Analyse des zerebralen Vasospasmus in einem murinen Modell der Subarachnoidalblutung mit hochfrequenten transkraniellen Duplex-Ultraschall

Zusammenfassung

Ziel dieses Manuskripts ist es, eine sonographiebasierte Methode vorzustellen, die eine in vivo Abbildung des Blutflusses in Hirnarterien bei Mäusen ermöglicht. Wir demonstrieren seine Anwendung zur Bestimmung von Veränderungen der Blutflussgeschwindigkeiten im Zusammenhang mit Vasospasmus in murinen Modellen von Subarachnoidalblutungen (SAH).

Zusammenfassung

Zerebraler Vasospasmus, der in den Wochen nach der Subarachnoidalblutung auftritt, eine Art hämorrhagischer Schlaganfall, trägt zu einer verzögerten zerebralen Ischämie bei. Ein Problem, das in experimentellen Studien mit murinen Modellen von SAH aufgetreten ist, ist, dass Methoden zur In-vivo-Überwachung des zerebralen Vasospasmus bei Mäusen fehlen. Hier demonstrieren wir die Anwendung von Hochfrequenz-Ultraschall zur Durchführung transkraniler Duplex-Sonographieuntersuchungen an Mäusen. Mit der Methode konnten die arteria carotis interna (ICA) identifiziert werden. Die Blutflussgeschwindigkeiten in den intrakraniellen ICAs wurden nach Induktion von SAH signifikant beschleunigt, während die Blutflussgeschwindigkeiten in den extrakraniellen ICAs niedrig blieben, was auf einen zerebralen Vasospasmus hindeutet. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die hier demonstrierte Methode eine funktionelle, nichtinvasive In-vivo-Überwachung des zerebralen Vasospasmus in einem murinen SAH-Modell ermöglicht.

Einleitung

Spontane Subarachnoidalblutung (SAH) ist eine Form des hämorrhagischen Schlaganfalls, die hauptsächlich durch den Bruch eines intrakraniellen Aneurysms verursacht wird¹. Das neurologische Ergebnis wird hauptsächlich von zwei Faktoren beeinflusst: frühe Hirnverletzung (EBI), die durch die Auswirkungen der Blutung und der damit verbundenen vorübergehenden globalen zerebralen Ischämie verursacht wird, und verzögerte zerebrale Ischämie (DCI), die in den Wochen nach der Blutung auftritt^2,3. Es wurde berichtet, dass DCI bis zu 30% der SAH-Patienten betraf². Die Pathophysiologie von DCI beinhaltet angiographische zerebrale Vasospasmus, eine gestörte Mikrozirkulation, die durch Mikrovasospasmen und Mikrothrombosen verursacht wird, kortikale Ausbreitungsdepressionen und Effekte, die durch Entzündungen ausgelöst werden⁴. Leider bleibt die genaue Pathophysiologie unklar und es gibt keine Behandlung, die DCI³wirksam verhindert. Daher wird DCI in vielen klinischen und experimentellen Studien untersucht.

Heutzutage verwenden die meisten experimentellen Studien über SAH Kleintiermodelle, insbesondere bei Mäusen^{5,6,7,8,9,10,11,12,13}. In solchen Studien wird häufig der zerebrale Vasospasmus als Endpunkt untersucht. Es ist üblich, den Grad des Vasospasmus ex vivo zu bestimmen. Denn es fehlen nichtinvasive Methoden zur In-vivo-Untersuchung des zerebralen Vasospasmus, die eine kurze Anästhesiezeit erfordern und den Tieren nur wenig Stress auferlegen. Eine Untersuchung des zerebralen Vasospasmus in vivo wäre jedoch von Vorteil. Dies liegt daran, dass es longitudinale In-vivo-Studien an Vasospasmus bei Mäusen ermöglichen würde (d. H. Bildgebung von zerebralem Vasospasmus zu verschiedenen Zeitpunkten während der Tage nach der Induktion von SAH). Dies würde die Vergleichbarkeit der zu verschiedenen Zeitpunkten erfassten Daten verbessern. Darüber hinaus ist die Verwendung eines Längsschnittstudiendesigns eine Strategie, um die Anzahl der Tiere zu reduzieren.

