze zur Untersuchung der axialen Dehnung und Segmentierung von Wirbeltieren

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir Berechnungswerkzeuge und -methoden, die die Visualisierung und Analyse von drei- und vierdimensionalen Bilddaten von Mausembryonen im Rahmen der axialen Dehnung und Segmentierung ermöglichen, die durch optische In-toto-Projektionstomographie und durch Live-Bildgebung und Ganzkörper-Immunfluoreszenzfärbung mittels Multiphotonenmikroskopie erhalten werden.

Zusammenfassung

Die Somitogenese ist ein Kennzeichen der embryonalen Entwicklung von Wirbeltieren. Seit Jahren untersuchen Forscher diesen Prozess in einer Vielzahl von Organismen mit einer breiten Palette von Techniken, die Ex-vivo- und In-vitro-Ansätze umfassen. Die meisten Studien stützen sich jedoch immer noch auf die Analyse zweidimensionaler (2D) Bilddaten, was die ordnungsgemäße Bewertung eines Entwicklungsprozesses wie axiale Ausdehnung und Somitogenese mit hochdynamischen Wechselwirkungen in einem komplexen 3D-Raum einschränkt. Hier beschreiben wir Techniken, die die Live-Bildgebung der Maus, die Datensatzverarbeitung, die Visualisierung und die Analyse in 3D und 4D ermöglichen, um die Zellen (z. B. neuromesodermale Vorläufer) zu untersuchen, die an diesen Entwicklungsprozessen beteiligt sind. Wir bieten auch ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die optische Projektionstomographie und die gesamte Immunfluoreszenzmikroskopie in Mausembryonen (von der Probenvorbereitung bis zur Bildaufnahme) und zeigen eine Pipeline, die wir entwickelt haben, um 3D-Bilddaten zu verarbeiten und zu visualisieren. Wir erweitern den Einsatz einiger dieser Techniken und heben spezifische Merkmale verschiedener verfügbarer Software (z. B. Fidschi / ImageJ, Drishti, Amira und Imaris) hervor, die verwendet werden können, um unser derzeitiges Verständnis von axialer Ausdehnung und Somitbildung (z. B. 3D-Rekonstruktionen) zu verbessern. Insgesamt betonen die hier beschriebenen Techniken die Bedeutung der 3D-Datenvisualisierung und -analyse in der Entwicklungsbiologie und könnten anderen Forschern helfen, 3D- und 4D-Bilddaten im Zusammenhang mit der axialen Ausdehnung und Segmentierung von Wirbeltieren besser zu adressieren. Schließlich verwendet die Arbeit auch neuartige Werkzeuge, um die embryonale Entwicklung von Wirbeltieren zu erleichtern.

Einleitung

Die Bildung von Wirbelkörperachsen ist ein hochkomplexer und dynamischer Prozess, der während der Embryonalentwicklung stattfindet. Am Ende der Gastrulation [in der Maus, um den Embryonaltag (E) 8.0] wird eine Gruppe von Epiblast-Vorläuferzellen, die als neuromesodermale Vorläuferzellen (NMPs) bekannt sind, zu einem Schlüsseltreiber der axialen Ausdehnung in einer Kopf-zu-Schwanz-Sequenz und erzeugt das Neuralrohr und das paraxiale mesodermale Gewebe während der Hals-, Rumpf- und Schwanzbildung 1,2,3,4 . Interessanterweise scheint die Position, die diese NMPs im kaudalen Epiblasten einnehmen, eine Schlüsselrolle bei der Entscheidung zu spielen, in Mesoderm oder Neuroektoderm⁵ zu differenzieren. Obwohl uns derzeit ein präziser molekularer Fingerabdruck für NMPs fehlt, wird allgemein angenommen, dass diese Zellen T (Brachyury) und Sox2 ^5,6 koexprimieren. Die genauen Mechanismen, die NMP-Schicksalsentscheidungen regulieren (d.h. ob sie neuronale oder mesodermale Routen nehmen), beginnen erst jetzt genau definiert zu werden. Die Tbx6-Expression im primitiven Streifenbereich ist ein früher Marker für die NMP-Schicksalsentscheidung, da dieses Gen an der Induktion und Spezifikation von Mesoderm ^6,7 beteiligt ist. Interessanterweise scheinen frühe Mesodermzellen hohe Konzentrationen von Epha1⁸ zu exprimieren, und es wurde auch gezeigt, dass die Wnt/β-Catenin-Signalgebung sowie Msgn1 eine wichtige Rolle bei der paraxialen Mesodermdifferenzierung und der Somitbildung spielen ^9,10. Eine vollständige räumlich-zeitliche Analyse von NMPs auf Einzelzellebene wird sicherlich entscheidend sein, um die molekularen Mechanismen, die die Mesoderm-Spezifikation steuern, vollständig zu verstehen.

Die Bildung von Somiten (Wirbelvorläufern) ist ein Schlüsselmerkmal von Wirbeltieren. Während der axialen Dehnung wird das paraxiale Mesoderm in eine Reihe von bilateralen sich wiederholenden Einheiten segmentiert, die als Somiten bezeichnet werden. Die Anzahl der Somiten und die Zeit, die für die Bildung neuer Segmente benötigt wird, variieren zwischen den Arten^11,12. Somitogenese beinhaltet periodische Signalschwingungen (bekannt als "Segmentierungsuhr"), die durch die zyklische Expression mehrerer Gene der Signalwege Notch, Wnt und Fgf im präsomitischen Mesoderm (z. B. Lfng) beobachtet werden ^können11,12. Das aktuelle Modell der Somitogenese postuliert auch die Existenz einer "Reifungswellenfront", einer Reihe komplexer Signalgradienten mit Fgf-, Wnt- und Retinsäuresignalen, die die Position der hinteren Grenze jedes neuen Somits definieren. Eine koordinierte Wechselwirkung zwischen der "Segmentierungsuhr" und der "Reifungswellenfront" ist daher für die Erzeugung dieser Wirbelvorläufermodule von grundlegender Bedeutung, da Störungen in diesen wichtigen morphogenetischen Prozessen zu embryonaler Letalität oder zur Bildung angeborener Fehlbildungen (z.B. Skoliose) führen können)^13,14,15.

Trotz erheblicher Fortschritte in jüngster Zeit bei bildgebenden Verfahren, Biobildanalysemethoden und Software stützen sich die meisten Studien zur axialen Dehnung und Somitogenese immer noch auf ein-/isolierte zweidimensionale Bilddaten (z. B. Schnitte), die keine vollständige mehrdimensionale Gewebevisualisierung ermöglichen und eine klare Unterscheidung zwischen pathologischen Fehlbildungen (d. H. Aufgrund von Mutationen) gegenüber normalen morphologischen Variationen während der Embryonalentwicklung erschweren¹⁶ . Die Bildgebung in 3D hat bereits neuartige morphogenetische Bewegungen aufgedeckt, die zuvor nicht durch Standard-2D-Methoden^{identifiziert wurden 17,18,19,20}, was die Leistungsfähigkeit der In-toto-Bildgebung unterstreicht^, die Mechanismen der Wirbeltier-Somitogenese und der axialen Ausdehnung zu verstehen.

Die 3D- und 4D-Mikroskopie von Mausembryonen, insbesondere die Live-Bildgebung, ist technisch anspruchsvoll und erfordert kritische Schritte während der Probenvorbereitung, Bildaufnahme und Datenvorverarbeitung, um eine genaue und aussagekräftige räumlich-zeitliche Analyse zu ermöglichen. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Live-Bildgebung und die Ganz-Mount-Immunfluoreszenzfärbung von Mausembryonen, mit dem sowohl NMPs als auch mesodermale Zellen während der axialen Ausdehnung und Segmentierung untersucht werden können. Darüber hinaus beschreiben wir auch ein Protokoll für die optische Projektionstomographie (OPT) älterer Embryonen und Föten, das eine 3D-in-toto-Visualisierung und Quantifizierung von pathologischen Anomalien ermöglicht, die sich aus Problemen während der Somitogenese (z. B. Knochenfusion und Skoliose) ergeben können)13,21,22. Schließlich veranschaulichen wir die Leistungsfähigkeit von 3D-Bildgebungsrekonstruktionen in Studium und Lehre der Wirbeltiersegmentierung und axialen Dehnung.

Protokoll

Tierversuche folgten den portugiesischen (Portaria 1005/92) und europäischen (Richtlinie 2010/63/EU) Rechtsvorschriften über Unterkunft, Haltung und Wohlfahrt. Das Projekt wurde von der Ethikkommission des "Instituto Gulbenkian de Ciência" und von der portugiesischen Nationalstelle "Direcção Geral de Alimentação e Veterinária" (Lizenzreferenz: 014308) geprüft und genehmigt.

1. Probenvorbereitung für 3D- und 4D-Bildgebung

HINWEIS: Hier finden Sie eine detaillierte Beschreibung zur Sezierung und Vorbereitung von Mausembryonen E8.25 bis E10.5 für die Live-Bildgebung (1.1), E7.5- bis E11.5-Embryonen für die Ganzkörper-Immunfluoreszenzmikroskopie (1.2) und Föten für die optische Projektionstomographie (1.3).

