Doxycyclin-belastetes Kollagen-Chitosan-Verbundgerüst zur beschleunigten Heilung diabetischer Wunden

Zusammenfassung

Das präparierte DOX-CL-Gerüst erfüllte die Voraussetzungen für einen idealen DW-Verband in mechanischer Festigkeit, Porosität, Wasseraufnahme, Abbaurate, Verzögertfreisetzung, antibakterieller, Biokompatibilität und entzündungshemmender Eigenschaften, die als wesentlich für die Wiederherstellung von geschädigtem Gewebe in DWs angesehen werden.

Zusammenfassung

Eine Hauptkomplikation des Diabetes mellitus sind diabetische Wunden (DW). Die verlängerte Entzündungsphase bei Diabetes behindert die weiteren Stadien einer Verletzung, was zu einer verzögerten Wundheilung führt. Wir haben Doxycyclin (DOX) aufgrund seiner antibakteriellen Eigenschaften und seiner berichteten entzündungshemmenden Eigenschaften als potenzielles Medikament der Wahl ausgewählt. Die aktuelle Studie zielt darauf ab, DOX-belastete Kollagen-Chitosan-nicht-vernetzte (NCL) & vernetzte (CL) Gerüste zu formulieren und ihre Heilungsfähigkeit bei diabetischen Erkrankungen zu bewerten. Das Charakterisierungsergebnis von Gerüsten zeigt, dass das DOX-CL-Gerüst im Vergleich zum DOX-NCL-Gerüst eine ideale Porosität, eine geringe Quell- und Abbaurate und eine anhaltende Freisetzung von DOX aufwies. Die In-vitro-Studien zeigen, dass das DOX-CL-Gerüst biokompatibel war und das Zellwachstum im Vergleich zu CL-Gerüst-behandelten und Kontrollgruppen verbesserte. Die antibakteriellen Studien haben gezeigt, dass das DOX-CL-Gerüst gegen die häufigsten Bakterien in DW wirksamer war als das CL-Gerüst. Unter Verwendung des Streptozotocin- und fettreichen diätinduzierten DW-Modells wurde eine signifikant (p≤0,05) schnellere Wundkontraktionsrate in der DOX-CL-Gerüst-behandelten Gruppe im Vergleich zu denen in CL-Gerüst-behandelten und Kontrollgruppen beobachtet. Der Einsatz des DOX-CL-Gerüsts kann sich als vielversprechender Ansatz für die lokale Behandlung von DWs erweisen.

Einleitung

Diabetes mellitus (DM) ist ein Zustand, bei dem das Versagen des Körpers, Insulin zu liefern oder auf seine Ergebnisse bei abnormaler Verdauung von einfachen Zuckern zu reagieren, zu einem Anstieg des Blutzuckers ^{führt 1}. Die folgenreichste und erdrückendste Verwicklung von DM ist die diabetische Wunde (DW). Rund 25% der Patienten mit DM haben die Möglichkeit, im Laufe ihres Lebens eine DW aufzubauen ¹. Die behinderte Heilung von DW ist auf eine Triopathie der DM anzuführen: Immunpathie, Vaskulopathie und Neuropathie. Wenn DW unbehandelt bleibt, kann es zu einer Gangränentwicklung kommen, was zur Entfernung des betroffenen Organs ^{führt 2}.

Viele Behandlungen, wie die Unterweisung der Patienten (Wund täglich untersuchen, die Wunde reinigen, Aktivitäten vermeiden, die Druck auf die Wunde erzeugen, regelmäßige Glukoseüberwachung usw.), Kontrolle ihres Blutzuckers, Wunddebridement, Druckabladung, medizinisches Verfahren, hyperbare Sauerstofftherapie und neuartige Therapien sind in der Praxis ^3,4. Die Mehrheit dieser Medikamente erfüllt nicht alle Voraussetzungen, die für die DW-Versorgung angesichts der multifaktoriellen pathophysiologischen Zustände und unerwarteten Kosten im Zusammenhang mit diesen Arzneimitteln unerlässlich sind ⁵. Obwohl die DW-Pathogenese multifaktoriell ist, wird die anhaltende Entzündung mit ungeeignetem Gewebemanagement als der eigentliche Grund für die verzögerte Heilung in DWs ^5,6angegeben.

