Etablierung eines Rattenmodells der oberen Sagittal-Sinus-Okklusion über eine Thread-Embolism-Methode

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein neuartiges Sprague-Dawley (SD) Rattenmodell der überlegenen sagittalen Sinus-Thrombose (SSS) mittels einer Thread-Embolisierungsmethode her, und die Stabilität und Zuverlässigkeit des Modells wurden überprüft.

Zusammenfassung

Die Mechanismen, die zum natürlichen Beginn der zerebralen venösen Sinusthrombose (CVST) beitragen, sind meist unbekannt, und eine Vielzahl von unkontrollierbaren Faktoren sind im Verlauf der Krankheit beteiligt, was zu großen Einschränkungen in der klinischen Forschung führt. Daher hat die Etablierung stabiler CVST-Tiermodelle, die eine Vielzahl unkontrollierbarer Störfaktoren standardisieren können, dazu beigetragen, Mängel in der klinischen Forschung zu umgehen. In den letzten Jahrzehnten wurden eine Vielzahl von CVST-Tiermodellen erstellt, aber die Ergebnisse, die auf diesen Modellen basieren, waren inkonsistent und unvollständig. Um die pathophysiologischen Mechanismen von CVST weiter zu erforschen, ist es daher notwendig, ein neuartiges und hochkompatibles Tiermodell zu erstellen, das einen wichtigen praktischen Wert und eine wissenschaftliche Bedeutung für die Diagnose und Behandlung von CVST hat. In der vorliegenden Studie wurde ein neuartiges Sprague-Dawley (SD) Rattenmodell der überlegenen sagittalen Sinus-Thrombose (SSS) mittels einer Thread-Embolisierungsmethode ermittelt und die Stabilität und Zuverlässigkeit des Modells überprüft. Zusätzlich haben wir Veränderungen des zerebralen venösen Blutflusses bei Ratten nach der Bildung von CVST bewertet. Zusammenstellt das SD-Ratten-SSS-Thrombose-Modell ein neuartiges CVST-Tiermodell dar, das leicht etabliert werden kann, Traumata minimiert, eine gute Stabilität liefert und eine genaue Steuerung des ischämischen Timings und Standorts ermöglicht.

Einleitung

Cerebral venous sinus thrombosis (CVST) ist eine seltene Erkrankung des zerebralen Venensystems, die nur 0,5-1,0% aller Schlaganfallursachen ausmacht, aber eine relativ hohe Vorkommensrate bei Kindern und jungen Erwachsenen^{hat 1}. Während der Autopsie, CVST wurde festgestellt, dass die Ursache für 10% der zerebrovaskulären Erkrankungen Todesfälle². Thrombose kann in jedem Teil des intrakraniellen venösen Systems auftreten. Der überlegene sagittale Sinus (SSS) ist einer der am häufigsten betroffenen Bereiche in CVST und kann mehrere Blutgefäße umfassen. Aufgrund von Stenose oder Okklusion der venösen Nebenhöhlen wird die intrakranielle venöse Rückkehr blockiert, die oft mit erhöhtem intrakraniellen Druck einhergeht³. Die klinischen Manifestationen von CVST sind komplex und variieren im Laufe der Zeit; Obwohl es an Spezifität der Symptome mangelt, sind die häufigsten Symptome Kopfschmerzen (77,2%), Anfälle (42,7%) und neurologische Defizite (39,9%). In schweren Fällen kann Koma und sogar Tod auftreten^4,5. In den letzten Jahren hat sich der Anteil der damit verbundenen Risikofaktoren aufgrund der allgemeinen Verbesserung der medizinischen und gesundheitlichen Standards und des Bewusstseins für die öffentliche Gesundheit verändert, der Anteil der Traumata und Infektionen ist zurückgegangen, und der Anteil der CVST, der durch Schwangerschaft, Puerperium, orale Kontrazeptiva und andere Gründe verursacht wird, hat sich schrittweise erhöht⁵.