1. Probenvorbereitung für Live-Bildgebung
   1. Mausembryo-Dissektion und Vorbereitung für die Live-Bildgebung (z.B. LuVeLu Reporter ²³).
      1. Sezieren Sie Mausembryonen zwischen E8.25 und E10.5 in vorgewärmtem M2-Medium (37 °C). Entfernen Sie den Dottersack vorsichtig mit einer sauberen Pinzette und waschen Sie den Embryo einmal mit frischem M2-Medium, um Blut und Ablagerungen zu entfernen, die während der Dissektion entstanden sind.
         HINWEIS: Es ist wichtig, eine Schädigung des Embryos in keiner Weise zu vermeiden, da er sich sonst während des Live-Bildgebungsverfahrens nicht richtig entwickelt.
      2. Während des Lebendbildgebungsverfahrens werden die Embryonen in einer beheizten Kammer (37 °C), in einer 65% O2- und 5% CO 2-Umgebung (_{N2-ausgeglichen),} in niedrigem Glukose-DMEM-Medium, ergänzt mit 10% HyClone definiertem fetalem Rinderserum,₂ mM L-Glutamin und 1% Penicillin-Streptomycin, inkubiert.
         HINWEIS: Diese Kulturbedingungen ermöglichen die Embryonalentwicklung für etwa 10 h. Andere Protokolle ^9,10, die andere Kulturbedingungen verwenden, können noch längere Zeiträume zulassen.
2. Probenvorbereitung für die Immunfluoreszenzmikroskopie
   1. Mausembryo-Dissektion und Fixationsverfahren
      1. Sezieren Sie Mausembryonen von E7.5 bis E11.5 entweder in kaltem (4 °C) phosphatgepuffertem Kochsalzlösung (PBS) oder M2-Medium. Nach der Entfernung aller extraembryonalen Membranen (z. B. Reicharts Membran oder Dottersack) waschen Sie den Embryo in frischem PBS, um Blut und Ablagerungen zu entfernen, die während des Dissektionsverfahrens produziert wurden.
      2. Fixieren Sie die Embryonen bei 4 °C, in 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS, für die in Tabelle 1 angegebene Zeit.
         VORSICHT - PFA sollte in einem Abzug gehandhabt werden

         Entwicklungsstadium	Empfohlene Fixationszeit (PFA 4%)
         E7,5	1h30
         E8,5	2h
         E9,5	3h
         E10,5	4h
         E11,5	4h