Erhöhte Spiegel von Entzündungs- und Entzündungsmediatoren bei DW führen zu verminderten Wachstumsfaktoren, die für eine verzögerte Wundheilung verantwortlich sind ^2,6. Eine unsachgemäße bildung extrazelluläre Matrix (ECM) in DWs ist auf erhöhte Konzentrationen von Matrixmetalloproteinasen (MMPs) zurückzuführen, die für den schnellen Abbau von gebildetem ECM verantwortlich sind. Bei MMPs wird MMP-9 als hauptvermittler gemeldet, der für anhaltende Entzündungen und schnellen ECM-Abbau verantwortlich ist ⁷. Es wird festgestellt, dass die lokale Behandlung mit einem entzündungshemmenden Medikament, das die erhöhten MMP-9-Spiegel senkt, die kutane Homöostase, die Rahmenanordnung und eine bessere Heilung von DWs ^8,9wieder herstellt.

Doxycyclin (DOX), ein MMP-9-Inhibitor, wurde ausgewählt, um die erhöhten Spiegel von MMP-9 zu unterdrücken, einem wichtigen Entzündungsmediator, der für anhaltende Entzündungen in DWs ^10,11,12verantwortlich ist . Darüber hinaus besitzt DOX Antioxidans (produzieren freie Hydroxy- und Phenoxyradikale, die in der Lage sind, sich mit reaktiven Sauerstoffspezies zu binden) ¹³ und antiapoptotische (hemmen die Caspaseexpression und mitochondriale ^{Stabilisierung) 14} Aktivitäten, die für die Behandlung von DW unerlässlich sind. Die Anordnung von Gerüsten, die DOX, Kollagen (COL) und Chitosan (CS) enthalten, wurde gewählt. Die Wahl von COL hängt davon ab, wie es hilft, den notwendigen Rahmen für mechanische Festigkeit und Geweberegeneration bereitzustellen ¹⁵. Auf der anderen Seite ist CS strukturell homolog zu Glykosaminoglykan, verbunden mit mehreren Wundheilungsphasen. Es wird auch berichtet, dass CS eine signifikante antibakterielle Eigenschaft ^{besitzt 15}. Daher ist das COL / CS-Gerüst von DOX formuliert, um die anhaltende Entzündung zu unterdrücken, gefolgt von der Unterstützung der Matrixbildung für eine erfolgreiche Wundheilung bei DM-Zuständen.

Protokoll

Alle durchgeführten Tierverfahren wurden vom institutionellen Tierethischen Komitee des JSS College of Pharmacy, Ooty, Indien, genehmigt.

1. Herstellung von DOX-beladenen porösen Gerüsten durch Gefriertrocknungsverfahren

1. Fügen Sie 1,2 g COL zu 100 ml Wasser (z. B. Millipore) hinzu und halten Sie es zum Anschwellen beiseite.
2. Rühren Sie die geschwollene COL-Dispersion über Nacht bei 2000 U / min um, um eine vollständige Auflösung von COL zu gewährleisten.
3. Cs-Lösung vorbereiten, indem etwa 0,8 g CS in 100 ml 1% Essigsäure gelöst werden.
4. Rühren Sie die CS-Lösung über Nacht bei 2000 U / min, um eine gleichmäßige Dispersion zu gewährleisten.
5. DOX (1% w/v), gefolgt von CS-Lösung, mit der COL-Lösung mischen und 30 min umrühren.
6. Filtern Sie die erhaltene physikalische Mischung mit einem Musselintuch, um den Feinstaub zu entfernen.
7. Das erhaltene Filtrat wird bei -85 °C ± 4 °C für ca. 24 h tiefgefroren.
8. Lyophilisieren Sie das Tiefkühlgemisch bei -85 °C ± 4 °C für 72 h.
9. Lagern Sie die erhaltenen Gerüste in einem Trockenmittel zur weiteren Analyse ^16,17.

