Bewertung und Quantifizierung von Mikroepithellücken in der Dickdarmschleimhaut mittels Immunfluoreszenzfärbung

Zusammenfassung

In dieser Arbeit beschreiben wir eine neue Methode, um die spezifische Stelle sichtbar zu machen, an der die transzelluläre und parazelluläre Permeabilität in der entzündeten Dickdarmschleimhaut erhöht ist. In diesem Assay wenden wir einen 10 kDa Fluoreszenzfarbstoff an, der an ein Lysin-fixierbares Dextran konjugiert ist, um Regionen mit hoher Permeabilität (HPR) in der Dickdarmschleimhaut sichtbar zu machen.

Zusammenfassung

Epithelzellen, die die Darmschleimhaut auskleiden, bilden eine physikalische Barriere, die den luminalen Inhalt vom Interstitium trennt. Eine Beeinträchtigung der Epithelbarriere wurde mit der Entwicklung verschiedener Pathologien wie entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) in Verbindung gebracht. In der entzündeten Schleimhaut entsprechen oberflächliche Erosionen oder Mikroerosionen, die die epithelialen Monoschichten korrumpieren, Stellen mit hoher Permeabilität. Mehrere Mechanismen wurden mit der Bildung von Mikroerosionen in Verbindung gebracht, darunter Zellablösung und Apoptose. Diese Mikroerosionen stellen oft mikroskopisch kleine Epithellücken dar, die zufällig im Dickdarm verteilt sind. Die Visualisierung und Quantifizierung dieser Epithellücken hat sich als wichtiges Instrument zur Untersuchung der Funktion der intestinalen Epithelbarriere erwiesen. In dieser Arbeit beschreiben wir eine neue Methode, um die spezifische Stelle sichtbar zu machen, an der die transzelluläre und parazelluläre Permeabilität in der entzündeten Dickdarmschleimhaut erhöht ist. In diesem Assay wenden wir einen 10 kDa Fluoreszenzfarbstoff an, der an ein Lysin-fixierbares Dextran konjugiert ist, um Regionen mit hoher Permeabilität (HPR) in der Dickdarmschleimhaut sichtbar zu machen. Die zusätzliche Verwendung von Zelltodmarkern zeigte, dass HPR apoptotische Herde umfassen, in denen epitheliale Extrusion/Ausscheidung stattfindet. Das hier beschriebene Protokoll bietet einen einfachen, aber effektiven Ansatz zur Visualisierung und Quantifizierung von Mikroerosionen im Darm, was ein sehr nützliches Werkzeug in Krankheitsmodellen ist, in denen die intestinale Epithelbarriere beeinträchtigt ist.

Einleitung

Die Magen-Darm-Schleimhaut bildet eine physikalische Barriere, die das extrazelluläre Milieu und das innere Wirtsmilieu trennt und an der Aufnahme von Nährstoffen, Wasser und Elektrolyten beteiligt ist. Die Darmbarriere umfasst eine Schleimschicht, die aus Glykoproteinen besteht, eine Monoschicht aus Epithelzellen, und die darunter liegende Lamina propria sind Immun- und Stromazellen. Die Darmepithelzellen, die die physikalische Barriere bilden, sind durch verschiedene Proteinkomplexe miteinander verbunden, zu denen die Adherens-Verbindung (AJ), die Tight Junction (TJ) und die Desmosomen (DMs) gehören. Eine Beeinträchtigung der epithelialen Barrierefunktion erhöht die Darmpermeabilität und ermöglicht die Translokation von Schadstoffen und Krankheitserregern aus dem Lumen in das Interstitium¹. Es gibt immer mehr Krankheiten, bei denen die Epithelbarriere beeinträchtigt ist, wie z. B. die entzündlichen Darmerkrankungen (CED) wie Morbus Crohn (CD), Colitis ulcerosa (UC) und unbestimmte Colitis (IC). Die Inzidenz von CED nimmt weltweit zu, wobei die Prävalenz im Westen bei 0,5 % liegt. Obwohl die Ursachen der IBD unklar sind, trägt die übermäßige Immun-/Entzündungsreaktion, die in der Darmwand ausgelöst wird, direkt zur Störung der Epithelbarriere bei, indem sie die Wiederherstellung der intestinalen Epithelhomöostase einschränkt ^2,3,4. Darüber hinaus haben Patienten mit langjähriger Darmentzündung ein hohes Risiko, an Darmkrebs (CRC) zu ^erkranken5. Andere Pathologien, die mit einer Störung der Darmepithelbarriere verbunden sind, sind das Reizdarmsyndrom, Fettleibigkeit, Zöliakie, Nicht-Zöliakie-Glutensensitivität und Nahrungsmittelallergien⁶. Aus diesen Gründen besteht ein dringender Bedarf an der Entwicklung experimenteller Ansätze, die es ermöglichen, die Integrität der intestinalen Epithelbarriere in Tiermodellen zu analysieren, die die beim Menschen auftretende Pathogenese nachahmen.

