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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieser Artikel stellt wesentliche Schritte der Immunfärbung und Chromatin-Immunpräzipitation vor. Diese Protokolle werden häufig verwendet, um DNA-schädigende zelluläre Prozesse zu untersuchen und die Rekrutierung von Proteinen, die an der DNA-Reparatur beteiligt sind, zu visualisieren und zu quantifizieren.

Zusammenfassung

Zellen sind kontinuierlich verschiedenen DNA-schädigenden Wirkstoffen ausgesetzt, die unterschiedliche zelluläre Reaktionen hervorrufen. Die Anwendung biochemischer und genetischer Ansätze ist unerlässlich, um zelluläre Ereignisse aufzudecken, die mit der Rekrutierung und Montage von DNA-Reparaturkomplexen an der Stelle von DNA-Schäden verbunden sind. In den letzten Jahren wurden mehrere leistungsfähige Werkzeuge entwickelt, um ortsspezifische DNA-Schäden zu induzieren. Darüber hinaus ermöglichen uns neuartige bahnbrechende Techniken, diese Prozesse auf der Ebene der Einzelzellauflösung sowohl mit festen als auch mit lebenden Zellen zu untersuchen. Obwohl diese Techniken zur Untersuchung verschiedener biologischer Prozesse eingesetzt wurden, stellen wir hier die am weitesten verbreiteten Protokolle auf dem Gebiet der DNA-Reparatur, des Fluoreszenzimmunfärbungs (IF) und der Chromatinimmunpräzipitation (ChIP) vor, die es in Kombination mit endonukleasebasierten ortsspezifischen DNA-Schäden ermöglichen, die genomische Belegung von DNA-Reparaturfaktoren gezielt und reguliert zu visualisieren und zu quantifizieren. beziehungsweise. Diese Techniken bieten den Forschern leistungsfähige Werkzeuge, um neuartige Proteine zu identifizieren, die an den beschädigten genomischen Locus gebunden sind, sowie ihre post-translationalen Modifikationen, die für ihre Feinabstimmung während der DNA-Reparatur erforderlich sind.

Einleitung

Unser Genom wird ständig durch verschiedene DNA-schädigende Wirkstoffe herausgefordert. Diese Angriffe können von Umweltquellen wie UV-Licht oder Bestrahlung sowie von endogenen Quellen wie metabolischen Nebenprodukten, die durch oxidativen Stress oder Replikationsfehler verursacht werden, stammen1,2. Diese Läsionen können die Integrität eines oder beider DNA-Stränge beeinträchtigen, und wenn die erzeugten Fehler persistent werden, führt dies häufig zu Translokationen und Genominstabilität, was zu Tumorgenese führen kann3,4. Um die Integrität des Genoms zu erhalten, wurden während der Evolution mehrere Reparatursysteme entwickelt. Entsprechend den chemischen und physikalischen Eigenschaften bestimmter Arten von DNA-Schäden können mehrere Reparaturmechanismen aktiviert werden. Mismatches, abasic stellen, Einzelstrangbrüche und 8-Oxoguanin (8-OxoG) können entweder durch Mismatch-Reparatur oder Base-Exzisions-Reparaturweg5,6entfernt werden. Läsionen, die durch UV-induzierte Photoprodukte und sperrige Addukte verursacht werden, können entweder durch Nukleotid-Exzisionsreparatur (NER) oder DNA-Doppelstrangbruchreparatur (DSBR) repariert werden7,8. NER besteht aus zwei Hauptsubwegen: transkriptionsgekoppeltes NER (TC-NER) und globales genomisches NER (GG-NER). In Bezug auf die Zellzyklusphase können nach der DNA-Doppelstrangbruchinduktion zwei Subwege aktiviert werden: nicht-homologe Endfügung (NHEJ) und homologe Rekombination (HR)1,9. NHEJ, der dominante Weg in ruhenden Zellen, kann in allen Zellzyklusphasen aktiviert werden und stellt einen schnelleren, aber fehleranfälligen Weg dar10. Auf der anderen Seite ist HR ein fehlerfreier Weg, bei dem die DSBs basierend auf der Sequenz-Homologie-Suche der Schwesterchromatiden repariert werden, daher ist es hauptsächlich in den S- und G2-Zellzyklusphasen11vorhanden. Darüber hinaus ist das mikrohomologievermittelte Endfügen (MMEJ) ein weiterer DSB-Reparaturmechanismus, der sich von den oben genannten unterscheidet und auf einer KU70/80- und RAD51-unabhängigen Art der Religatur von zuvor resezierten mikrohomologen Sequenzen basiert, die die gebrochenen DNA-Enden flankieren. Daher gilt MMEJ als fehleranfällig und sehr mutagen12. Während der DNA-Reparatur können DSBs die DNA-Schadensreaktion (DDR) induzieren, was zur Aktivierung von Checkpoint-Kinasen führt, die den Zellzyklus während der Reparatur stoppen13,14,15. Die DDR wird als Reaktion auf die Rekrutierung und extensive Verbreitung von Initiator-Schlüsselakteuren des Reparaturprozesses um die Läsionen aktiviert und trägt zur Bildung eines Reparaturfokus bei. In dieser frühen Signalkaskade spielt die ATM-Kinase (Ataxia Telangiectasia Mutated) eine zentrale Rolle, indem sie die Phosphorylierung der Histonvariante H2AX bei Ser139 (γH2AX genannt) um die Läsion16katalysiert. Dieses frühe Ereignis ist verantwortlich für die Rekrutierung zusätzlicher Reparaturfaktoren und die Initiierung nachgelagerter Reparaturprozesse. Obwohl die genaue Funktion der rekrutierten Proteine im Reparaturfokus noch nicht vollständig charakterisiert ist, wurden die Bildung und die Dynamik von Reparaturherden von mehreren Laboren untersucht. Diese Marker werden ausgiebig verwendet, um die Reparaturkinetik zu verfolgen, aber ihre genaue Rolle während des Reparaturprozesses bleibt schwer fassbar. Aufgrund der großen Bedeutung, aber des schlechten Verständnisses von DNA-Reparatur-bezogenen zellulären Prozessen wurden bisher mehrere Methoden entwickelt, um die DDR zu induzieren und zu visualisieren.