         Tabelle 1 - Fixationszeiten für Embryonen in verschiedenen Entwicklungsstadien
      3. Nach der Fixierung waschen Sie die Embryonen mindestens zweimal (jeweils 5-10 Minuten) in PBS, um PFA vollständig zu entfernen. Zu diesem Zeitpunkt können Embryonen direkt in das Immunfluoreszenz-Färbeprotokoll (Schritt 1.2.2) entwässert oder für die zukünftige Verwendung gelagert werden (Schritt 1.2.1.4).
      4. Bei Bedarf Embryonen bei -20 °C in 100% Methanol für längere Zeit lagern.
         1. Um die Gewebekonservierung zu verbessern, dehydrieren Sie den Embryo allmählich mit einem Anstieg der Methanolkonzentration um 10% (verdünnt in PBS), jeweils 10 Minuten bei Raumtemperatur (RT) auf einem Shaker, bis 100% Methanol erreicht sind. Ersetzen Sie das 100% Methanol einmal mit einem frischen Aliquot.
         2. Gewinnen Sie gefrorene Embryonen durch Rehydratation nach einer umgekehrten Methanol / PBS-Serie, jeder Schritt 10 Minuten bei RT auf einem Shaker und mit abschließenden Wäschen in PBS (zweimal, jeweils 5-10 Minuten), bevor Sie in das Immunfärbungsprotokoll eintreten.
            VORSICHT - Methanol sollte in einem Abzug gehandhabt werden.
   2. Immunfluoreszenz-Färbung im ganzen Montement
      HINWEIS: Das folgende Immunfluoreszenz-Färbeprotokoll wurde an das in Osorno et ^al.24 beschriebene Verfahren angepasst. Alle Wäschen sollten an einem Shaker durchgeführt werden. Nach dem Blockierungsschritt werden Inkubationen bei 4 °C durchgeführt, um die Integrität/Konservierung von Antikörpern sicherzustellen.
      1. Waschen Sie Embryonen dreimal (jeweils 30 min) in PBS, das 0,1% Triton X-100 (0,1% PBST) enthält, und dann einmal in 0,5% PBST für 1 Stunde (RT), um die Permeabilisierung zu verbessern.
      2. Um die unspezifische Bindung zu reduzieren, waschen Sie 1 M Glycin in PBS (pH 7,5) für 30 Minuten bei RT ein.
      3. Waschen Sie dreimal in 0,1% PBST für 30 Minuten, um das Glycin vollständig zu entfernen.
      4. Inkubieren Sie die Embryonen über Nacht bei 4 °C in Blocklösung, die Folgendes enthält: 3% Serum (von der Tierart, in der die sekundären Antikörper produziert wurden), 1% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1% Triton X-100 in PBS.
      5. Primäre Antikörper in Blocklösung verdünnen (normalerweise 1:200 für T- und Sox2-Antikörper) und zwei bis drei Tage bei 4 °C inkubieren.
      6. Vor Zugabe der sekundären Antikörper die Embryonen dreimal (jeweils 30 min) in 0,1% PBST bei 4 °C waschen. Sekundäre Antikörper in Blocklösung (1:1000) verdünnen und 2 Tage bei 4 °C lichtgeschützt inkubieren.
      7. Waschen Sie Embryonen sechsmal (jeweils 30 min) in 0,1% PBST bei 4 °C.
      8. Für die nukleare Gegenfärbung brüten Sie Embryonen in 4',6-Diamidino-2-Phenylindol, Dihydrochlorid (DAPI), verdünnt 1:500 in PBST, über Nacht auf einem Shaker bei 4 °C, geschützt vor Licht.
      9. Zum Schluss waschen Sie die Embryonen dreimal (jeweils 30 min) in 0,1% PBST bei 4 °C.
   3. Gewebereinigung und Objektträgervorbereitung
      1. Gewebereinigung mittels Methylsalicylat oder einer Mischung aus Benzylalkohol mit Benzylbenzoat (BABB)
         1. Vor der Klärung mit Methylsalicylat oder BABB die Embryonen vollständig dehydrieren, indem man sie durch eine Methanol/PBS-Serie, die aus einer sukzessiven Erhöhung der Methanolkonzentration um 10% besteht (Inkubationszeiten von jeweils 10 min bei 4 °C), auf 100% Methanol bringt. Um eine vollständige Dehydrierung zu erreichen, ersetzen Sie das 100% Methanol durch ein frisches und warten Sie weitere 10 Minuten.
         2. Führen Sie eine Embryo-Clearing durch, indem Sie in eine Reihe von Methylsalicylat oder BABB in Methanol mit 20% sukzessiver Konzentrationserhöhung einbetten, 20-minütige Inkubation für jeden Schritt. Wenn die Methylsalicylat- oder BABB-Lösung 100% erreicht, nehmen Sie zwei zusätzliche Änderungen für eine frische Lösung vor.
            ACHTUNG: Sowohl Methylsalicylat als auch BABB sollten in einem Abzug gehandhabt werden.
            HINWEIS: Für eine ordnungsgemäße Beseitigung ist es wichtig, dass die Embryonen vollständig dehydriert sind. Es ist auch wichtig, dass das Methanol vollständig mit Methylsalicylat oder BABB in der Clearinglösungsserie gemischt wird.
         3. Nachdem die Embryonen vollständig transparent geworden sind, behandeln Sie sie einzeln und verwenden Sie vorzugsweise ein Fluoreszenz-Stereoskop, um die Wahrscheinlichkeit von Gewebeschäden zu verringern.
         4. Für die Bildgebung montieren Sie Embryonen entweder in einem konkaven Glasobjektträger mit einer Vertiefung von 75 mm x 25 mm oder einem 20 mm x 60 mm # 1,5 Deckglas. Die letztere Option ermöglicht bei Bedarf die Bildgebung von beiden Seiten, ist jedoch viel zerbrechlicher und schwieriger zu versiegeln. Übertragen Sie Embryonen mit einem Zahnstocher, einer feinen Baumwollspitze, einer Pasteur-Pipette oder einem anderen ähnlichen Instrument auf die Objektträger.
         5. Um eine Kompression der Embryonen zu vermeiden, fügen Sie Abstandshalter aus #1 Deckglasscherben (170 μm dick), Silikon oder dünnen Metallscheiben hinzu. Dann fügen Sie einen Tropfen Montagemedium hinzu, decken Sie es mit einem # 1 oder # 0 20x20 mm Deckglas ab und versiegeln Sie es.
         6. Wenn Sie Abstandshalter aus Glas oder Metall verwenden, versiegeln Sie mit geschmolzenem Paraffin, um die Zubereitung besser zu stabilisieren - versiegeln Sie nicht mit Nagellack, da es sich mit Methylsalicylat oder BABB löst. Um Blasen zu vermeiden, legen Sie das Deckglas auf eine Seite und schieben Sie es dann allmählich und vorsichtig zur Seite. Fügen Sie bei Bedarf mehr Medium hinzu.
            HINWEIS: Bitte sehen Sie sich das Video an, um besser zu verstehen, wie man die gereinigten Embryonen manipuliert und wie man sie auf dem Objektträger montiert.
      2. Gewebereinigung mit RapiClear
         1. Bei der Anwendung von RapiClear ist keine Dehydrierung des Embryos erforderlich. Nach Schritt 1.2.2.9 werden die Embryonen in die Mitte eines konkaven Glasobjektträgers mit einer Vertiefung von 75 mm x 25 mm gelegt, das gesamte PBST im Objektträger der Vertiefung entfernt und 200 μL Klärlösung hinzugefügt.
         2. Nach 10 Minuten vor Licht geschützt, wenn die Embryonen anfangen, transparent zu werden, ersetzen Sie die Reinigungslösung, warten Sie weitere 20 Minuten (vor Licht geschützt) und bedecken Sie sie dann mit einem Deckglas, das von einer Seite ausgeht und sich sanft auf die andere zubewegt.
            HINWEIS: Die Zeit, um den Embryo vollständig zu entfernen, kann je nach Stadium und Größe der Embryonen von einigen Minuten bis über Nacht dauern. Außerdem sollte der gesamte Prozess unter einem Stereomikroskop durchgeführt werden. Um das Clearing und die Objektträgervorbereitung besser zu verstehen, beachten Sie bitte das Videoprotokoll.
3. Probenvorbereitung für die optische Projektionstomographie
   HINWEIS: Die folgenden Verfahren wurden aus früheren Protokollen angepasst^19,25,26. Das Protokoll wird für die Analyse von E18.5-Mausföten beschrieben.
   1. Mouse Fötus Dissektion und Fixierung Verfahren
      1. Sezieren Sie E18.5 Mausföten in kaltem (4 °C) PBS, entfernen Sie alle extraembryonalen Membranen und waschen Sie die Föten dann mehrmals in frischem PBS, um Blut und Ablagerungen zu entfernen, die während des Dissektionsverfahrens produziert wurden.
      2. Fixieren Sie Föten in 4% PFA in PBS, bei 4 °C für 5 bis 7 Tage.
      3. Waschen Sie Föten einmal (15 min) in PBS und dann dreimal (jeweils 30 min) in demineralisiertem Wasser oder PBS. Führen Sie die Wäschen an einem Shaker durch.
      4. Dehydrieren Sie die Föten durch Inkubation (25 min Serie bei RT auf einem Shaker) in Methanollösungen mit steigenden Konzentrationen (10% Erhöhungen verdünnt in demineralisiertem Wasser oder PBS) bis 100% Methanol.
      5. Wechseln Sie die 100% ige Methanollösung (verwenden Sie ein frisches Aliquot) dreimal (jeweils 20 Minuten), um eine vollständige Dehydrierung zu gewährleisten. Embryonen können dann bei -20 °C gelagert oder direkt (einen Tag später) zum Bleichprozess gebracht werden (Schritt 1.3.2).
   2. Bleichverfahren
      1. Um die natürliche Pigmentierung zu entfernen, inkubieren Sie Föten (separat) auf einem Shaker, zuerst für einen Tag in 5% H 2 0 2 in Methanol und dann in 10% H 2 0₂in Methanol für bis zu 3 Tage, bis die Embryonen die gesamte natürliche Pigmentierung verlieren.
         ACHTUNG:_H2O2sollte vorsichtig in einem Abzug gehandhabt werden. Die Bleichlösung, die_H2O2enthält, erzeugt bei Kontakt mit der Probe Dämpfe_, und daher sollte das Rohr, das die Föten enthält, während des gesamten Bleichvorgangs offen bleiben. Einige Bleichprotokolle deuten auf die Kombination von_{H2O2mit Formamid} hin. Wird diese Alternative verwendet, ist besondere Vorsicht geboten, da die Zugabe von_H2O2zu unverdünntem Formamid zu einer Explosion führen kann.
      2. Rehydrieren Sie die Embryonen allmählich in einer umgekehrten Methanolserie (mit 10% Abnahme) in demineralisiertem Wasser, das jeweils für 20 Minuten bei RT auf einem Shaker inkubiert wird, und waschen Sie es schließlich dreimal (jeweils 30 Minuten) in demineralisiertem Wasser. Warten Sie einen Tag, wechseln Sie das demineralisierte Wasser und fahren Sie fort.
         HINWEIS: Siehe Ergänzende Abbildung 1 für ein repräsentatives Ergebnis des Bleichprozesses.
   3. Demineralisierungsprotokoll
      HINWEIS: Die Entmineralisierung ist optional, wird aber für Föten oder Welpen empfohlen.
      1. Führen Sie eine Demineralisierung durch, indem Sie die Föten in 0,1 m EDTA bei 42 °C für einige Stunden waschen [siehe auch Cho et al.27], gefolgt von fünf Wäschen (jeweils ²⁰ Minuten) mit demineralisiertem Wasser, um die EDTA vollständig zu entfernen. Führen Sie alle Vorgänge auf einem Shaker durch.
   4. Probenvorbereitung für das Clearing
      1. Betten Sie Föten in einen 1% Agaroseblock ein. Um diese Blöcke vorzubereiten, füllen Sie einen 50 ml Kunststoffschlauch oder eine Spritze (Aufbau eines zylindrischen Raums durch Abschneiden der Austrittsseite der Spritze und Verwendung des Kolbens, um die gegenüberliegende Seite zu blockieren) mit geschmolzener Agarose, platzieren Sie den Fötus in der Agarose in einer vertikalen Position und halten Sie diese Position in der Mitte des Blocks mit Hilfe einer Pinzette während der Erstarrung der Agarose.
      2. Stellen Sie die Form mit dem Block bei 4 °C (30 min) auf, damit die Agarose vollständig gejellisiert wird. Im Falle einer falschen Positionierung des Fötus innerhalb des Blocks oder des Auftretens von Luftblasen schmelzen Sie die Agarose, indem Sie den Block über Nacht auf 50 ° C legen, und wiederholen Sie den Vorgang am nächsten Tag.
      3. Entfernen Sie den Agaroseblock mit dem Fötus aus der Form und legen Sie ihn in einen Behälter mit demineralisiertem Wasser. Nach 15 min durch frisches demineralisiertes Wasser ersetzen.
      4. Vor dem Abtragen mit BABB die Probe dehydrieren. Um die Integrität des Gewebes besser zu erhalten, führen Sie die Dehydratisierung des Fötus allmählich mit einer Erhöhung der Methanolkonzentration um 10% (verdünnt in demineralisiertem Wasser oder PBS) durch, wobei jeder Schritt für mehr als 45 Minuten bei RT auf einem Shaker durchgeführt wird, bis 100% Methanol erreicht wird.
      5. Wechseln Sie das 100% Methanol (verwenden Sie ein frisches Aliquot), zuerst viermal in einstündigen Intervallen und dann wieder am nächsten Tag, um eine vollständige Dehydrierung zu gewährleisten.
   5. Clearing-Prozess und Probenmontage für OPT-Imaging
      1. Beseitigen Sie die Föten auf einem Schüttler durch eine Reihe (jeweils 2,5 Stunden) von BABB-Lösung in Methanol, mit 25% Erhöhung der BABB-Konzentration, bis 100% BABB erreicht ist.
      2. Ersetzen Sie die BABB-Lösung jeden Tag durch eine frische, bis der Fötus vollständig transparent ist. Dieser Vorgang kann 3 bis 5 Tage dauern. Halten Sie den Block, der den Fötus enthält, während des gesamten Eingriffs auf einem Shaker. Föten können lange Zeit in 100% iger BABB-Lösung bleiben.
         HINWEIS: Wenn der Fötus nicht richtig dehydriert ist, wird er nach der ersten Zugabe von BABB leicht durchscheinend ("weißliche" Emulsion). Wenn dies geschieht, treten Sie zurück in reines Methanol und führen Sie zwei zusätzliche Waschungen in frischem Methanol durch. Kühlen Sie niemals Proben während der Dehydrierung und Reinigung, da Temperaturänderungen zu Wasserkondensation führen können.
      3. Befestigen Sie den abgeräumten Agaroseblock an der Motorachse des OPT-Scanners, passen Sie die Optik an, um ein Bild des gesamten Fötus zu erhalten, und fahren Sie mit der Erfassung eines vollständigen Projektionsdatensatzes^19,28 fort.

2. Mikroskop-/Bildaufnahme

1. Für eine korrekte 3D- und 4D-Bildgebung wählen Sie das Mikroskop, das am besten zum experimentellen Ziel passt. Tabelle 2 enthält allgemeine Informationen, die Sie durch die Auswahl führen.