2. Vernetzung des Gerüsts

1. MES (0,488 g) in 50 ml Wasser auflösen.
2. 50 mg des DOX-beladenen Gerüsts in 20 ml MES-Puffer für 30 min einweichen.
3. Mischen Sie 19,5 ml MES-Puffer mit 0,1264 g EDC und 0,014 g NHS in einem separaten Becherglas.
4. Tauchen Sie das Gerüst für 4 h in das Puffergemisch, um eine Vernetzung von ¹⁶zu erreichen.
5. Speichern Sie die DOX-geladenen vernetzten (CL) und nicht vernetzten Gerüste (NCL) zur weiteren Auswertung.

3. Charakterisierung von Gerüsten

1. Morphologische Untersuchung mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM)
   1. Charakterisieren Sie die Gerüste für die morphologische Analyse mit SEM (1 cm × 1 cm × 0,5 cm).
   2. Beflecken Sie den Querschnitt und die Außenfläche des Gerüsts mit der zarten Goldschicht (~150 Å).
   3. Erfassen Sie das fotografische Bild bei der Anregungsspannung von 5 kV und 10 kV.
   4. Legen Sie die Proben in Aluminiumstubs und umschließen Sie sie mit dem Gold bei ca. 9 V.
   5. Messen Sie das Gerüst mit SEM mit der erhöhten Auflösung bei 10 kV.
2. Porositätsbestimmung
   1. Messen Sie die Porosität der Gerüste mit der Flüssigkeitsverdrängungsmethode (Ethanol) ¹⁸.
   2. Berechnen Sie die Porosität der Gerüste mit den folgenden Formeln.
      
      W_w = Nassgewicht des Gerüsts
      W_d = Trockengewicht des Gerüsts
      W_v = Volumen des Gerüsts
3. Bestimmung der Wasseraufnahmekapazität
   1. Messen Sie das Trockengewicht des Gerüsts.
   2. Inkubieren Sie das gewogene Gerüst bei 37 °C für 24 h in Phosphatpuffersalzlösung (PBS) pH 7,4.
   3. Entfernen Sie das überschüssige PBS über dem Gerüst mit Filterpapier.
   4. Messen Sie die Wasseraufnahmekapazität mit den folgenden Formeln ¹⁷.
      
      W_S = Prozentsatz der Wasseraufnahme
      W₁=Nassgewicht des Gerüsts
      W₀= Trockengewicht des Gerüsts
4. Gerüstabbau
   1. Inkubieren Sie das Gerüst (1 cm x 1 cm) bei 37 °C für 7 Tage in einem PBS von pH 7,4 mit Lysozymen.
   2. Waschen Sie das Gerüst, um anhaftende Ionen auf der Oberfläche zu entfernen.
   3. Gefriertrocknung des gewaschenen Gerüsts ¹⁷.
   4. Berechnen Sie die Abbaurate mithilfe von Formeln.
      
      Ww = Anfangsgewicht des Gerüsts
      Wd = Gewicht des Gerüsts nach der Gefriertrocknung
5. In-vitro-Freisetzungsstudien
   1. Bestimmen Sie das Freisetzungsverhalten des DOX vom Gerüst mit der Dialysesackmethode.
   2. Verteilen Sie das Gerüst in einigen Millilitern simulierter Wundflüssigkeit (pH 7,4) und geben Sie es in einen Dialysebeutel.
   3. Schließen Sie die Enden des Membranbeutels fest und tauchen Sie in die 500 ml simulierte Wundflüssigkeitslösung ein.
   4. Rühren Sie die Wundflüssigkeitslösung, die den Dialysebeutel enthält, bei 200-250 U / min.
   5. Sammeln Sie die Überstandslösung und ersetzen Sie sie in bestimmten Zeitintervallen durch eine gleiche Menge frischer Pufferlösung.
   6. Bestimmen Sie den Prozentsatz der DOX-Freisetzung von den Gerüsten in der Überstandslösung mit einem UV-sichtbaren Spektrometer bei 240 nm.