Verschiedene Methoden und Systeme wurden etabliert, um die gewünschte Art von DNA-Schäden zu induzieren. Zum Beispiel können einige Wirkstoffe [wie Neocarzinostatin (NCS), Phleomycin, Bleomycin, γ-Bestrahlung, UV] eine große Anzahl von zufälligen DNA-Brüchen an nicht prädiktiven genomischen Positionen induzieren, während andere (Endonukleasen wie AsiSI, I-PpoI oder I-SceI sowie Laser striping) DNA-Brüche an bekannten genomischen Loci17,18,19,20,21induzieren können . Hier konzentrieren wir uns auf die endonukleasebasierten Techniken, die derzeit zur Untersuchung der DDR in Säugetier- und Hefezellen verwendet werden. Abgesehen davon, dass wir die Prinzipien dieser Techniken hervorheben, betonen wir sowohl ihre Vor- als auch Nachteile.

Protokoll

1. Immundetektion spezifischer Proteine

  1. Vorbereitung der Zellkultur und des Versuchsaufbaus
    1. Halten Sie U2OS-Zellen in Monoschichten in DMEM-Kulturmedium, ergänzt mit 10% fetalem Kälberserum, 2 mM Glutamin und 1% antibiotisch-antimykotischer Lösung.
      HINWEIS: Verwenden Sie für die Induktion von DNA-Schäden auf Endonukleasebasis holzkohlebehandeltes oder steroidfreies Medium, um Systemleckagen zu vermeiden.
    2. Züchten Sie Zellen in einer befeuchteten 5% CO2 Umgebung bei 37 °C bis 80% Konfluenz, wobei das Medium alle 2-3 Tage erneuert wird.
    3. Saugen Sie das Medium an und waschen Sie die Zellen mit 1x PBS. Zellen mit Trypsin-EDTA-Lösung lösen. Wenn sich die Zellen lösen, stoppen Sie die Trypsinaktivität, indem Sie den Zellen Kulturmedium hinzufügen, wodurch eine Zellsuspension ergibt wird.
    4. Zählen Sie die Zellen mit einer Zellzählkammer. Platte 2 x 104 Zellen/ml/Vertiefung auf einer 24-Well-Platte, mit sterilen 12 mm runden Abdeckschichten in jeder Vertiefung.
    5. Inkubieren Sie die Zellen für 24 h bei 37 °C in einer befeuchteten 5% CO2-Atmosphäre, um die Befestigung an den Abdecklippen zu ermöglichen.
    6. Behandeln Sie die Zellen mit 10 ng/ ml Neocarzinostatin (NCS), indem Sie das schädigende Mittel direkt auf das kultivierte Medium pipettieren. Inkubieren Sie die Zellen 15 minuten lang mit dem NCS-haltigen Medium, waschen Sie sie dann mit 1x PBS und fügen Sie den Zellen frisches, ergänztes Kulturmedium hinzu. Andernfalls verwenden Sie ein geeignetes Mittel (d. h. 4-OHT), um DSBs über endonukleasebasierte Systeme zu induzieren, ohne das Medium22 aufzufrischen.
      HINWEIS: Alternativ können Sie Bestrahlung verwenden, um DNA-Schäden zu induzieren, die von 30 minuten bis zu 8 h Erholungszeit reichen, indem Sie den Neutronenfluss zwischen 2-20 Gy23verwenden.
    7. Inkubieren Sie die Zellen für 1-8 h bei 37 °C in einer befeuchteten 5% CO2-Atmosphäre, um der Kinetik der DNA-Reparatur zu folgen.