Optische Mikroskopie-Techniken	Bildgebendes Prinzip	Experimentelles Ziel und Überlegungen
Weitfeld-Bildgebung	Verwendet Fluoreszenz, reflektiertes oder durchgelassenes Licht.	Ideal für einen schnellen und allgemeinen Überblick über den Embryo (z.B. für Screenings und zur Beurteilung von Entwicklungsstadien und offensichtlichen Phänotypen). Die reduzierte Schärfentiefe im Vergleich zur beobachtbaren Dicke bei hohen Vergrößerungen erlaubt keine genaue Interpretation oder Analyse der 3D-Morphologie.
Konfokal (Laserscanning; CLSM)	Verwendet Laserscanning-Beleuchtung und Erkennung von Fluoreszenz durch ein Loch.	Ermöglicht die Abbildung von optischen Scheiben fluoreszierend markierter Proben, idealerweise mit einem starken Signal. Die Bildgebung durch eine Lochblende entfernt das Signal aus der Tiefenschärfe und ermöglicht so eine genaue Unterscheidung von Informationen in 3D. Die Erfassung ist um Größenordnungen langsamer als Widefield, aber mit beispiellosem Kontrast und 3D-Diskriminierung der Morphologie. Eine hohe zeitliche Auflösung ist nicht erreichbar, da Bilder jeweils 1 Pixel erfasst werden. Gut für die 3D-Bildgebung von fixierten Mausembryonen bis E9.5. Die Bildgebung durch das gesamte präsomitische Mesoderm oder die Somiten erfordert eine Gewebereinigung aufgrund der Lichtstreuung in tieferen Geweben. Phototoxizität und Bleichen sind eine Überlegung. Photobleichen kann, innerhalb von Grenzen, a posteriori kompensiert werden. Phototoxische Wirkungen in lebenden Proben können jedoch nicht und sind oft nicht leicht zu bestimmen. Dies ist offensichtlicher, wenn Proben einen niedrigen Ausdruck aufweisen und hohe Laserleistungen erforderlich sind.
Zwei-Photonen-Anregungsfluoreszenz (TPEFM)	Es verwendet gepulste Nahinfrarot-Laseranregung (NIR) anstelle von sichtbarer Laserbeleuchtung.	TPEFM ermöglicht das optische Schneiden durch dickere Proben als CLSM. Die Auflösung ist etwas niedriger, aber der Kontrast in tieferen Geweben ist wesentlich besser, was ihn ideal für die Live-Bildgebung von Mausembryonen macht. Obwohl TPEFM oft als weniger phototoxisch angesehen wird als herkömmliches CLSM, erfordert es hohe Laserleistungen, die auch schädliche Auswirkungen auf Zellen und Gewebe haben können. Ideal für die 3D-Bildgebung von Embryonen bis zu E11,5, obwohl die Bildgebung durch das gesamte präsomitische Mesoderm immer noch eine Gewebereinigung erfordert.
Konfokal (rotierende Scheibe)	Eine Form des Konfokals, die anstelle eines einzelnen Lasers mehrere punktförmige Quellen verwendet.	Die Verwendung mehrerer punktförmiger Strukturen ermöglicht eine schnellere Erstellung optischer Slices (mehrere Bilder pro Sekunde oder Stapel pro Minute sind erreichbar) als CLSM. Die Akquisition ist praktisch so schnell wie Widefield, mit angemessener 3D-Diskriminierung. Es erlaubt jedoch nur die Bildgebung der oberflächlichsten Gewebe des Mausembryos. Ermöglicht einen empfindlicheren Nachweis als CLSM und ist damit eine Alternative für Embryonen mit geringer Expression von Fluoreszenzproteinen.
Lichtblatt / Einzelebene (LSFM/SPIM)	Anstelle einer Weitfeld- oder punktartigen Beleuchtung wird die Probe jeweils eine orthogonale Ebene beleuchtet. In den meisten Konfigurationen ermöglicht es die Bildgebung aus mehreren Blickwinkeln.	Erfordert auch fluoreszierend markierte Proben. Die Erfassung optischer Scheiben ist extrem schnell (mehrere Bilder pro Sekunde) und hat reduzierte Auswirkungen von Phototoxizität oder Bleichung. Wenn jedoch Multiview erforderlich ist, können nachfolgende Dataset-Vorverarbeitungsschritte Stunden / Tage der Berechnung erfordern. LSFM/SPIM ermöglicht eine bessere Erkennung niedrigerer Expressionsniveaus als CLSM. Ideal für die 3D-Bildgebung von Embryonen in der Toto-Maus während der Gastrulation. Proben müssen oft montiert und in Suspension gehalten werden (unkonventionelle Vorbereitung).
Optische Projektionstomographie (OPT)	Optische Schnitte werden nicht detektiert, sondern aus einer Reihe von Weitfeldbildern des gesamten Embryos aus verschiedenen Blickwinkeln berechnet (die "Projektionen").	Ideal für die 3D-Bildgebung von Mausembryonen / Föten im Spätstadium (>5 mm), aber nur fixiert und beseitigt. Hat den Vorteil, 3D-Stapel von optischen Scheiben sowohl von fluoreszierenden als auch von nicht fluoreszierenden Proben herzustellen. Datensätze sind isometrisch (Slices mit gleicher Auflösung in allen drei Dimensionen) und eignen sich daher ideal für die anatomische Analyse. Die Erfassung eines Projektionsdatensatzes kann nur wenige Minuten dauern, gefolgt von 15-30 Minuten Rekonstruktion.
Optische Kohärenztomographie (OCT)	Verwendet NIR-Beleuchtung durch die Probe, um optische Schnitte basierend auf Interferenzen mit der Lichtreflexion zu erhalten.	OCT ermöglicht eine einfache Bildgebung durch lebendes Gewebe (einige Millimeter tief in der Probe ohne Fluoreszenzkontrast) mit einer Auflösung von einigen Dutzend Mikrometern. Die Erfassung ist sehr schnell (ein paar Scheiben pro Sekunde). Obwohl es eine mögliche Alternative für OPT ist, ist diese Technik nicht allgemein verfügbar.
Super-Resolution (SR), Atomkraft (AFM) oder Nahfeld-Bildgebung (NSOM)	SR basiert normalerweise auf Einzelmoleküllokalisierung und AFM/NSOM auf Rasteroberflächen mit Subbeugungsauflösungen (wenige Nanometer).	Ermöglicht die Bildgebung auf Subbeugungsebene (<200 nm Auflösung), oft mit der Absicht, einzelne Moleküle oder Moleküle an der Zelloberfläche zu erkennen. Nicht ideal für die morphologische Analyse großer Proben wie Mausembryonen. Die Aufnahme ist in der Regel ein langsamer Prozess (Sekunden bis Minuten pro Bild).

Tabelle 2 - Generische Informationen zur Orientierung bei der Auswahl der bildgebenden Technik/des Mikroskops, die für das spezifische experimentelle Ziel des Forschers besser geeignet sind.

3. Vorverarbeitung von Bilddatensätzen

HINWEIS: Hier heben wir einige der wichtigsten Schritte der Vorverarbeitung von Bilddatensätzen hervor, nämlich Rauschunterdrückung (3.1) und Dekonvolution (3.2), und stellen Algorithmen bereit, die eine ordnungsgemäße Vorbereitung und Vorverarbeitung von 3D-Datensätzen (3.3) und Whole-Mount-Immunfluoreszenzfärbungen (3.4) ermöglichen. Schließlich geben wir Referenzen an, die detailliert ein Protokoll für die Vorverarbeitung und Rekonstruktion von OPT-Datensätzen beschreiben.