4. In-vitro-Antibakterielle Studien

1. Bestimmen Sie die minimale inhibitorische Konzentration (MIC) der CL- und DOX-CL-Gerüste gegen die Scaffolds S. aureus, S. epidermis, E. coli, P. aeruginosa mit der Mikrobrühe-Verdünnungsmethode.
2. Bereiten Sie die Bakterienkulturen mit Mueller-Hinton-Brühe im Verhältnis 1:1000 vor, um eine Trübung von 0,5 McFarland zu erhalten.
3. D-Glucose (800 mg/ dL) in die Bakterienkulturen zur Hyperglykation ^{19,20 geben.}
4. CL und DOX-CL in DMSO (Negativkontrolle) zerhacken und lösen.
5. Die hyperglykierte Bakteriensuspension (100 μL) und die Testproben (100 μL Gerüstlösung) in 96 Wellplatten werden seriell verdünnt.
6. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 20-24 h.
7. Zeichnen Sie die Absorption bei einer Wellenlänge von 600 nm ²¹auf.

5. In-vitro-Biokompatibilitätsstudien

1. Bewerten Sie die Biokompatibilität der präparierten Gerüste mit MTT [(3-(4,5 Dimethylthiazol-2 yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid)]-Assay.
2. Sterilisieren Sie die Gerüste in Standardmaß und legen Sie sie in 24 Brunnenplatten.
3. 3T3-L1-Zellen auf die 24-Well-Platte geben und für 72 h inkubieren.

6. In-vivo-Tierversuche

1. Induktion von DM und Exzisionswunde
   1. Füttern Sie das Tier zwei Wochen lang mit einer fettreichen Diät und verabreichen Sie Wistar albino-Ratten (180-200 g) intraperitoneal eine Einzeldosis Streptozotocin (STZ) (50 mg/kg Körpergewicht) in Citratpufferlösung zur Induktion von Typ-2-Diabetes.
   2. Wählen Sie die Tiere mit einem konstanten Blutzucker von 250 mg / dl für die Studie.
   3. Randomisieren Sie die ausgewählten Tiere für die Induktion von Exzisionswunden.
   4. Betäuben Sie die diabetischen Ratten mit Diethylether (5 ml wurden in die zuvor gesättigte Anästhesiekammer gegeben) und bestätigen Sie mit der Zehenquetschmethode und der Schleimhautfarbe.
   5. Rasieren Sie den dorsalen Bereich (dorsaler Thorax, Lendenbereich) mit einem aseptischen Trimmer und Klingen (A40).
   6. Sterilisieren Sie den rasierten Bereich mit einem alkoholischen Tupfer.
   7. Schneiden Sie die Haut (2 x 2 cm² und eine Tiefe von 1 mm) mit einer aseptischen chirurgischen A40-Klinge auf dem rasierten Bereich heraus, um eine offene Wunde zu erzeugen.
   8. Teilen Sie die Tiere in drei Gruppen ein (Gruppe 1 - Krankheitskontrolle (Kontrolle), Gruppe 2 - CL-Gerüst (Placebo), Gruppe 3 - DOX CL-Gerüst), jede Gruppe bestehend aus 6 Ratten.
   9. Befestigen Sie die CL- und DOX CL-Gerüste mit chirurgischem Klebeband und bedecken Sie die Kontrollgruppe 21 Tage lang mit steriler Gaze.
   10. Verfolgen Sie den Wundbereich auf einem sterilen OHP-Blatt und messen Sie die prozentuale Reduktion der Wunde mit der Gittermethode an den Tagen 0, 7, 14 und 21 für alle Gruppen.
   11. Berechnen Sie die prozentuale Wundreduktion mit den folgenden Formeln.
       

7. Histopathologische Untersuchungen

1. Isolieren Sie den verheilten Wundbereich an den Tagen 7, 14 und 21, lagern Sie ihn in Formalinlösung (10%).
2. Teilen Sie die Gewebe mit einem Mikrotom, um eine Dicke von 6 μm zu erhalten.
3. Montieren Sie die Abschnitte auf einem Glasobjektträger und beflecken Sie sie mit Hämatoxylin und Eosin ¹⁷.
4. Nehmen Sie die Bilder unter 40-facher Vergrößerung mit einem digitalen Mikroskop auf.