Derzeit ist die Pathogenese von CVST noch nicht gut verstanden. Um CVST eingehend zu erforschen, ist weitere pathophysiologische Forschung erforderlich. Die meisten dieser Forschungsmethoden sind jedoch invasiv und daher schwer klinisch umzusetzen. Aufgrund vieler Einschränkungen der klinischen Forschung haben Tiermodelle unersetzliche Vorteile in der Grundlagen- und Translationsforschung.

Die Ursache von CVST ist komplex, da sein anfänglicher Beginn oft unerkannt ist und die Position der Thrombusbildung sehr variabel ist. Glücklicherweise können Tiermodelle eine bessere Kontrolle dieser Faktoren erreichen. In den letzten Jahrzehnten hat sich eine Vielzahl von CVST-Tiermodellen etabliert, und jedes Modell hat seine eigenen Nachteile. Nach verschiedenen Produktionsmethoden lassen sie sich grob in folgende Kategorien einteilen: das einfache SSS-Ligationsmodell^6,7; das SSS-Interne-Injektionsbeschleuniger-Modell⁸; das Eisenchlorid-induzierte SSS-Thrombosemodell⁹; das photochemisch-induzierte SSS-Thrombosemodell¹⁰; und die selbstgemachte Embolie-Okklusion SSS Modell¹¹. Die meisten dieser Modelle sind jedoch nicht in der Lage, invasive Schäden an der Großhirnrinde des Tieres zu umgehen und sind nicht in der Lage, die ischämische Zeit und den Ort genau zu kontrollieren. Bei einigen Modellen wird der Thrombus spontan wieder kanalisiert; in anderen Modellen wird die SSS dauerhaft ausgesperrt. Darüber hinaus können komplizierte Operationen und/oder schwere Verletzungen nachfolgende pathophysiologische Befunde in diesen Modellen beeinflussen.

In der vorliegenden Studie wurde ein Gewindestecker in die SSS von Sprague-Dawley (SD)-Ratten eingeführt, um erfolgreich ein CVST-Modell zu etablieren, das Schäden minimierte, eine präzise Steuerbarkeit ermöglichte und eine gute Stabilität lieferte. Zusätzlich wurden die Kleintier-Magnetresonanztomographie (MRT) und die Laser-Speckle-Blutfluss-Bildgebung kombiniert, um die Wirksamkeit des Modells zu überprüfen. Wir bewerteten Veränderungen des zerebralen Blutflusses vor und nach der Etablierung unseres Modells und bewerteten die Stabilität unseres Modells und legten damit die Grundlage für weitere Studien zur Erforschung des Vorkommens, der Entwicklung und der damit verbundenen pathophysiologischen Mechanismen von CVST.

Protokoll

Verfahren, an denen Tierkörper beteiligt sind, wurden von der Medizinischen Norm- und Ethikkommission der Medizinischen Universität Wenzhou genehmigt und entsprechen den chinesischen Rechtsvorschriften über die Verwendung und Pflege von Labortieren.