1. Geräuschreduzierung
   1. Wenn die Bilder ein reduziertes Signal-Rausch-Verhältnis aufweisen, sollten Sie eine klassische Methode wie einen "Median" -Filter oder eine "anisotrope Diffusion" anwenden, die in Fidschi / ImageJ²⁹ verfügbar ist, oder eine ausgefeiltere Methode, die auf maschinellem Lernen basiert, wie "CARE"^{30 oder "Noise2Void"31.}
      HINWEIS: Dies ist besonders relevant für Live-Imaging-Datensätze, bei denen das Photobleichen und die Photoschädigung ein großes Problem darstellen und niedrigere Belichtungen und höhere Detektorgewinne erforderlich sind.
2. Dekonvolution
   1. Wenn die Bilder mit hoher Auflösung aufgenommen wurden (in der Nähe oder bei Nyquist-Probe), sollten Sie eine Bildwiederherstellung mit Dekonvolution in Betracht ziehen, um die Qualität des Datensatzes vor der Analyse zu verbessern. Beachten Sie, dass einige Dekonvolutionswerkzeuge auch einen Entrauschungsschritt enthalten.
      HINWEIS: Dies wurde ausführlich in Krull et ^al.32 und in der Dokumentation auf der Huygens Deconvolution Software Website (https://svi.nl/HomePage) behandelt.
3. Vorbereiten einer 3D-Datensatz-Zeitreihe für die ordnungsgemäße Visualisierung und Analyse
   HINWEIS: Oft kann Embryonen- oder Stadiumsdrift während der Zeitrafferbildgebung auftreten. Dies muss vor der Durchführung der Analyse korrigiert werden. Manchmal ist die Drift so stark, dass die Akquisition unterbrochen und Anpassungen vorgenommen werden müssen. In diesem Fall ist es am besten, die gleichen X-, Y- und Z-Abmessungen beizubehalten.
   1. Separate 4D-Stacks können mit der "Verkettungsfunktion" von Fidschi zu einem einzigen 4D-Hyperstack verkettet werden. Dieses Tool verarbeitet jedoch keine Composite- / Hyperstacks, daher ist es notwendig, alle 4D-Segmente mit der Operation Image | in einfache Stapel zu konvertieren Hyperstacks-| Hyperstack zum Stapeln. Behalten Sie ein Nummerierungssystem bei, um die Reihenfolge dieser 4D-Segmente beizubehalten, und notieren Sie sich die Informationen zu jedem einzelnen (Kanäle, Segmente, Zeitpunkte). Wiederholen Sie die Prozedur für alle Segmente und verketten Sie sie dann mit der Prozedur Image | Stapel | Tools | Verketten.
   2. Rekonstruieren Sie den verketteten Hyperstack mit der Operation Image | Hyperstacks-| Stapeln Sie zu Hyperstack und wählen Sie die richtige Reihenfolge der verschiedenen Dimensionen. Überprüfen Sie den Hyperstack, um sicherzustellen, dass alle Dimensionen korrekt sequenziert sind.
      HINWEIS: Die Anzahl der Kanäle (c ) und Slices (z) sollte für alle 4D-Segmente gleich sein. Die Anzahl der (Zeit-) Frames (t) sollte gleich der Summe der für alle 4D-Segmente hinzugefügten Zeitpunkte sein. Es ist wichtig, den Stack zu durchsuchen, um zu verstehen, wie die verschiedenen Dimensionen interpoliert werden, bevor Sie die Konvertierung in Hyperstack durchführen. Der Standardwert für Fidschi/ImageJ sind abwechselnde Kanäle, dann abwechselnde Z-Slices und dann abwechselnde Zeitpunkte ("XYCZT"). Vergewissern Sie sich, dass dies für die vom Mikroskop erzeugten Daten gilt.
   3. Wählen Sie Composite als Anzeigemodus und speichern Sie als Tagged Image File Format (TIFF). Erwägen Sie bei großen Datensätzen die Konvertierung in das BigDataViewer^33-Format , indem Sie den Vorgang Plugins | ausführen BigDataViewer-| Exportieren Sie das aktuelle Bild als XML/HDF5. Dadurch wird ein Datensatz generiert, der mit dem BigDataViewer effizienter und in 3D durchsucht werden kann und von anderen Fidschi/ImageJ-Tools für Big-Data-Datensätze verarbeitet werden kann.
   4. Registrieren Sie den verketteten Hyperstack (Zeitreihe von 3D-Stacks), um die Drift des Embryos / Stadiums entweder mit dem "Correct 3D Drift" ImageJ-Plugin³⁴ oder dem BigStitcher-Plugin³⁵ zu kompensieren, abhängig vom Grad der erforderlichen Driftkorrektur. XML/HDF5 Dateien können mit BigStitcher geöffnet werden.
      HINWEIS: Es ist notwendig, die Registrierung von 3D-Zeitraffern durchzuführen, die die Embryodrift zeigen, bevor versucht wird, Zellverfolgung oder Bewegungsanalyse durchzuführen. Die Korrektur der Drift ist auch notwendig, um morphogenetische Bewegungen richtig zu interpretieren.
4. Vorverarbeitung von Datensätzen der Immunfluoreszenzbildgebung
   1. Signaldämpfung in Z-Tiefe
      HINWEIS: Obwohl die von uns vorgeschlagene Methode zur Korrektur der Signaldämpfung nützlich sein kann, sollte dies vorsichtig angewendet werden, da oft weniger Signal in der Tiefe tatsächlich ein biologisches und kein optisches Phänomen widerspiegeln kann. Erwägen Sie, den Zerfall in einem Gewebebereich zu messen, in dem das interessierende Molekül voraussichtlich nicht vorhanden oder ausgedrückt ist, und passen Sie die Kompensation für diesen Bereich an. Wenn es immer noch ein niedrigeres positives Signal in der Tiefe gibt, kann es ein tatsächliches biologisches Phänomen aufdecken. Bedenken Sie auch, dass einige Bereiche der Probe mehr Streuung oder Laserdämpfung erzeugen können als andere und dass sie mit dieser einfachen Methode nicht vollständig korrigiert werden.
      1. Bei dickeren Embryonen im Spätstadium können Strahldämpfung, Photobleichen und sphärische Aberration, die durch eine Nichtübereinstimmung der Brechungsindizes (zwischen dem Montagemedium und dem Mikroskopobjektiv) verursacht werden, zu Datensätzen führen, bei denen die Fluoreszenzintensität in den tieferen Scheiben des Z-Stapels stark abgeschwächt wird. Kompensieren Sie daher diesen Signalverlust vor der Analyse. Die analytische Bestimmung der genauesten Dämpfung ist komplex und stark probenabhängig³⁶, aber eine schnelle Annäherung kann empirisch in ImageJ/Fiji mit dem Process | Mathe-| Makrofunktion und Klicken auf Vorschau.
      2. Laden Sie den Z-Stack in Fiji/ImageJ und führen Sie dann das Verfahren Image | durch Stapel | Neu aufschneiden. Beginnen Sie bei: oben, halten Sie Interpolation vermeiden aktiviert und OK. Jetzt ist das "Z" die "Y"-Achse. Als nächstes machen Sie Image | Nachschlagetabellen (LUT) | Feuer (oder jede andere mehrfarbige LUT). Dies wird dazu beitragen, die beste Kompensation bei den nächsten Schritten visuell zu beurteilen. Wechseln Sie zu einer Scheibe in der Mitte des Embryos, wo die Auswirkungen der Dämpfung in der Tiefe deutlich sichtbar sind (die Intensität sinkt von oben [oberflächlich] nach unten [tiefer]).
      3. Fahren Sie mit der Bestimmung der Korrektur des vertikalen ("y") Intensitätsabfalls mit dem Verfahren Process | fort Mathe-| Makro, und fügen Sie den folgenden "Code" genau wie hier geschrieben hinzu:
         v = v * A * exp ( B * y/h )
         In diesem Ausdruck ist "v" die Variable für die Pixelintensität (die als Funktion für die Tiefe angepasst wird), "y" die Variable für die Tiefe und "h" für die volle Tiefe, und "exp" ist eine Exponentialfunktion; "A" sollte durch eine Zahl zwischen 0,5 und 1,0 ersetzt werden (wählen Sie niedrigere Werte, um eine Übersättigung der oberen Schichten des Z-Stapels zu vermeiden); B durch eine Zahl zwischen 0,5 und 2,0 ersetzt, je nachdem, wie stark die Z-Tiefendämpfung ist - idealerweise sollte es 1 sein, aber in einigen Fällen ist weniger (oder mehr) notwendig, um die unteren Schichten korrekt zu kompensieren; ein höherer Wert von B führt zu einer stärkeren Dämpfungskompensation. Klicken Sie auf Vorschau , um eine erste Bewertung vorzunehmen. Testen Sie verschiedene Werte von A und B, bis Sie eine angemessene Kompensation von oben nach unten im Bild erhalten (die "Fire" LUT kann für diese Beurteilung hilfreich sein). Wenn Sie zufrieden sind, übernehmen Sie die Einstellungen, indem Sie auf OK klicken.