Hier demonstrieren wir die Verwendung von hochfrequenten transkraniellem Ultraschall zur Bestimmung des Blutflusses in Hirnarterien bei Mäusen. Wir zeigen, dass ähnlich wie bei der transkraniellen Dopplersonographie (TCD) oder der transkraniellen farbcodierten Duplexsonographie (TCCD) in der klinischen Praxis^{14,15,16,17,18}- diese Methode zur Überwachung des zerebralen Vasospasmus verwendet werden kann, indem die Blutflussgeschwindigkeiten der intrakraniellen Arterien nach SAH-Induktion im murinen Modell gemessen werden.

Protokoll

Die Tierversuche wurden vom zuständigen Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz genehmigt und nach dem Tierschutzgesetz (TierSchG) durchgeführt. Alle geltenden internationalen, nationalen und institutionellen Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Tieren wurden befolgt. In dieser Studie führten wir Messungen der Blutflussgeschwindigkeiten intrakranieller und extrakranieller Arterien bei weiblichen C57BL / 6N-Mäusen im Alter von 11-12 Wochen mit einem Körpergewicht zwischen 19-21 g durch. Die Mäuse wurden entweder einer SAH-Induktion oder einer Scheinoperation unterzogen, die an anderer Stelle ausführlich beschrieben wurde^10,12,13.

1. Materialaufbereitung

1. Schalten Sie das Ultraschallgerät ein und geben Sie die Tier-ID ein.
2. Erwärmen Sie die Heizplatte des Ultraschallsystems auf 37 °C. Stellen Sie sicher, dass der rektale Temperaturfühler einsatzbereit ist.
3. Verwenden Sie ein Wasserbad, um das Ultraschallgel auf 37 °C zu erhitzen. Bereiten Sie Haarentfernungscreme, Kontaktcreme für die Elektroden und Augensalbe vor.

2. Anästhesie

1. Induzieren Sie die Anästhesie, indem Sie die Maus für 1 minute in eine Kammer geben, die mit 4% Isofluran und 40% O₂ gespült ist. Schützen Sie die Augen mit Augensalbe. Fahren Sie erst fort, nachdem eine ausreichend tiefe Betäubung erreicht wurde (Keine Reaktionen auf Schmerzreize).
2. Halten Sie die Anästhesie mit 1,5% Isofluran und 40% O₂ mit einer Anästhesiemaske während des gesamten Eingriffs aufrecht.

3. Bestimmung der Durchblutungsgeschwindigkeiten der intrakraniellen inneren Halsschlagadern mit transkranieller Hochfrequenz-Duplexsonographie

1. Stellen Sie die Maus in Bauchlage auf die Heizplatte des Ultraschallsystems, um eine Körpertemperatur von 37 °C aufrechtzuerhalten.
2. Die vier Extremitäten des Tieres mit leitfähiger Paste beschichten und mit Klebeband auf den in die Platine eingebetteten EKG-Elektroden befestigen. Überprüfen Sie, ob die physiologischen Parameter (EKG, Atemsignal) korrekt auf dem Bildschirm des bildgebenden Systems (z.B. Vevo3100) angezeigt werden. Passen Sie bei Bedarf das Anästhesieniveau an, um eine Zielherzfrequenz von 400-500 Schlägen pro Minute (bpm) zu erhalten.
3. Legen Sie das Gleitmittel auf einen rektalen Temperaturfühler und setzen Sie es vorsichtig ein, um die Körpertemperatur zu überwachen. Verwenden Sie bei Bedarf eine zusätzliche Wärmelampe.
4. Vor der ersten Untersuchung das Fell am Hinterhaupt chemisch mit Haarentfernungscreme entfernen. Verwenden Sie einen Wattestäbchen, um die Creme zu verteilen und reiben Sie sie für 2 Minuten, bis die Haare ausfallen.
   1. Nach weiteren 2 Minuten die Creme und die Haare mit einem Spatel entfernen und die Haut mit einem alkoholischen Hautantiseptikum desinfizieren. Mit auf 37 °C erwärmtem Ultraschallgel beschichten.
5. Verwenden Sie einen linearen Array-Wandler mit 38 MHz und eine Bildrate von über 200 Bildern/s, um Ultraschallbilder zu erfassen und die Sonde im mechanischen Arm zu fixieren. Platzieren Sie den Wandler auf dem um 30° nach hinten geneigten Hinterhaupt.
6. Verwenden Sie den Brightness-(B)-Modus und den Color-Wave-(CW) Doppler-Modus, um die richtige intrakranielle innere Halsschlagader zu visualisieren und den Wandler mit der Steuereinheit hin und her zu bewegen, bis der maximale Fluss der Arterien gefunden ist.
7. Um anatomische Informationen zu sammeln, verwenden Sie den traditionellen B-Modus und CW-Doppler-Modus und starten Sie die Erfassung, indem Sie auf die Schaltfläche Erfassen klicken.
   1. Um Informationen über die Fließeigenschaften der intrakraniellen Gefäße aufzuzeichnen, klicken Sie auf die Pulswellen-Dopplertaste (PW), platzieren Sie das Probenvolumen in der Mitte des Gefäßes und erhalten Sie eine Cine-Schleife, die länger als 3 s ist.
8. Gehen Sie mit der linken Seite identisch vor.
9. Fahren Sie mit den extrakraniellen Halsschlagadern fort.