  2. Fixierung von Zellen
    HINWEIS: 300-500 μL Lösungen/Vertiefung sollten in den folgenden Schritten (Schritte 1.2-1.5) verwendet werden, um alle Zellen angemessen abzudecken. Jeder Inkubations- und Waschschritt (mit Ausnahme der Antikörperinkubation) sollte auf einem Orbitalschüttler mit sanftem Rühren durchgeführt werden.
    1. Nach DSB-Induktion und Inkubation der Zellen das Medium aus den angeschlossenen Zellen entfernen und die Zellen einmal mit 1x PBS waschen.
    2. Fixieren Sie Zellen mit 4% Formaldehyd-PBS-Lösung für 20 min bei 25 °C.
  3. Permeabilisierung von Zellen
    1. Entfernen Sie die Befestigungslösung und waschen Sie die Zellen dreimal mit 1x PBS für jeweils 5 min.
    2. Entfernen Sie das PBS und fügen Sie 0,2% Triton X-100 in PBS gelöst hinzu. Inkubieren Sie die Proben für 20 Min.
  4. Blockieren von unspezifischen Bindungsseiten
    1. Waschen Sie die Zellen dreimal mit 1x PBS.
    2. Blockieren Sie unspezifische Bindungsstellen mit 5% BSA (Bovine Serum Fraction V Albumin), verdünnt in PBST (1x PBS ergänzt mit 0,1% Tween-20), und inkubieren Sie die permeabilisierten Proben für mindestens 20 Minuten.
  5. Immunfluoreszenzfärbung
    1. Fügen Sie die richtige Menge an primärem Antikörper (d. H. Anti-γH2AX, Anti-DNA-PKcs) hinzu, der in 1% iger BSA-PBST-Lösung verdünnt ist. Legen Sie jeden Coverlip kopfüber auf einen Paraffinfilm über einem 10 μL-Tröpfchen des verdünnten Anti-γH2AX-Antikörpers.
      HINWEIS: Im Falle einer Co-Immunfärbung verdünnen Sie beide Antikörper angemessen in derselben 1% igen BSA-PBST-Lösung.
    2. Inkubieren Sie die Proben in einer Feuchtkammer für 1,5 h bei 4 °C.
      HINWEIS: Die Inkubation kann auch bei 4 °C über Nacht durchgeführt werden.
    3. Legen Sie die Abdecklappen wieder seitlich nach oben in die 24-Well-Platte und waschen Sie sie dreimal für 5 min mit 1x PBS.
    4. Fügen Sie die richtige Menge an sekundärem Antikörper hinzu, der in 1% BSA-PBST verdünnt ist. Legen Sie jeden Coverlip kopfüber auf einen Paraffinfilm über einem 10 μL-Tröpfchen des verdünnten Antikörpers.
    5. Inkubieren Sie die Proben in einer Feuchtigkeitskammer bei 4 °C für 1 h.
    6. Legen Sie die Abdecklappen wieder seitlich nach oben in die 24-Well-Platte und waschen Sie sie dreimal für 5 min mit 1x PBS.
    7. Bevor Sie die letzte PBS-Waschlösung entfernen, nehmen Sie die Abdeckfolien vorsichtig mit einer Pinzette und einer Nadel heraus und legen Sie sie dann kopfüber auf Glasobjektträger mit Tröpfchen Montagemedium (ergänzt mit DAPI).
      HINWEIS: Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen. Wenn das Montagemedium trocknet, wird empfohlen, die Kanten der Abdecklippen mit Nagellack zu versiegeln, um ein Schrumpfen der Proben zu verhindern.