         HINWEIS: Dies muss in jedem Kanal einzeln durchgeführt werden, da rotverschobene Farbstoffe und Laser weniger abschwächen können und einige Farbstoffe schneller bleichen als andere. Beachten Sie, dass dieses Verfahren möglicherweise nicht genau genug ist, um eine zuverlässige Quantifizierung von Fluoreszenzintensitätsschwankungen in der Tiefe zu ermöglichen, obwohl es sicherlich zuverlässiger ist als die Durchführung von Quantifizierungen direkt im ursprünglichen 3D-Datensatz, der stark von der Dämpfung des Signals in der Tiefe betroffen ist. Eine Möglichkeit, diesen Effekt zu identifizieren und zu kontrollieren, besteht darin, die Bildgebung verschiedener Embryonen von der dorsalen oder ventralen Seite zu vergleichen.
      4. Stellen Sie die ursprüngliche Geometrie des kompensierten Z-Stacks wieder her, indem Sie Image | ausführen Stapel | Neu schneiden, oben beginnen, Interpolation vermeiden ankreuzen, und jetzt muss das "Y" wieder zur "Z" -Ebene werden; Ersetzen Sie die Farbe, indem Sie "Image |" ausführen Nachschlagetabellen | Grays" (oder die andere LUT Ihrer Wahl). Verwerfen Sie den ursprünglichen, nicht kompensierten Z-Stack und speichern Sie die kompensierte Version.
         HINWEIS: Siehe Ergänzende Abbildung 2 als repräsentatives Ergebnis der Z-Tiefensignaldämpfungsmethode.
   2. Z-Achsen-Skalierungskorrektur
      1. Bei der Bildgebung mit einem Objektiv, das für einen Brechungsindex ausgelegt ist, der sich von dem unterscheidet, der für die Embryonalmontage verwendet wird, ist es notwendig, die Schichtdicke neu zu skalieren, da sonst die Tiefenmessungen falsch sind (möglicherweise um 50%, wenn ein "trockenes" Objektiv an einem gewebegereinigten Embryo verwendet wird). Dies wird erläutert, überprüft und die verschiedenen Methoden diskutiert, in ³⁷ und ^38. Die analytische Bestimmung der tatsächlichen Z-Achsen-Verzerrungsskala ist komplex, aber eine akzeptable Näherung kann leicht bestimmt werden, indem das Verhältnis zwischen dem Brechungsindex der Probe und dem Brechungsindex des Objektivs ermittelt wird (z. B. 1,53/1,0 für einen mit Methylsalicylat bereinigten Embryo, der mit einem trockenen 20-fachen Objektiv aufgenommen wurde, oder 1,56/1,33 für einen mit BABB gereinigten und mit einem Wasserimmersionsobjektiv abgebildeten Embryo).
      2. Wenn der Z-Stack-Datensatz bereits in Fidschi/ImageJ geöffnet ist (für Mehrkanalbilder, nachdem sie als "Composite" mit allen Kanälen zusammengesetzt wurden), gehen Sie zu Image | Eigenschaften und Änderung der Voxeltiefe auf die während der Bildaufnahme erhaltene Schichtdicke, multipliziert mit der im vorherigen Schritt festgelegten Z-Achsen-Skalierungskorrektur (4.2.1; Abschnitt "Vorverarbeitung von Bilddatensätzen"). Bestätigen Sie das Ergebnis mit der Bild| Stapel | Orthogonale Ansichten.
   3. Neupositionierung des Embryos in eine anatomisch einheitliche Position mit Fidschi/ImageJ
      HINWEIS: Neupositionierung des Embryos (siehe die unter Ergänzende Abbildung 3) in eine standardisierte anterior-posteriore [A-P] und dorsal-ventrale [D-V] Achsenposition unter Verwendung von Fiji/ImageJ, erfordert die Installation der TransformJ ³⁹ Suite von Plugins von Fidschis "ImageScience" Update-Website.
      HINWEIS: Diese Technik ist Runden von Rotationen in den drei Ebenen vorzuziehen, die Aliasing-Artefakte und eine Verschlechterung der Auflösung einführen würden. Da das Fiji/ImageJ 3D-Viewer-Plugin jedoch Datensätze, die größer als 200-300 MB sind, nicht richtig verarbeiten kann (das Plugin wird möglicherweise nicht gerendert oder zeigt kein unvorhersehbares Verhalten beim Versuch, den Betrachtungswinkel zu drehen), muss das ursprüngliche 3D-Dataset zuerst heruntergerechnet werden.
      1. Beginnen Sie mit der Reduzierung der Datensatzgröße in Fidschis Image | Skalieren und fügen Sie dann die X-, Y- und Z-"Skalierungswerte" ein, die erforderlich sind, um den Datensatz auf weniger als 200 MB zu reduzieren (z. B. führt ein Downsampling von 0,5 x 0,5 x 0,5 zu einem Datensatz, der 8-mal kleiner ist). Stellen Sie sicher, dass die Option Neues Fenster erstellen aktiviert ist.
      2. Gehen Sie dann zu Plugins | 3D-Viewer. Klicken Sie im 3D-Viewer-Fenster auf den Embryo, um ihn auszuwählen, und ein rotes 3D-Feld sollte angezeigt werden. Bei Verwendung dieses Modus (mit aktiviertem rotem Kästchen) kann die Drehung des Datensatzes mit der Maus gesteuert werden, im Gegensatz zum Standardverhalten, bei dem der Betrachtungswinkel gedreht werden soll. Wenn Sie den Embryo mit der Maus neu positionieren, klicken Sie niemals nach außen, da sonst der Datensatz deaktiviert wird.
      3. Wenn Sie mit der neuen Position des Embryos zufrieden sind, wählen Sie Bearbeiten | Transformation | Exportieren Sie das transformierte Bild im Menü des Fensters "3D-Viewer". Um die verschiedenen orthogonalen Ebenen zu inspizieren, gehen Sie zu Bild | Stapel | Orthogonale Ansichten. Wenn der Embryo nicht richtig positioniert ist, schließen Sie das Fenster und gehen Sie zurück zum 3D-Viewer-Fenster und passen Sie es erneut an. Wiederholen Sie Schritt 4.3.2.
      4. Wenn der Embryo richtig positioniert ist, wählen Sie aus dem Fenstermenü "3D-Viewer" | bearbeiten Transformation | Speichern Sie die Transformation und speichern Sie die Transformationsmatrix in einer Textdatei mit der Erweiterung *.mat. Öffnen Sie diese Textdatei mit Fiji/ImageJ, entfernen Sie die ersten beiden Zeilen (Text) und speichern Sie sie erneut. Dadurch wird eine Transformationsmatrixdatei erstellt, die mit dem in ³⁹ beschriebenen Plugin "TransformJ" kompatibel ist.
      5. Wechseln Sie zum Dataset mit voller Auflösung (kann ein Mehrkanal-Composite-Hyperstack sein) und führen Sie die Operation Plugins | durch TransformJ | TransformJ affin. Suchen Sie im neuen Fenster nach der zuvor gespeicherten Matrixdatei, wählen Sie die Cubic B-Spline-Interpolation | die isotrope Neuprobe | In Ordnung.
         HINWEIS: Dieser Vorgang ist speicher- und CPU-intensiv. Abhängig von der Größe der Arbeitsstation und des Datensatzes kann der Vorgang Minuten bis Stunden dauern. Die Verwendung der isotropen Resample-Option garantiert, dass während des Transformationsvorgangs keine Auflösung verloren geht, so dass der Datensatz erheblich an Größe zunimmt und nicht mehr wie der ursprüngliche konfokale z-Stapel anisotrop ist. Es ist zu erwarten, dass die Anzahl der Slices in der Z-Achse auf die gleiche Anzahl von X- und Y-Pixeln jedes Slices ansteigt und der Stack auf das 5-10-fache der ursprünglichen Größe aufgebläht wird. Dies ist notwendig, um sicherzustellen, dass bei der Interpolation von Voxeln während der Rotation und Translation keine Informationen verloren gehen.
      6. Sobald der Embryo richtig neu positioniert ist, ist es oft möglich, den größten Teil des leeren Raums, der um den Embryo herum entsteht, zu beschneiden. Führen Sie eine vollständige Z-Projektionsbild -| durch Stapel | Z-Projekt... und wählen Sie Maximale Intensität; Zeichnen Sie den minimalen ROI, der den gesamten Embryo in X und Y enthält. Wechseln Sie zu den Bildfenstern des ursprünglichen Datensatzes, gehen Sie zu Bearbeiten | Auswahl | Setzen Sie die Auswahl wieder her und schneiden Sie sie zu, indem Sie Bild | Zuschneiden auswählen.
      7. Schneiden Sie die Scheiben am Anfang und am Ende ab, die das Embryogewebe nicht schneiden. Wählen Sie dazu Bild | Stapel | Tools | Slice Remover und geben Sie das erste und letzte zu entfernende Slice an, wobei Sie sicherstellen, dass das "Inkrement" in 1 geändert wird (andernfalls werden nur alle anderen Slices entfernt).
      8. Stellen Sie nach der Neupositionierung und dem Trimmen des neuen Datensatzes sicher, dass Sie ihn als neue TIFF-Datei speichern. Wenn dieses Dataset zu groß ist (mehr als der GPU-RAM), sollten Sie BigDataViewer verwenden, um es als XML/DHF5 zu exportieren, wie in Schritt 3.3 (im Abschnitt "Vorverarbeitung des Bilddatasets") erläutert.
5. Vorverarbeitung und Rekonstruktion von OPT-Datensätzen
   1. Verwenden Sie das Protokoll für die Vorverarbeitung und Rekonstruktion von OPT-Datensätzen, das in Martins et ^al.19 und Gualda et ^al.28 beschrieben ist.