4. Bestimmung der Durchblutungsgeschwindigkeiten der extrakraniellen inneren Halsschlagadern mit Hochfrequenz-Duplexsonographie

1. Stellen Sie die Maus in Rückenlage auf die Heizplatte des Ultraschallsystems, um eine Körpertemperatur von 37 °C aufrechtzuerhalten.
2. Die vier Extremitäten des Tieres mit leitfähiger Paste beschichten und mit Klebeband auf den in die Platine eingebetteten EKG-Elektroden befestigen. Überprüfen Sie erneut die korrekte Anzeige der physiologischen Parameter auf dem Bildschirm.
3. Entfernen Sie vor der ersten Untersuchung die Haare am vorderen Hals chemisch, indem Sie eine Haarentfernungscreme wie oben beschrieben verwenden. Den vorderen Hals mit auf 37 °C erwärmtem Ultraschallgel beschichten.
4. Verwenden Sie einen linearen Array-Wandler mit 38 MHz und eine Bildrate von über 200 Bildern/s, um Ultraschallbilder zu erfassen. Platzieren Sie den Wandler parallel zum Tier und passen Sie die Position an, um Längsbilder der rechten Halsschlagader zu erhalten.
5. Verwenden Sie den Brightness-(B)-Modus und den Color-wave-(CW) Doppler-Modus, um die richtige Halsschlagader zu visualisieren. Das Bild sollte die rechte gemeinsame Halsschlagader (RCC), die rechte arteria carotis interna (RICA) und die rechte äußere Halsschlagader (RECA) enthalten.
6. Um anatomische Informationen zu sammeln, verwenden Sie den traditionellen B-Modus und CW-Doppler-Modus und starten Sie die Erfassung, indem Sie auf die Schaltfläche Erfassen klicken.
   1. Um Informationen über die Fließeigenschaften der Extrakranialen Halsschlagader aufzuzeichnen, klicken Sie auf die Pulswellentaste (PW), platzieren Sie das Probenvolumen in der Mitte der Mitte der Halsschlagader, der Arteria carotis interna und der Arteria carotis externa und erhalten Sie eine Cine-Schleife, die länger als 3 s ist.
7. Gehen Sie mit der linken Seite identisch vor.
8. Beenden Sie die Anästhesie und entfernen Sie das Tier von der Wärmeplatte. Bringen Sie das Tier in einen Käfig zurück, der in einem auf 37 ° C erhitzten Inkubator für 1 Stunde platziert wird, um Unterkühlung zu verhindern und die vollständige Genesung zu überprüfen.