In dieser Arbeit untersuchten wir mit einer einfachen Technik die gastrointestinale passive parazelluläre und die transzelluläre Permeabilität, die mit einem Entzündungsprozess im Dickdarmepithel verbunden ist. Um die transmurale Strömung von Makromolekülen zu untersuchen, haben wir die passive Diffusion von FITC-Dextran (4 kDa) und RITC-Dextran (10 kDa) in Dickdarmsäcken ex vivo gemessen. Darüber hinaus haben wir durch die Injektion eines fluoreszierenden 10 kDa Lysin-fixierbaren Dextrans in das Lumen der Darmsäcke gezielt die Bereiche mit hoher Permeabilität in der entzündeten Schleimhaut identifiziert. Durch die Verwendung von Apoptosemarkern und Antikörpern gegen AJ-Proteine konnten wir zeigen, dass Bereiche mit hoher Permeabilität in der entzündeten Schleimhaut bestimmten Regionen entsprechen, in denen Epithelzellen Apoptose durchlaufen und Zell-Zell-Verbindungen gestört sind. Diese neue Technik kann verwendet werden, um die Integrität des Epithels in jedem Modell zu bewerten, in dem die Darmepithelbarriere beeinträchtigt ist.

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Protokoll

Alle Verfahren wurden vom CINVESTAV Institutional Committee for Care and Use of Laboratory Animals (CICUAL) überprüft und genehmigt.

1. Vorbereitung von Materialien und Reagenzien

1. Hartmann-Lösung (130 mM NaCl, 28 mM Laktat, 4 mM KCl, 1,5 mM CaCl₂) auf 37 °C vorwärmen, während sie mit 95 % O₂/5 % CO₂ sprudelt. Halten Sie den physiologischen pH-Wert (7,4) für die Lösung aufrecht.
2. Zur Analyse der passiven parazellulären Permeabilität wird eine Arbeitslösung hergestellt, indem 1 mg/ml FITC-Dextran (4 kDa) und 1 mg/ml RITC-Dextran (10 kDa) in vorgewärmter Hartmann-Lösung gelöst werden.
3. Bereiten Sie eine 4 μg/ml-Lösung von Alexa Fluor647 Fixable-Dextran (10 kDa) in Hartmann-Lösung vor. Bewahren Sie Arbeitslösungen in einem konischen 15-ml-Röhrchen auf und schützen Sie sie bis zum Gebrauch vor Licht.
   HINWEIS: Es sind 300 μl Arbeitslösung pro Doppelpunkt erforderlich.
4. Bereiten Sie eine chirurgische Naht vor, indem Sie zwei 5 cm lange Abschnitte für jeden Dickdarm schneiden. Schlingen Sie die Nähte zu einem ungeschlossenen Knoten.