2. Chromatin-Immunpräzipitation

  1. Zellsammlung, Vernetzung, Zell- und Kernlyse und DNA-Fragmentierung
    1. Für jede Probe ca. 5 x10 6 Zellen/ml in einer 150 mm Schüssel anprossen.
    2. Entfernen Sie das Kulturmedium und waschen Sie die Zellen zweimal mit eiskaltem 1x PBS.
    3. Fixieren Sie die Zellen mit 1% Formaldehyd-PBS-Lösung, legen Sie die Platten auf einen Orbitalschüttler und rühren Sie sie 20 Minuten lang vorsichtig.
      HINWEIS: Formaldehyd ist flüchtig; Bereiten Sie immer eine frische Arbeitslösung vor. In einigen Fällen enthält die Formaldehydlösung Methanol, um es zu stabilisieren, aber es ist besser, eine methanolfreie Lösung zu verwenden, um Interferenzen mit nachgeschalteten Reaktionen zu vermeiden.
    4. Stoppen Sie die Fixierung mit 125 mM Glycin und inkubieren Sie auf einem Orbitalschüttler mit sanftem Rühren für 5 min bei 25 °C.
    5. Legen Sie die Platten auf Eis und waschen Sie sie zweimal mit eiskaltem 1x PBS.
    6. Kratzen Sie die Zellen in eiskaltem 1x PBS und übertragen Sie sie in 15 mL konische Röhrchen.
    7. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 2.500 x g für 5 min bei 4 °C.
    8. Den Überstand vorsichtig absaugen und das Pellet in 2 mL Zelllysepuffer [5 mM PIPES pH 8,0, 85 mM KCl, 0,5% NP-40, 1x PIC (Protease-Inhibitor-Cocktail)] resuspendieren und 10 min auf Eis inkubieren.
    9. Zentrifuge die Zellsuspension bei 2.500 x g für 5 min bei 4 °C.
    10. Entsorgen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 500-1.500 μL Kernlysepuffer (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM EDTA pH 8,0, 0,8% SDS, 1x PIC) und inkubieren Sie auf Eis für 30-60 min. Das Lysat wird in ein konisches Polystyrolrohr überführen, das für die Beschallung geeignet ist.
      HINWEIS: Da der Kernlysepuffer SDS enthält, fällt er auf Eis aus und die Lösung wird weiß. Die Lösung sollte nach der Beschallung transparent werden.
    11. Beschallen Sie das Lysat, um DNA auf eine durchschnittliche Fragmentgröße von 300-1.000 bp zu scheren.
      HINWEIS: Die entsprechenden Beschallungszyklen und -bedingungen sollten entsprechend dem Zelltyp und der Beschallungsanlage eingestellt werden. Fragmente kleiner als 200 bp sind für ChIP nicht geeignet, da die Nukleosom-DNA-Interaktionen gestört werden können.
  2. Umkehrung der Vernetzung, Bestimmung von beschallten Fragmentgrößen
    1. Nehmen Sie 100 μL der beschallten Probe heraus, um die Fragmentgröße des beschallten Chromatins zu überprüfen. Das restliche Chromatin sollte bei −80 °C gelagert werden.
    2. Zu jeder 100 μL der Probe werden 0,5 mg/ml RNase A hinzugefügt und bei 37 °C für 20 min inkubiert, um die RNase zu aktivieren.
    3. Inkubieren Sie die Proben bei 65 °C über Nacht.
    4. Am nächsten Tag 500 μg/ml Proteinase K und 0,5% SDS hinzufügen und die Proben bei 50 °C für 3 h inkubieren.
    5. Jeder Probe werden 0,5 Volumen Phenol und 0,5 Volumen Chloroform-Isoamylalkohol -Mischung (24:1) zugeführt.
    6. Wirbel für 1 Min.
    7. Zentrifuge bei 13.000 x g für 10 min.
    8. Übertragen Sie die obere wässrige Phase in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen.
    9. Zu jeder Probe wird 1 Volumen Chloroform-Isoamyl-Alkohol-Mischung (24:1) hinzugefügt.
    10. Wirbel für 1 Min.
    11. Zentrifuge bei 13.000 x g für 10 min.