1. Vorbereitung des Gewindesteckers, der SD-Ratten und der Versuchsgeräte

1. Verwenden Sie ein Nylongewinde mit einem Durchmesser von 0,28 mm als Hauptkörper des Gewindesteckers.
   HINWEIS: Die Weichheit und Härte des Nylonfadens sollte moderat sein.
2. Bedecken Sie ein Ende des Nylonfadens mit Silikonmaterial. Die Länge des Silikonteils des Gewindesteckers beträgt ca. 1,2 cm, der Durchmesser ca. 1,2 mm. Das Kopfende ist verjüngt, und das Silikonteil ist zylindrisch. Reservieren Sie weitere 5-7 cm. Das Nylongewinde lässt sich leicht einklemmen und kann nach der Operation nach spezifischen Bedürfnissen geschnitten werden.
3. Verwenden Sie 75% Ethanol, um den Fadenstecker 3 min vor dem Betrieb einzuweichen und jedes Restethanol mit normaler Saline vor dem Einstecken zu spülen.
4. Wählen Sie 12 männliche SD-Ratten mit einem Gewicht zwischen 280 und 320 g aus und teilen Sie sie nach dem Zufallsprinzip in eine Scheingruppe und eine Versuchsgruppe (n = 6 pro Gruppe) auf. Nach einer Woche der Umweltanpassung, schnell die Ratten für 12 h und Wasser-entzug sie für 4 h vor der Operation.
5. Bereiten Sie die folgenden experimentellen Geräte vor, die für das Experiment benötigt werden: eine kleine Tieranästhesiemaschine, ein Stereotaxi-Instrument des Gehirns, ein Sezierendes Mikroskop, ein Hochgeschwindigkeits-Schädelbohrer, eine Schere, eine Pinzette, ein Nadelöhr, ein Nadelfaden, eine 2 ml Spritze, ein Laser-Speckle-Blutfluss-Bildgebungssystem und ein kleintierischer MRT-Scanner.

2. Bau des SD-Rat SSS-Embolisierungsmodells über Gewindeembolisierung

1. Legen Sie die SD-Ratte in eine Anästhesie-Induktionsbox und verwenden Sie eine kleintierische Anästhesiemaschine, um 4% Isofluran zu liefern, um Anästhesie zu induzieren. Danach verwenden Sie Zangen, um zu bestätigen, dass die Hinterbeine und Zehen der SD-Ratte nicht auf moderates Kneifen reagieren.
2. Beheben Sie schnell die SD-Ratte mit rasierten Oberhaaren in der anfälligen Position auf einem Stereotaxie-Gerät des Gehirns. Halten Sie die Anästhesie mit 1,5-2,0% Isofluran (bei einer Geschwindigkeit von 0,5 l/min) aufrecht und stabilisieren Sie die Atemfrequenz bei 40-60 Atemnot/min. Stabilisieren Sie die Körpertemperatur der Ratte über ein Heizkissen bei 37±0,2 °C.
   1. Tragen Sie steriles ophthalmologisches Augenschmiermittel auf, nachdem die Ratte auf den stereotaxic Rahmen gelegt wurde, um die Hornhaut während der Anästhesie vor dem Trocknen zu schützen.
3. Sterilisieren Sie die Oberfläche auf der Oberseite des Kopfes der Ratte mit 5% Povidon Jod abwechselnd dreimal mit 75% Ethanol. Machen Sie einen Hautschnitt (2,0 cm lang) in der Mitte des Kopfes, und dann vorsichtig schälen Sie die obere Faszien und Periost, um den Schädel vollständig freizulegen.
   1. Bestätigen Sie die Positionen der vorderen Fontanelle, der hinteren Fontanelle, der koronaren Naht, der sagittalen Naht und der Fischgrätnaht.
4. Verwenden Sie den Bereich zwischen der koronalen Naht und der Fischgrätnaht als Blutflussbeobachtungsbereich. Um zu verhindern, dass der Schädel die Beobachtung während der Laser-Speckle-Blutfluss-Bildgebung beeinflusst, dünnen Sie den Schädel im Beobachtungsbereich, bis die Blutgefäße deutlich sichtbar sind. Die Größe des ausgedünnten Schädels sollte ca. 1,0 cm × 1,0 cm betragen. Dieser Schritt und die folgenden Schritte werden alle unter einem Sezierendes Mikroskop durchgeführt.
   1. Verwenden Sie beim Schädelschleifen Normaltemperatur-Saline, um den Bohrer wiederholt zu spülen, um Hochtemperaturverbrennungen an der Großhirnrinde zu vermeiden.
5. Verwenden Sie einen Hochgeschwindigkeitsbohrer, um den Schädel innerhalb eines 6,0 mm x 4,0 mm Knochenfensters zu schleifen, das bei Bregma zentriert ist, um die SSS des Bregma-Bereichs freizulegen.
   1. Verwenden Sie normale Saline, um den Schädel während des Schleifens zu kühlen. Wenn der Schädel dünn wird, verwenden Sie eine Pinzette, um die restlichen Knochenstücke vorsichtig zu entfernen, um ein Reißen der SSS zu vermeiden.
6. Wählen Sie einen geeigneten Gewindestecker, verwenden Sie den SSS Bregma-Punkt als Steckpunkt, durchstechen Sie ihn vorsichtig mit einer 2 ml Spritzennadel und setzen Sie den Gewindesteckerkopf schnell in den Steckpunkt ein.
   1. Zu diesem Zeitpunkt sollte der Winkel zwischen dem Ende des Gewindesteckerkopfes und dem SSS etwa 30-45° betragen; Passen Sie dann den Winkel zwischen dem Ende des Gewindesteckers und dem SSS auf 0-10 Grad an, und legen Sie die SSS langsam in die Mitte ein, bis der Kopf den hinteren Rand des Sinuszusammenflusses erreicht. Danach schneiden Sie den überschüssigen Teil des Schwanzes ab.
      HINWEIS: Schnelle Blutungen können auftreten, wenn die SSS punktiert ist. Wenn das Ende des Gewindesteckers nicht gleichzeitig schnell in den Steckerpunkt eingesetzt werden kann, verwenden Sie eine kleine Gaze oder Eine Baumwollkugel, um den Steckerpunkt vorsichtig zu drücken, während Sie langsam nach unten gleiten, um den Steckerpunkt vorsichtig freizulegen, und legen Sie dann schnell das Ende der Drahtschraube in die SSS ein. Nachdem der Gewindestecker eingesetzt wurde, können hämostatische Materialien wie ein Gelatineschwamm verwendet werden, um die Blutung zu stoppen, wenn es am Steckpunkt blutungen.