2. Dissektion und Aufbereitung des gastrointestinalen Tracs

1. Halten Sie feste Nahrung 6 Stunden lang zurück, bevor Sie die Mäuse einschläfern. Stellen Sie ad libitum Trinkwasser zur Verfügung.
   HINWEIS: Wenn möglich, setzen Sie die Mäuse auf Nährgelpräparate (gereinigtes Wasser, Melasse, Kürbis, Maissirup, Sonnenblumenkerne, Weizenprotein, Pflanzenöl, Lebensmittelsäure, Hydrokolloide, Elektrolyte, Maisfasern, NIH-31M Mineral Mix, NIH-31M Vitamin Mix).
2. Einschläferung von Mäusen in einer CO₂ -Kammer, gefolgt von einer Gebärmutterhalsluxation gemäß den institutionellen Ethikprotokollen.
3. Sterilisieren Sie den Bauch und den Brustkorb mit 70% Ethanol.
4. Machen Sie mit einer Schere einen Schnitt in der Mitte des Bauches und legen Sie die Bauchhöhle frei.
5. Trennen und präparieren Sie den Dickdarm zur Orientierung, indem Sie am Ende des Dünndarms (Endteil des Ileums) direkt vor dem Blinddarm und dann am Analrand schneiden. Entfernen Sie das Mesenterium vorsichtig mit einer chirurgischen Pinzette und legen Sie den Dickdarm in die Hartmann-Lösung.
6. Um die Konsistenz zwischen den Tieren zu wahren, ist es wichtig, ähnliche Abschnitte zu identifizieren und zur Bewertung der Durchlässigkeit zu verwenden. Es ist sehr empfehlenswert, Regionen in der Nähe des Blinddarms zu verwenden.
7. Verwenden Sie eine Insulinspritze, die mit einer stumpfen Kunststoffkanüle ausgestattet ist, um den im Dickdarm vorhandenen Luminalgehalt sanft zu spülen. Ist der Stuhl fest, drücken Sie vorsichtig mit Hilfe einer stumpfen Pinzette. Nachdem der Kot entfernt wurde, 3 Mal mit 400 μl Hartmann-Lösung waschen.
8. Binden Sie die proximale Region (die dem Blinddarm am nächsten liegt) ab und platzieren Sie eine vorgebundene Nahtschlaufe im distalen Bereich des Dickdarms. Füllen Sie mit Hilfe einer Spritze, die mit einer stumpfen Kunststoffkanüle ausgestattet ist, den Darmsack mit der Lösung, die die Wunschsonde enthält. Entfernen Sie vorsichtig die Kunststoffkanüle und binden Sie die Schlaufe im distalen Bereich fest.
9. Legen Sie den Darmsack in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit 6 mL Hartmann-Lösung und inkubieren Sie ihn 1 Stunde lang, um den passiven parazellulären Fluss von FITC/RITC-Dextran zu bewerten, oder 30 Minuten, um den Fluss des Alexa Fluor Fixable-Dextran zu analysieren.
   1. Halten Sie die konischen Röhren, die die Darmsäcke enthalten, bei 37 °C mit 5 % CO₂ und schützen Sie sie vor Licht.
10. Zur Messung der passiven Permeabilität mittels FITC/RITC-Dextran. Bei 0 und 60 min wird eine 100-μl-Probe aus dem konischen Röhrchen entnommen und auf eine 96-Well-Platte umgefüllt. Fügen Sie 100 μl frisches Medium wieder hinzu, um das verlorene Volumen zu ersetzen.
11. Messung von Proben und Standards für FITC/RITC auf einem Fluoreszenzplatten-Reader (FITC-Anregung/-Emission: 495 nm/519 nm; RITC Anregung/Emission: 570/595 nm).
12. Um die passive Permeabilität mit Alexa Fluor 647 Fixable-Dextran zu messen, entfernen Sie den Darm, schneiden Sie in der Nähe des chirurgischen Krawattenknotens und schneiden Sie den Darm so auf, dass das Lumen freigelegt wird, um die Lösung mit der Sonde zu entfernen. Waschen Sie das Darmlumen 2 Mal mit kalter Hartmann-Lösung.
13. Legen Sie das Gewebe in eine Tissue-Form, die zuvor mit Optimum Cutting Temperature Compound (O.C.T.) gefüllt wurde. Richten Sie das Gewebe vertikal oder horizontal entsprechend der zu schneidenden Seite aus. Lagern Sie die Proben bei -80 °C.