4.3D Rendering, Visualisierung und Analyse

HINWEIS: Hier finden Sie eine Liste der möglichen Anwendungen verschiedener Softwaretools, die die Visualisierung und Analyse von 3D-Bilddatensätzen ermöglichen oder verbessern.

1. 3D-Rendering und Visualisierung mit Drishti
   HINWEIS: Drishti⁴⁰ ist eine kostenlose wissenschaftliche Visualisierungssoftware, die entwickelt wurde, um 3D- und 4D-Datensätze aus der Mikro-CT-, Konfokal-/Multiphotonen- und Lichtblattmikroskopie zu erforschen und zu präsentieren. Hier verwenden wir diese Software für das 3D-Rendering und die Visualisierung der Ganzkörper-Immunfluoreszenzfärbung (Schritt 2; Abschnitt "Probenvorbereitung für die 3D-Bildgebung"). Es gibt mehrere Tutorials online, um Benutzern zu helfen, zu verstehen, wie man Drishti bedient; Suchen Sie online nach "Ajay Limaye Drishti 3D tutorials". Drishti kann Stapel von TIFF-Dateien nicht direkt lesen, daher müssen sie zuerst in das native "pvl.nc" -Format konvertiert werden.
   1. Führen Sie das Tool "drishtiimport.exe" aus, das sich im Drishti-Installationsordner befindet: Dateien | | laden Dateien | Wählen Sie "Graustufen-TIFF-Bilddateien" und laden Sie einen einkanaligen 3D-Stack, wie er von Fidschi / ImageJ gespeichert wurde. Im Falle eines Mehrkanal-Composite-Stacks teilen Sie die Kanäle in Fidschi/ImageJ auf und speichern Sie sie einzeln. Voxel-Typ ist "ushort"; "Datei"..."Speichern unter"..."TIF", beantworte alle Fragen mit "y". Stellen Sie im Fenster Zusätzliche Informationen sicher, dass Sie nach der Voxelgröße fragen, dass Sie die richtigen Voxelgrößen "X Y Z" hinzufügen.
   2. Laden von *.pvl.nc-Dateien in Drishti und Rendering: Im Hauptfenster von Drishti | Datei | laden Laden Sie 1 ( - 4 ) Volumes in Abhängigkeit von der Anzahl der verfügbaren Kanäle (als separate Dateien). Drücken Sie nach dem Laden F2, um ein qualitativ hochwertiges Rendering zu erhalten. Für diese Aktion ist eine leistungsstarke GPU-Karte erforderlich. Informationen zum Umgang mit den Rendering-Parametern, Transfer-Funktions-Editor, Suche in den Online-Tutorials. Sobald Sie mit den Renderingeigenschaften zufrieden sind, fahren Sie mit dem Generieren eines animierten Renderings fort.
   3. Gehen Sie zu Ansicht und aktivieren Sie den Keyframe-Editor. Behandeln Sie den Embryo und positionieren Sie ihn in der gewünschten Ausgangsposition. Verwenden Sie die rechte Maustaste, um den Embryo bei Bedarf in die Mitte zu "ziehen", oder scrollen Sie mit der Maus, um zu zoomen. Klicken Sie im Keyframe-Editor auf Keyframe festlegen, wählen Sie dann eine andere Position, einen anderen Winkel oder einen anderen Zoom aus, ziehen Sie die Zeitlinienmarkierung auf einen anderen Zeitpunkt und legen Sie den Keyframe erneut fest. Jetzt gibt es 2 Keyframes, in denen der Embryo in 2 verschiedenen Positionen / Winkeln / Zoom dargestellt wird, und eine Reihe von Frames dazwischen. Durch Drücken der Play-Taste kann Drishti die fehlenden Bedingungen interpolieren und als Animation abspielen. Gehe zu Datei | Speichern Sie die Bildsequenz, um die animierte Sequenz aller Bilder zu speichern. Diese Bildsequenz kann später in Fidschi/ImageJ geöffnet und als AVI (File | gespeichert werden | importieren Bildsequenz ... Datei | Als | speichern JPEG-Komprimierung mit einer angemessenen Bildrate (wir empfehlen 15 - 30).
      HINWEIS: Obwohl Drishti das Speichern von *.wmv-Videos erlaubt, ist es ratsam, stattdessen als separate Frames zu speichern und die Serie erst später in das AVI- oder MOV-Videoformat zu konvertieren (dies kann mit Fiji / ImageJ erfolgen).
2. 3D-Rekonstitutionen und manuelle Segmentierung von Geweben mit Amira
   HINWEIS: Diese kommerzielle Software ermöglicht die manuelle oder automatische/halbautomatische 3D-Segmentierung von embryonalem Gewebe in 3D-Datensätzen. Es gibt ein Online-"Learning Center" für diese Software mit mehreren verfügbaren Tutorials ⁴¹. Im Folgenden werden die grundlegenden Schritte beschrieben, die erforderlich sind, um embryonales Gewebe manuell aus immunfluoreszenzgefärbten Embryonen zu segmentieren (Schritt 1.2). Die manuelle Segmentierung ist viel einfacher, nachdem der Embryo korrekt in einer Standard-A-P/D-V-Achse positioniert wurde (siehe Abschnitt "Vorverarbeitung von Bilddatensätzen", Schritt 4.3).
   1. Laden Sie ein 3D-TIFF-Dataset. Stellen Sie sicher, dass Sie die richtigen Voxelabmessungen angeben, wenn Sie dazu aufgefordert werden. Erstellen und verbinden Sie ein Visualisierungsmodul (z.B. "Orthoslice" oder "Volren") und prüfen Sie den Datensatz in 3D.
   2. Verbinden Sie das Feld "Bezeichnung " (oder " Neues Beschriftungsfeld bearbeiten" in neueren Versionen von Amira). In dieser Software werden die Ergebnisse der manuellen Segmentierung in "Materialien" gespeichert, also erstellen Sie ein Material für jedes Gewebe von Interesse. Verwenden Sie das "Lasso"-Tool für die manuelle Segmentierung. Es gibt mehrere Tutorials, die erklären, wie man das macht (suchen Sie online nach "Amira Segmentation Editor tutorial").
   3. Wenn Sie mit der Segmentierung aller interessierenden Gewebe fertig sind, beenden Sie den Segmentierungseditor , indem Sie zurück in den Projektmodus wechseln. Nachdem eine neue Version des Datensatzes erstellt wurde (das "Label-Feld", das jetzt an das ursprüngliche Datensatzmodul angehängt ist), in dem Pixel, die zu jedem Material gehören, den gleichen Wert haben.
   4. Konvertieren Sie diese "Materialien" in 3D-Objekte, indem Sie 3D-Oberflächenmodelle aus dem Datensatz "Labels" generieren. Dies kann durch Anhängen eines "Generate Surface" -Moduls erfolgen, das die Parameter nach Bedarf anpasst (aktivieren Sie die Optionen "Compactify", "border", "Adjust coords" und "Unconstrained Smoothing"). Klicken Sie auf Übernehmen und ein neues Modul *.surf wird generiert.
   5. Visualisierung der Oberflächenobjekte, Extrahieren und Exportieren einzeln als *obj-Dateien. Anschließen eines Display-| SurfaceView-Modul auf das *.surf-Modul und überprüfen Sie im Hauptviewer. Wählen Sie im Bereich "Eigenschaften" des Moduls "SurfaceView" in der Eigenschaft "Materialien" die Option Alle + Alle und klicken Sie auf Entfernen, damit der Puffer des Betrachters geleert wird. Wählen Sie dann im zweiten Pulldown der Eigenschaft Materials nur ein Material aus und klicken Sie auf Zum Puffer hinzufügen. Nur dieses Material sollte sichtbar sein.
   6. Klicken Sie in der Eigenschaft Zeichenstil in weitere Optionen | Oberfläche erstellen und ein neues *.surf-Modul wird erstellt und dem Projekt hinzugefügt. Benennen Sie es in den Namen des Gewebes um (drücken Sie F2 auf der Tastatur) und Datei | Daten exportieren als... und Save as type: Wavefront (*.obj). Wiederholen Sie den Vorgang für jedes Material.
      HINWEIS: Diese *.obj-Dateien, die jeweils eines der in Amira segmentierten Gewebe enthalten, können von anderen Tools ("3Dviewer" Plugin von Fiji/ImageJ und SimLab) verwendet werden.
3. Interaktive 3D-Visualisierung in einem portablen Dokumentformat (PDF) mit SimLab Composer
   HINWEIS: Diese 3D-Computergrafiksoftware erleichtert die Erstellung von Oberflächenbildern, Animationen und Simulationen. Nützliche Tutorials finden Sie in Zeile ⁴². Hier beschreiben wir, wie diese Software die Erstellung von interaktiven 3D-PDF-Illustrationen unter Verwendung der mit Amira erstellten 3D-Oberflächendateien (*.obj) (Schritt 2.3; Abschnitt "3D-Rendering, Visualisierung und Analyse".
   1. Gehe zu Datei | Neu und erstellen Sie eine leere Szene. Importieren und importieren Sie dann die 1. *.obj-Datei, die von Amira gespeichert |. Lassen Sie alle Optionen des Fensters Datei importieren deaktiviert und klicken Sie auf OK.
   2. Wenn im Anzeigefenster des Komponisten nichts angezeigt wird, klicken Sie auf Strg+F oder auf das Symbol für Alle anpassen. Nun sollte das segmentierte Objekt in der Mitte des Fensters erscheinen. Wiederholen Sie den Vorgang, um ein weiteres segmentiertes Objekt hinzuzufügen und seine Position relativ zum 1. Objekt zu bestätigen (z. B. 2 benachbarte Somiten).
   3. Wählen Sie eines der Objekte im Anzeigefenster aus, indem Sie mit der linken Maustaste klicken, ändern Sie seinen Namen, um den Namen der anatomischen Struktur oder des Gewebes widerzuspiegeln, wechseln Sie dann zur Darstellung "3DGeom ~ 1" und ändern Sie im Bedienfeld "Materialien " die Farbe, indem Sie die R,G,B-Werte ändern.
   4. Wiederholen Sie den Vorgang für alle Objekte, bis die 3D-Illustration vollständig zusammengebaut ist. Beachten Sie, dass einige Materialien auch transparent gemacht werden können, indem der "Alpha" -Kanal neben den RGB-Werten manipuliert wird und dadurch die Beobachtung interner oder verdeckter Objekte ermöglicht wird.
   5. Mit dieser Software kann die zusammengesetzte Embryonenillustration als "3D-PDF"-Datei exportiert werden, die in Publikationen aufgenommen werden kann. Erstellen Sie zunächst eine "Vorlage" mit Text und aktiven Links, um "Szenenzustände" zu ändern, um Anweisungen und drei verschiedene Stufen in derselben Illustration einfügen zu können. Dies kann erreicht werden, indem Sie vom Modus "Szenenerstellung" in den Modus "Teilen" (Schaltflächen auf der linken Seite des Composer-Fensters) wechseln, dann in den PDF-Einstellungen anzeigen klicken und eine neue Seitenvorlage erstellen. Um eine einfache interaktive Figur zu erstellen, die in ein Manuskript aufgenommen werden soll, verwenden Sie keine Vorlage und exportieren Sie einfach PDF.
      HINWEIS: Verwenden Sie Adobe Acrobat Reader, um mit den 3D-PDFs zu interagieren (die Bedienbarkeit der Funktionen in der interaktiven 3D-PDF-Illustration kann je nach verfügbarer Version von Acrobat Reader variieren). Die meisten anderen Viewer sind nicht mit dem 3D-PDF-Format kompatibel, einschließlich Webbrowsern. Solche interaktiven 3D-PDF-Illustrationen können in Publikationen aufgenommen werden; Fragen Sie die Redakteure im Voraus nach dieser Möglichkeit.
4. 3D-Visualisierung und -Analyse mit Imaris
   HINWEIS: Diese Software ermöglicht eine umfassende Visualisierung, Analyse und Interpretation von 2D-4D-Mikroskopie-Datensätzen mit intuitiver Benutzeroberfläche und Workflows. Es gibt mehrere nützliche Online-Tutorials für die ersten Schritte mit dieser Software, die auf der Website (https://imaris.oxinst.com/tutorials) verfügbar sind. Um große Datensätze in Imaris (in der Regel solche, die größer als der GPU-Speicher sind) effektiver zu laden und mit ihnen zu interagieren, ist es ratsam, den Datensatz zuerst in "*.ims" zu konvertieren, indem Sie das Programm "ImarisFileConverter.exe" verwenden, das im Imaris-Installationsordner installiert ist. Der ImarisFileConverter kann viele Mikroskopie-Bildformate lesen, einschließlich OME- und "h5" -Dateien, wie sie von Fidschis BigDataViewer gespeichert wurden.
   1. 3D-Visualisierung
      1. Diese Software kann eine 3D-Visualisierung des Datensatzes mit dem Modus "3D-Ansicht" rendern und der Benutzer kann mehrere Anpassungen an der Anzeige des Datensatzes vornehmen [z. B. zwischen MIP (Maximum intensity Projection) oder Mischmodus (besseres Rendering mit Tiefenhinweisen und Schatten)].
      2. Orthogonale Ansichten" - Mit richtiger Embryopositionierung (Schritt 4.3; B. Abschnitt "Bilddatensatz-Vorverarbeitung") kann man die Registerkarte "Abschnitt" verwenden und durch den gesamten Embryo navigieren und optische Abschnitte aus den normalen Ebenen (quer, koronal und sagittal) sehen. Wenn Embryonen nicht richtig neu positioniert sind, ist es äußerst schwierig, ihre Anatomie mit orthogonalen Ebenen zu interpretieren (siehe Ergänzende Abbildung 3). Obwohl Imaris eine Funktion hat, die als "Referenzrahmen" bekannt ist, um dieses Problem bei der Analyse von 3D-Embryonen zu umgehen, ist es vorzuziehen, die Datensätze a priori neu zu positionieren.
   2. 3D-Analyse
      HINWEIS: Diese Software verfügt auch über mehrere Tools zur Analyse von Morphologie und Fluoreszenzintensitäten. Als Beispiel beschreiben wir hier einen einfachen Workflow zur Analyse von Schwankungen der Gewebefluoreszenzintensität im Laufe der Zeit mit dem Imaris "Spots" -Tool, bei dem der Benutzer manuell sphärische Regionen von Interesse (ROIs) im Embryo in 3D platziert und Imaris dann die Gewebefluoreszenz innerhalb dieser sphärischen ROIs messen kann.
      1. Laden Sie einen 3D- oder 4D-Datensatz in Imaris und fügen Sie im 3D-Ansichtsmodus einen neuen Punkt hinzu. Dann kann man bestimmte Punkte des Embryos auswählen (auch während mehrerer Zeitpunkte, wenn man einen 4D-Datensatz verwendet) und innerhalb dieser Punkte quantifizieren, zum Beispiel den Intensitätsmittelwert.
         HINWEIS: Diese Software ermöglicht auch das Aufzeichnen der Intensität im Laufe der Zeit. Dies ermöglicht es dem Benutzer, Fragen zu beantworten wie: "Wie verändert sich die Fluoreszenz in einem Somite im Laufe der Zeit?".
      2. Fügen Sie das Spotmodul hinzu, indem Sie auf die Schaltfläche Neuen Spot hinzufügen klicken oder 3D-Ansicht | auswählen Spots im Imaris-Menü. Wählen Sie Automatische Reaktion überspringen, manuell bearbeiten. Schalten Sie den Imaris-Zeigermodus von Navigieren auf Auswählen um (dies kann auch durch Drücken der ESC-Taste auf der Tastatur erfolgen).
      3. Wählen Sie im Eigenschaftenfenster " Spots " den spezifischen Kanal aus, an den der Spot angeschlossen werden soll (z. B. " Kanal 1"), und aktivieren Sie unter " Manuelle Nachverfolgung " die Optionen " Automatisch mit ausgewähltem Spot verbinden " und " Verzögerung vor automatischem Voranschreiten aktivieren ".
      4. Bewegen Sie den Mauszeiger in das Visualisierungsfenster und der Cursor sollte sich in eine hohle gelbe Drahtkugel verwandeln. Gehen Sie zu Zeitpunkt 1 und fügen Sie einen Punkt (= Kugel) hinzu, indem Sie in das Gewebe von Interesse klicken. Die Kugel ("Spot") wird nur hinzugefügt, wenn Sie bei gedrückter Umschalttaste klicken. Wiederholen Sie dies für alle gewünschten Zeitpunkte und stellen Sie sicher, dass Sie den gleichen Teil des Gewebes im Laufe der Zeit verfolgen.
      5. Wechseln Sie im Fenster Spots-Eigenschaften zur Registerkarte Statistiken , und wechseln Sie in der Statistik von Gesamt - zu Detailstatistik . Wählen Sie im ersten Pulldown Spezifische Werte und im zweiten Pulldown "Intensitätsmittelwert Ch=*...", wobei Ch* der Kanal ist, in dem die Messung durchgeführt wird. Eine Schaltfläche direkt neben dem "Klicken Sie hier, um das Zeitdiagrammfenster zu öffnen" befindet sich unten links im Eigenschaftenfenster "Spots". Wenn Sie auf diese Schaltfläche klicken, wird ein Diagramm mit der mittleren Fluoreszenzintensität innerhalb der "Flecken" geöffnet, die im Laufe der Zeit aufgezeichnet wurden. Diese Werte können auch zur weiteren Analyse in eine Tabelle exportiert werden.