    12. Übertragen Sie die obere wässrige Phase in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen.
    13. Fügen Sie 2,5 Volumina von 96% Ethanol und 0,1 Volumen von 3 M Na-Acetat pH 5,2 hinzu.
    14. Mindestens 20 min bei −80 °C inkubieren.
    15. Zentrifuge die Proben bei 13.000 x g für 10 min bei 4 °C.
    16. Entfernen Sie das Ethanol und waschen Sie das Pellet mit 400 μL 70% Ethanol.
    17. Zentrifuge die Proben bei 13.000 x g für 10 min bei 4 °C.
    18. Ethanol entfernen und Pellet an der Luft trocknen.
    19. Das Pellet wird in 10 μL TE resuspendiert.
    20. Führen Sie die Proben mit einem 0,8% igen Agarosegel aus. Die beschallte Chromatingröße sollte etwa 500 bp betragen.
      HINWEIS: Verwenden Sie Bromphenolblau-freien Ladepuffer, da die Größe dieses Farbstoffs ungefähr 500 bp beträgt, was die ordnungsgemäße Erkennung von Chromatinfragmenten stören kann. Stattdessen wird empfohlen, einen Ladepuffer zu verwenden, der mit Xylol-Cyanol ergänzt wird, was etwa 3.000 bp entspricht.
    21. Wenn die Chromatingröße akzeptabel ist, verdünnen Sie die gefrorenen Chromatinproben aus Schritt 2.1. in 3 Volumina Verdünnungspuffer (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,5 mM EGTA pH 8,0, 1% Triton X-100, 140 mM NaCl, 1x PIC) und die Proben per Rotation für 10 min bei 4 °C mischen.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist notwendig, um das im Kernlysepuffer vorhandene SDS zu verdünnen, um Interferenzen mit nachgeschalteten Reaktionen, einschließlich der Messung der Chromatinkonzentration, zu vermeiden.
    22. Messen Sie die DNA-Konzentration der Chromatinproben bei 260/280 nm mit einem Spektralphotometer.
  3. Herstellung von Perlen, Pre-Clearing und Immunpräzipitation
    1. Bereiten Sie Perlen (Schaf-Anti-Kaninchen- oder Maus-IgG) für die Vorreinigungs- und Immunpräzipitationsschritte vor. Perlen zweimal für 10 min bei 4 °C mit RIPA-Puffer waschen (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA pH 8,0, 1% Triton X-100, 0,1% Na-DOC, 0,1% SDS, 150 mM NaCl und 1X PIC).
    2. Stellen Sie die Perlen im gleichen RIPA-Puffervolumen wie in Schritt 2.3.1 wieder ein.
    3. Vorklarieren Sie 25-30 μg Chromatin jeder Probe mit 4 μL der Perlen durch Rotation für 1-2 h bei 4 °C.
      HINWEIS: Fügen Sie jeder Chromatinprobe einen RIPA-Puffer mit bis zu 500 μL Endvolumen hinzu, damit sich die Proben unter Rotation richtig mischen können. Vergessen Sie nicht, Chromatin für NAC (No Antibody Control) und TIC (Total Input Control) bei jedem Probensatz herauszunehmen. TICs benötigen nur ein Endvolumen von bis zu 200 μL.
    4. Die Perlen mit einem Magneten ausfälzen und den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenrohr überführen.
    5. Fügen Sie jeder Chromatinprobe (außer NAC und TIC) die entsprechende Menge an Antikörper hinzu und drehen Sie sie über Nacht bei 4 °C.
    6. Am nächsten Tag 40 μL gewaschene Perlen zu jeder Probe (außer TIC) geben und sie über Nacht bei 4 °C rotieren.
  4. Waschen
    1. Einmal mit 300 μL Low Salt Puffer (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8,0, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 1x PIC) 10 min durch Rotation bei 4 °C waschen.