3. Immunfluoreszenz-Färbung

1. Fixierte Schnitte von 20 Mikrometern mit 3,7 % Paraformaldehyd (PFA) für 20 min bei Raumtemperatur und dann 3 Mal mit kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung waschen (PBS; 37 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄ und 1,8 mM KH₂ PO₄).
   HINWEIS: Vertikale Schnitte aus dem Darm neigen dazu, sich zu lösen, wenn die Waschungen sehr stark sind.
2. Mit 0,2% TX-100/PBS 12 min bei Raumtemperatur permeabilisieren und anschließend 3 mal mit kaltem PBS waschen.
3. Mit 0,2 % BSA/PBS 1 Stunde bei Raumtemperatur blockieren.
4. Den Primärantikörper in Blockierungslösung verdünnen und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. 3 Mal mit kaltem PBS waschen.
5. 1 h mit Sekundärantikörpern in Blockierungslösung inkubieren. 3 Mal mit kaltem PBS waschen.
6. Tragen Sie Eindeckmedium auf die Schnitte auf und versiegeln Sie sie mit einem Deckglas. Die Objektträger können bis zu 3 Monate bei -20 °C gelagert werden.

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Ergebnisse

In der entzündeten Schleimhaut beeinträchtigen oberflächliche Erosionen oder Mikroerosionen die Integrität der Epithelzell-Monoschicht und stellen Stellen mit hoher Permeabilität dar ^7,8. Um solche Möglichkeiten zu bewerten, analysierten wir die passive Permeabilität in der entzündeten Dickdarmschleimhaut in einem Dextran-Natriumsulfat-Colitis-Mausmodell. Kurz gesagt, C57BL/6J-Mäuse erhielten 5 Tage lang 2,5 % DSS (w/v, ...

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Diskussion

Die Epithelhomöostase, die aus dem Gleichgewicht der Zellproliferation und der epithelialen Apoptose resultiert, erhält eine ordnungsgemäße und funktionelle Darmbarriere. Viele klinische Erkrankungen, wie z. B. IBD, gehen mit Veränderungen der Darmpermeabilität, Entzündungen der Schleimhaut und Störungen der epithelialen Homöostase einher oder sind dadurch gekennzeichnet¹. Das Zusammenspiel dieser Prozesse ist nach wie vor höchst umstritten. Daher ist di...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Active Caspase-3 antibody (1:1000)	Cell signaling	9664	Cleaved caspase-3 (Asp175)(5AE1) Rabbit mAb
Alexa Fluor 488  anti rabbit (1:1000)	Invitrogen	A21206
Alexa Fluor 594 anti rat (1:1000)	Invitrogen	A21209
Confocal microscope (Leica TCS SP8x)	Leica		HyD detectors  and White Light Laser
E-Cadherin antibody (1:750)	Sigma	MABT26	Rat monoclonal Delma-1 antibody
Ethanol 70%	Generic
Fixable-Dextran	Invitrogen	D22914	Dextran, Alexa Fluor, 10,000 MW, anionic, fixable
FITC Dextran	Sigma	46944	Fluorescein isothiocyanate–dextran M. Wt. 4 kDa
Hartmann's Solution	PiSA	HT PiSA
Incubator (AutoFlow NU-8500)	Nuaire
Microplate reader (Tecan Infinite 200 PRO)	Tecan
Nunc F96 MicroWell Black and White Polystyrene Plate	ThermoFisher Scientific
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Phalloidin (1:1000)	Invitrogen	A12380	Alexa Fluor 568 Phalloidin
RITC Dextran	Sigma	R8881-100MG	Rhodamine B Isothiocyanate-Dextran. M. Wt. 10 kDa
Secondary antibodies (1:10000)	Jackson ImmunoResearch Laboratories		HRP-conjugated secondary antibodies
Suture threads	Generic		Braided silk and braided polyester surgical sutures are prefered.
ZO-1 (1:1000)	Invitrogen	40-2200	Rb anti-ZO-1