3. Erkennung des Blutflusses auf der Gehirnoberfläche von SD-Ratten

1. Verwenden Sie eine Laserlichtquelle, um den Blutflussbeobachtungsbereich gleichmäßig zu beleuchten. Das reflektierte Licht wird von einer Kamera erfasst und zur Analyse an einen Computer übertragen. Verwenden Sie die folgenden Parametereinstellungen für das Laser-Speckle-Blutstrom-Bildgebungssystem: Wellenlänge: = 785 nm; und Bildbelichtungszeit: T = 10 ms.
2. Zentrieren Sie den SD-Ratten-Blutfluss-Beobachtungsbereich in das Sichtfeld des laser-speckle Blut-Flow-Bildgebungssystems und führen Sie eine kontinuierliche Überwachung des Blutflusses auf der Hirnoberfläche für 2 min durch. Sammeln und verarbeiten Sie die Blutflussdaten vor und nach der Embolisation für jede SD-Ratte und erhalten Sie die Laser-Speckle-Blutflusskarte des beobachteten Bereichs.
3. Spülen Sie den betätigten Bereich wiederholt mit normaler Saline ab, um Knochenreste und Rückstände wegzuwaschen. Nahn Die Haut (0-Faden) und desinfizieren Sie mit Iodophor.
4. Halten Sie die Körpertemperatur, bis die Ratte nach der Operation erwacht und dann in einem einzigen Käfig mit Nahrung und Wasser bereitgestellt ad libitum. Die Scheingruppe kann nicht geschlossen werden.
5. Führen Sie nach Abschluss der Datenerfassung die Nachbearbeitung durch.
   1. Vollständige Auswahl der Region von Interesse (ROI) über die Werkzeuge, die von der Laser-Speckle-Blutstrom-Bildgebungssystem-Software zur Verfügung gestellt werden. Die ermittelten Werte sind der durchschnittliche Blutflusswert im ROI und die lokalen Hirn-Blut-Flow-Werte vor und nach der Embolisation. Verwenden Sie den Blutflusswert vor der Embolisation als Basiswert.
   2. Wählen Sie vier ROIs aus, und messen Sie die relative Veränderung des zerebralen Blutflusses in jedem ROI, ausgedrückt als prozentuale Veränderung gegenüber dem Basiswert.