    2. Einmal mit 300 μL High Salt Puffer (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 300 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8,0, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 1x PIC) 10 min durch Rotation bei 4 °C waschen.
    3. Einmal mit 300 μL LiCl-Puffer (250 mM LiCl, 1% NP-40, 1% Na-DOC, 1 mM EDTA pH 8,0, 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1x PIC) für 10 min durch Rotation bei 4 °C waschen.
    4. Zweimal mit 300 μL TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA pH 8,0) 10 min durch Rotation waschen, für die erste Wäsche bei 4 °C und die zweite Wäsche bei 25 °C.
  5. Elution
    1. 200 μL des Elutionspuffers (1% SDS und 100 mM NaHCO3)in die Perlen geben und bei 65 °C in einem Thermoschüttler 15 min unter kontinuierlichem Schütteln (ca. 400 U/min) inkubieren. Den Überstand in ein neues Röhrchen geben und die Perlen in 200 μL Elutionspuffer erneut eluieren. Kombinieren Sie Eluate (400 μL Endvolumen).
    2. NaCl wird zu einer Endkonzentration von 200 mM in jeder Probe hinzugefügt. Ergänzen Sie die TIC-Proben mit 200 μL Elutionspuffer und fügen Sie auch NaCl hinzu.
      HINWEIS: Ab diesem Schritt sollte TIC unter den gleichen Bedingungen wie die anderen Proben gehandhabt werden.
    3. Inkubieren Sie die Proben bei 65 °C (ohne Schütteln) für mindestens 6 h.
    4. Fügen Sie jeder Probe 1 ml kaltes 100% Ethanol hinzu, drehen Sie die Röhrchen zweimal, um sie zu mischen, und fallen Sie die DNA über Nacht bei −80 °C aus.
    5. Am nächsten Tag Zentrifuge für 30 min bei 13.000 x g bei 4 °C.
    6. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet mit 70% EtOH.
    7. Zentrifuge die Proben bei 13.000 x g für 10 min bei 4 °C.
    8. Entsorgen Sie den Überstand und trocknen Sie die Pellets an der Luft.
    9. Die Pellets werden in 100 μL TE resuspendiert und jeder Probe 0,5 mg/ml RNase A zugefügigt. Bei 37 °C 20 min inkubieren, um die RNase zu aktivieren.
  6. Umkehrung der Vernetzung
    1. Fügen Sie 500 μg / ml Proteinase K und 0,5% SDS hinzu und inkubieren Sie die Proben dann bei 50 °C für 2 h.
      HINWEIS: Wenn Sie mit ChIP-seq fortfahren, vermeiden Sie die Phenol-Chloroform-Extraktion, da sie den nachgelagerten NGS-Prozess hemmt. Stattdessen wird empfohlen, ein handelsübliches Kit zu verwenden (siehe Materialtabelle).
    2. Jeder Probe werden 0,5 Volumen Phenol und 0,5 Volumen Chloroform-Isoamylalkohol-Mischung (24:1) zugeführt.
    3. Wirbel für 1 Min.
    4. Zentrifuge bei 13.000 x g für 10 min.
    5. Übertragen Sie die obere wässrige Phase in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen.
    6. Fügen Sie jeder Probe 1 Volumen Chloroform-Isoamyl-Alkoholmischung (24:1) hinzu.
    7. Wirbel für 1 Min.
    8. Zentrifuge bei 13.000 x g für 10 min.
    9. Übertragen Sie die obere wässrige Phase in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen.
  7. DNA-Extraktion
    1. Fügen Sie 2,5 Volumina von 96% Ethanol und 0,1 Volumen von 3 M Na-Acetat pH 5,2 hinzu.
    2. Mindestens 20 min bei −80 °C inkubieren.
    3. Zentrifuge die Proben bei 13.000 x g für 10 min bei 4 °C.
    4. Entfernen Sie das Ethanol und waschen Sie das Pellet mit 400 μL 70% Ethanol.
    5. Zentrifuge die Proben bei 13.000 x g für 10 min bei 4 °C.
    6. Ethanol entfernen und Pellet an der Luft trocknen.
    7. Das Pellet wird in 50 μL TE resuspendiert.