Ergebnisse

Die repräsentativen Ergebnisse, die in diesem Artikel sowohl für die Live- als auch für die Immunfluoreszenzbildgebung gezeigt werden, wurden unter Verwendung eines Zwei-Photonen-Systems mit einem 20 × 1,0 NA-Wasserobjektiv, dem auf 960 nm abgestimmten Anregungslaser und GaAsP-Photodetektoren (wie in Dias et al. (2020) ⁴³ beschrieben. Die optische Projektionstomographie wurde mit einem speziell angefertigten OPenT-Scanner durchgeführt (wie in Gualda et al. (2013)²⁸ bes...

Diskussion

Axiale Dehnung und Segmentierung sind zwei der komplexesten und dynamischsten Prozesse, die während der embryonalen Entwicklung von Wirbeltieren auftreten. Die Verwendung von 3D- und 4D-Bildgebung mit Einzelzellverfolgung wird seit einiger Zeit angewendet, um diese Prozesse sowohl bei Zebrafischen als auch bei Hühnerembryonen zu untersuchen, für die Zugänglichkeit und Kulturbedingungen eine komplexe Bildgebung ermöglichen 19,44,45,46,47,48,49

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose low gelling temperature	Sigma	A9414	Used to mounting embryos (e.g. for OPT)
Amira software	Thermofisher	-	Commerial software tool
Anti-Brachyury (Goat polyclonal)	R and D Systems	AF2085 RRID:AB_2200235	For immunofluorescence
Anti-Sox2 (Rabbit monoclonal)	Abcam	ab92494 RRID:AB_10585428	For immunofluorescence
Anti-Tbx6 (Goat polyclonal)	R and D Systems	AF4744 RRID:AB_2200834	For immunofluorescence
Anti-Laminin111 (Rabbit polyclonal)	Sigma	L9393 RRID:AB_477163	For immunofluorescence
Anti-goat 488 (Donkey polyclonal)	Molecular Probes	A11055 RRID:AB_2534102	For immunofluorescence
Anti-rabbit 568 (Donkey polyclonal)	ThermoFisher   Scientific	A10042 RRID:AB_2534017	For immunofluorescence
Benzyl Alcohol (99+%)	(any)	-	Used to clear embryos (component of BABB)
Benzyl Benzoate (99+%)	(any)	-	Used to clear embryos (component of BABB)
Bovine serum albumin	Biowest	P6154	For immunofluorescence
Coverglass 20x20 mm #0	(any)	-	100um thick
Coverglass 20x20 mm #1	(any)	-	170um thick
Coverglass 20x60 mm #1.5	(any)	-	To use as “slides”
DAPI (4’,6-Diamidino-2- Phenylindole Dihydrochloride)	Life Technologies	D3571	For immunofluorescence
Drishti software	(open source)	-	Free software tool
EDTA	Sigma	ED2SS	For demineralization
Fiji/ImageJ software	(open source)	-	Free software tool
Glycine	NZYtech	MB01401	For immunofluorescence
Huygens software	Scientific Volume Imaging	-	Commerial software tool
HyClone defined fetal bovine serum	GE Healthcare	#HYCLSH30070.03	For live imaging
Hydrogen peroxide solution 30 %	Milipore	1085971000	For clearing
Imaris software	Bitplane / Oxford instruments	-	Commerial software tool
iSpacers	SunJin Lab	(varies)	Use as spacers for preparations
L-glutamine	Gibco	#25030–024	For live imaging medium
Low glucose DMEM	Gibco	11054020	For live imaging medium
M2 medium	Sigma	M7167	To dissect embryos
Methanol	VWR	VWRC20847.307	For dehydration and rehydration steps
Methyl salicylate	Sigma	M6752	Used to clear embryos
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	Used in solution to fix embryos
Penicillin-streptomycin	Sigma	#P0781	For live imaging medium
PBS (Phosphate-buffered saline solution)	Biowest	L0615-500	-
RapiClear	SunJin Laboratory	RapiClear 1.52	Used to clear embryos
Secure-Sea hybridization chambers	Sigma	C5474	Use as spacers for preparations
simLab software	SimLab soft	-	Commerial software tool
Slide, depression concave glass - 75x25 mm	(any)	-	To mount thick embryos.
Triton X-100	Sigma	T8787	For immunofluorescence