8. Hydroxyprolin-Schätzung

1. Isolieren Sie den verheilten Wundbereich an den Tagen 0, 7, 14 und 21 zur Beurteilung.
2. Schätzung des Hydroxyprolingehalts nach dem von Reddy G et al., 1996 ²²beschriebenen Verfahren.

9. Elisa-Test

1. Schätzen Sie die MMP-9-Werte mit dem Elisa-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
2. Isolieren Sie die Gewebeproben am 21. Tag aus dem verheilten Wundbereich und hacken Sie mit einem Gewebehomogenisator.
3. Zentrifugieren Sie das erhaltene Homogenat und sammeln Sie den Überstand.
4. Verdünnen Sie den Überstand mit einem Assay-Puffer um das 100-fache.
5. Scannen Sie die Platte mit einem Lesegerät mit mehreren Platten.

10. Statistische Auswertung

1. Stellen Sie die erhaltenen Ergebnisse als Mittelwert ± SD dar.
2. Führen Sie die statistische Analyse mit Graph pad prism v5.01 durch.
3. Erreichen Sie die statistische Signifikanz mithilfe der Einwegvarianzanalyse (ANOVA) und des Post-hoc-Tests von Dunnet.
4. Betrachten Sie die Werte mit p≤0,05 als signifikant.

Ergebnisse

Charakterisierung des DOX-belasteten NCL- und CL-Gerüsts
Bei der visuellen Untersuchung wurde festgestellt, dass das NCL- und CL-Gerüst cremefarben war. Außerdem scheinen beide Gerüste wie ein Schwamm zu sein, steif und unelastisch, wenn sie körperlich untersucht werden. REM-Bilder der NCL- und CL-Gerüste sind in Abbildung 1 dargestellt. Aus der Abbildung wurde deutlich, dass die Porengröße nach der Vernetzung durch die Bildung intermolekularer Verbindungen abgeno...

Diskussion

Das Hauptziel dieser Studie war es, die Wirkung von DOX-geladenen COL-CS-Gerüsten auf die DW-Heilung bei Ratten zu bestimmen. CL und NCL wurden in Bezug auf Morphologie, Quellindex, In-vitro-Freisetzungskinetik und Biokompatibilität hergestellt und bewertet.

Charakterisierung des DOX-belasteten NCL- und CL-Gerüsts
Die vorbereiteten Gerüste erwiesen sich als porös mit miteinander verbundenen Poren. Diese miteinander verbundenen Poren gewährleisten die poröse, schwammi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-ethyl-(3-3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC)	Merck Millipore, Mumbai, India	E7750
2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid (MES)	Merck Millipore, Mumbai, India	137074
3-(4, 5 dimethyl thiazole-2 yl) -2, 5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT)	Thermo Fisher, Mumbai, India	M6494
Deep freezer verticle	Labline Instruments, Kochi, India
Dialysis sack	Merck Millipore, Mumbai, India	D6191-Avg. flat width 25 mm (1.0 in.), MWCO 12,000 Da
Doxycycline	Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India	D9891
Elisa kit	R&D Systems	RMP900
Escherichia coli (E. coli)	National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India	NCIM 2567
Ethanol	Merck Millipore, Mumbai, India	100983
Lyophilizer-SZ042	Sub-Zero lab instruments, Chennai, India
Mechanical Stirrer-RQ-122/D	Remi laboratory instruments, Mumbai, India
Medium molecular weight Chitosan	Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India	18824
Microtome-RM2135	Leica, U.K
Mouse embryonic fibroblast cells (3T3-L1)	National Centre for Cell Sciences, Pune, India
Multiple plate reader -Inifinte M200 Pro	Tecan Instruments, Switzerland
N-hydroxy succinimide (NHS)	Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India	130672
Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa)	National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India	NCIM 2036
Scanning Electron Microscopy (SEM)-S-4800	Hitachi, India
Sodium hydroxide (NaOH) pellets	Qualigen fine chemicals, Mumbai, India	Q27815
Staphylococcus aureus (S. aureus)	National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India	NCIM 5022
Staphylococcus epidermis (S. epidermis)	National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India	NCIM 5270
Streptozotocin (STZ)	Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India	14653
Type-1 rat Collagen	Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India	C7661
Ultraviolet–visible spectroscopy-1700	Shimadzu