Ergebnisse

Die Untersuchung ortsgerichteter DSB-induzierter Reparaturprozesse in Zellen kann entweder durch stabile oder transiente Transfektion erreicht werden. Es ist jedoch zu beachten, dass eine stabile Transfektion eine homogene Zellpopulation gewährleistet, die eine einheitliche und damit zuverlässigere zelluläre Reaktion ergibt. Bei der transienten Transfektion nimmt nur ein kleiner Teil der Zellpopulation das Plasmid auf und erhält es, was Diversität in das Experiment einführt. Die Etablierung von ER-I-PpoI- oder ER-A...

Diskussion

Obwohl die DNA-Reparatur ein relativ neues Forschungsgebiet ist, erweitert sich unser Wissen mit Hilfe verschiedener biochemischer und mikroskopischer Methoden rasant. Die Erhaltung der genetischen Information ist für Zellen von entscheidender Bedeutung, da Mutationen, die in Genen auftreten, die an Reparaturprozessen beteiligt sind, zu den Hauptursachen für Tumorgenese gehören und daher die Aufklärung der wichtigsten Schritte von DNA-Reparaturwegen unerlässlich ist.

Biochemische Technike...

Offenlegungen

Nichts

Danksagungen

Diese Forschung wurde durch das National Research, Development and Innovation Office Grant GINOP-2.3.2-15-2016-00020, GINOP-2.3.2-15-2016-00036, GINOP-2.2.1-15-2017-00052, EFOP 3.6.3-VEKOP-16-2017-00009, NKFI-FK 132080, das János Bolyai Research Scholarship der Ungarischen Akademie der Wissenschaften BO/27/20, ÚNKP-20-5-SZTE-265, EMBO Short-Term Fellowship 8513 und die Tempus Foundation finanziert.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
4-OHTSigma AldrichH7904
AgaroseLonza50004
Antibiotic-Antimycotic Solution (100×), StabilizedSigma AldrichA5955
Anti-gamma H2A.X (phospho S139) antibodyAbcamab26350
Bovine Serum Fraction V albuminBioseraPM-T1725
TrackIt™ Cyan/Yellow Loading BufferThermo Fisher Scientific10482035
DMEM with 1.0 g/L Glucose, without L-GlutamineLonza12-707F
DoxycyclineSigma AldrichD9891
Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Mouse IgGInvitrogen11202D
Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Rabbit IgGInvitrogen11204D
EDTASigma AldrichE6758
EGTASigma AldrichE3889
EthanolMolar Chemicals02910-101-340
Fetal Bovine Serum (South America Origin), EU-approvedGibcoECS0180L
Formaldehyde 37% solution free from acidSigma Aldrich1.03999
GlutaMAX™ SupplementThermo Fisher Scientific35050038
GlycineSigma Aldrich50046
IPure kit v2DiagenodeC03010015
Isoamyl alcoholSigma AldrichW205702
LiClSigma AldrichL9650
NaClSigma AldrichS5886
Na-DOCSigma AldrichD6750
NaHCO3Sigma AldrichS5761
Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticusSigma AldrichN9162
NP-40Sigma AldrichI8896
PBS Powder without Ca2+, Mg2+Sigma AldrichL182-50-BC
PhenolSigma AldrichP4557
PIPESSigma AldrichP1851
Polysorbate 20 (Tween 20)Molar Chemicals09400-203-190
KClSigma AldrichP5405
ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPIThermo Fisher ScientificP36935
Protease Inhibitor Cocktail Set IRoche11873580001
Proteinase KSigma AldrichP2308
P-S2056 DNAPKcs antibodyAbcamab18192
RNase ARoche10109169001
CH3COONaSigma AldrichS2889
SDSSigma AldrichL3771
Tris Acetate-EDTA bufferSigma AldrichT6025
Tris-HClSigma Aldrich91228
TRITON X-100Molar Chemicals09370-006-340
Trypsin from porcine pancreasSigma AldrichT4799
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol redGibco15400054

Referenzen

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  2. Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Emerging Roles of Post-Translational Modifications in Nucleotide Excision Repair. Cells. 9 (6), (2020).
  3. Stephens, P. J., et al. The landscape of cancer genes and mutational processes in breast cancer. Nature. 486 (7403), 400-404 (2012).
  4. Turnbull, C., et al. Gene-gene interactions in breast cancer susceptibility. Human Molecular Genetics. 21 (4), 958-962 (2012).
  5. Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. 8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18877-18882 (2008).
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