4. Nachweis der Fadenposition bei Kleintieren MRT

1. Verwenden Sie die folgenden T2-gewichteten Bildgebungsparameter (T₂WI) für das MRT-Bildgebungssystem: Echozeit (TE) = 33 ms, Wiederholungszeit (TR) = 3000 ms, Anregungszahl (NEX) = 4, Slices = 28, Scheibendicke = 0,8 mm, Matrixgröße = 256*256 mm², Drehwinkel = 80°, Sichtfeld (FOV) = 30*30 mm², Scanzeit = 6 min 24 s; Magnetresonanz-Angiographie(MRA)-Parameter wurden wie folgt eingestellt: TE = 4,4 ms, TR = 12 ms, NEX = 4, Scheiben = 80, Scheibendicke = 0,4 mm, Matrixgröße = 256*256 mm², Drehwinkel = 80°, FOV = 30*30 mm², Scanzeit = 16 min 23 sec 40 ms.
2. Fixieren Sie das Tier auf dem MRT-Scantisch, kalibrieren Sie die Gehirnposition durch Positionsscanning und führen Sie T₂WI- und MRA-Sequenzscans durch, nachdem Sie die Position bestätigt haben.
3. Verwenden Sie kontinuierliche Anästhesie über die Tieranästhesiemaschine während des Nachweises. Dann, euthanisieren Sie die SD-Ratten durch intraperitoneale Injektion von übermäßigem Pentobarbital.
4. Bildaufnahme und Nachbearbeitung: Verwenden Sie nach dem Sammeln der Bilddaten, um den Zustand des Gewindesteckers im SSS deutlicher zu beobachten, die Pseudo-Farbverbesserungsmethode, um das T₂WI-Bild des Rattenhirns anzuzeigen.

Ergebnisse

Um das SD-Ratten-SSS-Thrombosemodell über die Nahtmethode zu ermitteln, sollte die Naht im Voraus vorbereitet werden (Abbildung 1A), und die für das Experiment erforderliche Ausrüstung (Abbildung 1B) sollte vorbereitet werden. Aufgrund der heiklen Art der Operation muss die Vorbereitung des Modells unter einem Sezierendes Mikroskop abgeschlossen werden. Die wichtigsten Schritte sind in Abbildung 2dargestellt. Um die Beschreibung ...

Diskussion

In dieser Studie wurde eine neue Art von CVST-Modell erfolgreich durch das Einsetzen eines selbst gebauten Gewindesteckers in die SSS von SD-Ratten etabliert. Zusätzlich wurden Laser-Speckle-Blut-Flow-Bildgebung und kleintierische MRT kombiniert, um Veränderungen des Blutflusses auf der Gehirnoberfläche von SD-Ratten vor und nach der Embolisation zu überwachen, um ischämisches Timing und Standort zu standardisieren.

1989 fertigten Longa et al. ein reversibles MCA-Okklusionsmodell, indem s...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL syringe	Becton,Dickinson and Company	301940
brain stereotaxic instrument	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	68025
dissecting microscope	Wuhan SIM Opto-technology Co.	SIM BFI-HR PRO
high-speed skull drill	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	78046
laser-speckle blood-flow imaging system	Wuhan SIM Opto-technology Co.	SIM BFI-HR PRO
needle holder	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	F31022-12
needle thread	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	F33303-08
scissors	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	S13029-14
silica gel	Heraeus Kulzer	302785
small animal anesthesia machine	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	R540
small-animal MRI	Bruker Medical GmbH	Biospec 94/30 USR
tweezers	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	F11029-11
vascular forceps	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	F22003-09