5. Verarbeitung von Ultraschalldaten

1. Verwenden Sie einen externen Arbeitsplatz für die Nachbearbeitung der hochfrequenten Ultraschalldaten. Exportieren Sie die Bilder und Cine-Loops im B-Modus, CW-Doppler-Modus und PW-Doppler-Modus.
2. Öffnen Sie die exportierte Ultraschallstudie. Wählen Sie ein Tier aus und öffnen Sie die PW-Doppler-Cine-Schleife der intrakraniellen Halsschlagader. In diesem Protokoll werden typischerweise 7 bis 8 Herzschläge und entsprechende Strömungsgeschwindigkeitskurven aufgezeichnet.
3. Halten Sie die Cine-Schleife an und klicken Sie auf die Schaltfläche Messung. Wählen Sie das Gefäßpaket und klicken Sie auf RICA PSV, um den systolischen Spitzendruck (PSV) zu messen. Klicken Sie nun links auf die Spitze einer Geschwindigkeitskurve und ziehen Sie die gerade Linie zur Nulllinie. Bestimmen Sie die Messung per Klick mit der rechten Maustaste.
4. Wählen Sie nun RICA EDV, um die enddiastolische Geschwindigkeit (EDV) zu messen. Klicken Sie links auf minimalen Ausschlag der Geschwindigkeitskurve am Ende der Diastole. Ziehen Sie die Linie gerade auf die Nulllinie und bestimmen Sie die Messung durch einen Klick mit der rechten Maustaste.
5. Wählen Sie RICA VTI, um das Geschwindigkeitszeitintegral (VTI) zu messen. Klicken Sie am Anfang einer Geschwindigkeitskurve links und folgen Sie der Kurve mit der Maus bis zum Ende des diastolischen Plateaus. Klicken Sie dann erneut nach rechts, um die Messung zu bestimmen.
6. Exportieren Sie die Daten der intrazerebralen internen Halsschlagadern mithilfe der Berichtsschaltfläche. Klicken Sie auf Exportieren und speichern Sie die Daten als VSI-Berichtsdatei.
7. Verwenden Sie den gleichen Ansatz, um PSV, EDV und VTI der richtigen extrakraniellen internen Halsschlagadern zu messen und die Daten entsprechend zu exportieren.
8. Gehen Sie mit der linken Seite identisch vor.

Ergebnisse

Bei 6 Mäusen, bei denen SAH mit dem endovaskulären Filamentperforationsmodell induziert wurde, während 3 eine Scheinoperation erhielten, wurden die Blutflussgeschwindigkeiten der intrakraniellen inneren Halsschlagader (ICA) und der extrakraniellen ICA einen Tag vor der Operation und 1, 3 und 7 Tage nach der Operation bestimmt. Die Messungen wurden im Rahmen der Echokardiographie-Untersuchungen einer anderen Studie unter Betäubung mit Isofluran unter Beibehaltung der Körpertemperatur bei 37 °C¹⁹

Diskussion

Nach unserem besten Wissen ist diese Studie die erste, die ein Protokoll zur Überwachung des zerebralen Vasospasmus in einem murinen Modell von SAH mit hochfrequenten transkraniellen farbcodierten Duplex-Ultraschall vorstellt. Wir zeigen, dass diese Methode eine Erhöhung der intrakraniellen Blutflussgeschwindigkeiten nach SAH-Induktion bei Mäusen messen kann. In der Humanmedizin ist dieses Phänomen bekannt^3,15. Mehrere klinische Studien haben gezeigt, dass er...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balea hair removal creme	Balea; Germany	ASIN B0759XM39V	hair removal creme
C57BL/6N mice	Janvier; Saint-Berthevin Cedex, France	n.a.	mice
Corneregel	Bausch&Lomb; Rochester, NY, USA	REF 81552983	eye ointment, lube
cotton swabs	Hecht Assistent; Sondenheim vor der Röhn, Germany	REF 44302010	cotton swabs
Ecco-XS razor	Tondeo; Soligen, Germany	DE 28693396	razor
Electrode cream	GE; Boston, MA, USA	REF 21708318	conductive paste
Heating plate	Medax; Kiel, Germany	2005-205-01
Isoflurane	Abvie; Wiesbaden, Germany	n.a.	volatile anesthetic
Leukofix	BSN medical; Hamburg, Germany	REF 02137-00	tape
Mechanical arm + micromanipulator	VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA	P/N 11277
Microbac tissues	Paul Hartmann AG; Hamburg, Germany	REF 981387	antimicrobial tissues
MZ400, 38 MHz linear array transducer	VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA	REF 51068-30	ultrasound transducer
Sonosid	ASID Bonz GmbH; Herrenberg, Germany	REF 782010	ultrasonography gel
Ultrasound platform with heating plate and ECG-recording	VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA	P/N 11179
UniVet-Porta	Groppler; Oberperasberg, Germany	S/N BKGM0437	isoflurane vaporizer
Vevo3100	VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA	REF 51073-45	ultrasonography device
VevoLab software	VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA	n.a.	evaluation software