In vitro 3D-zellkulierte arterielle Modelle zur Untersuchung des vaskulären Wirkstoff-Targetings unter Flow

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein neues Protokoll vor, um die gezielte Ablagerung von Wirkstoffträgern an Endothelzellen in fabrizierten, realen, dreidimensionalen menschlichen Arterienmodellen unter physiologischem Fluss zu untersuchen und abzubilden. Die vorgestellte Methode könnte als neue Plattform für die Gezielter von Wirkstoffträgern innerhalb des Gefäßsystems dienen.

Zusammenfassung

Die Verwendung von dreidimensionalen (3D) Modellen menschlicher Arterien, die mit den richtigen Abmessungen und Anatomie entworfen sind, ermöglicht die korrekte Modellierung verschiedener wichtiger Prozesse im Herz-Kreislauf-System. Obwohl in letzter Zeit mehrere biologische Studien mit solchen 3D-Modellen menschlicher Arterien durchgeführt wurden, wurden sie nicht zur Untersuchung des vaskulären Targetings angewendet. Dieser Artikel stellt eine neue Methode vor, um reale, rekonstruierte menschliche arterielle Modelle mit einer 3D-Drucktechnik herzustellen, sie mit menschlichen Endothelzellen (ECs) auszukleiden und partikelspezifische Ziele unter physiologischem Fluss zu untersuchen. Diese Modelle haben den Vorteil, dass sie die physiologische Größe und den Zustand der Blutgefäße im menschlichen Körper mit kostengünstigen Komponenten replizieren. Diese Technik könnte als neue Plattform für die Untersuchung und das Verständnis von Wirkstoff-Targeting im Herz-Kreislauf-System dienen und das Design neuer injizierbarer Nanomedikamente verbessern. Darüber hinaus kann der vorgestellte Ansatz wichtige Instrumente für die Untersuchung der gezielten Verabreichung verschiedener Wirkstoffe für Herz-Kreislauf-Erkrankungen unter patientenspezifischen Fluss- und physiologischen Bedingungen liefern.

Einleitung

In jüngster Zeit wurden mehrere Ansätze unter Verwendung von 3D-Modellen der menschlichen Arterien^1,2,3,4,5angewendet. Diese Modelle replizieren die physiologische Anatomie und Umgebung verschiedener Arterien im menschlichen Körper in vitro. Sie wurden jedoch hauptsächlich in zellbiologischen Studien verwendet. Aktuelle Studien zum vaskulären Targeting von Partikeln auf das Endothel umfassen in silico Computersimulationen^6,7,8, in vitro mikrofluidische Modelle^9,10,11und in vivo Tiermodelle¹². Trotz der Erkenntnisse, die sie geliefert haben, haben diese experimentellen Modelle den Targeting-Prozess, der in menschlichen Arterien auftritt, nicht genau simuliert, wobei Blutfluss und Hämodynamik dominante Faktoren darstellen. Zum Beispiel kann die Untersuchung von Partikeln, die auf atherosklerotische Regionen in der Karotisarterienverzweigung abzielen, die für ihr komplexes Rezirkulationsflussmuster und ihren Wandscherspannungsgradienten bekannt sind, die Reise der Partikel beeinflussen, bevor sie das Endothel erreichen^13,14,15,16. Daher müssen diese Studien unter Bedingungen durchgeführt werden, die die physiologische Umgebung replizieren, d. H.Größe, Dimension, Anatomie und Strömungsprofil.

Vor kurzem fertigte diese Forschungsgruppe 3D-rekonstruierte menschliche arterielle Modelle, um die Ablagerung und das Targeting von Partikeln auf das Gefäßsystem zu untersuchen¹⁷. Die Modelle basierten auf geometrischen 3D-Nachbildungen menschlicher Blutgefäße, die dann mit menschlichen ECs kultiviert wurden, die anschließend ihre Innenwände auskleideten. Darüber hinaus replizierten die Modelle, wenn sie einem Perfusionssystem unterzogen wurden, das einen physiologischen Fluss erzeugt, die physiologischen Bedingungen genau. Das Perfusionssystem wurde entwickelt, um Flüssigkeiten mit einer konstanten Durchflussrate zu perfusionieren, wobei eine Peristaltikpumpe sowohl in geschlossenen als auch in offenen Kreisläufen verwendet wird (Abbildung 1). Das System kann als geschlossener Kreislauf verwendet werden, um die Partikelablagerung und das Targeting auf die Zellen abzubilden, die innerhalb des Carotismodells ausgesät sind. Darüber hinaus kann es als offener Kreislauf verwendet werden, um nicht haftende Partikel am Ende der Experimente auszuwaschen und das System zu reinigen und zu warten. Dieser Artikel stellt Protokolle für die Herstellung von 3D-Modellen der menschlichen Carotisverzweigung, das Design des Perfusionssystems und die Abbildung der Ablagerung von Zielpartikeln innerhalb der Modelle vor.

Protokoll

HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung eines 3D-Modells der Halsschlagader und kann angewendet werden, um jede andere Arterie von Interesse zu erzeugen, indem einfach die geometrischen Parameter geändert werden.

1. Entwurf und Herstellung einer 3D-Verzweigung des Modells der menschlichen Halsschlagader

1. Wählen Sie Bilder von Patienten oder zuvor untersuchte Geometrien der Verzweigung der menschlichen Halsschlagader und erstellen Sie ein computergestütztes Designmodell der Form, das gedruckt werden muss.
   HINWEIS: Die Karotisverzweigung hat einen Einlass und zwei Auslässe. Es ist wichtig, einen 3D-Formrahmen um die Arterie und temporäre Druckstützen zwischen dem Rahmen und der Arterienform zu entwerfen (Abbildung 2A-C).
2. Drucken Sie die Geometrien mit einem 3D-Drucker. Schneiden Sie die temporären Druckstützen ab und verwenden Sie Schleifpapier, um die Formen zu polieren und zu glätten, insbesondere in den Bereichen, in denen die Stützen geschnitten wurden. Spülen Sie das geschliffene Modell mit Isopropylalkohol ab, um den Kunststoffstaub zu entfernen, und lassen Sie es in einer chemischen Haube für 2-3 h vollständig trocknen.
   HINWEIS: Hier wurden die gedruckten Formen aus Klarem Harz v4 hergestellt (Abbildung 2D, E).
3. Um den Kunststoff leicht aufzulösen, sprühen Sie die Formen mit transparentem Lack in eine chemische Haube und lassen Sie sie 1 h an der Luft trocknen. Wiederholen Sie dies 3x.
   HINWEIS: Hier wurde 2X Ultra Cover Clear Spray verwendet, aber jede andere Art sollte geeignet sein, solange es sich nicht um Holzlack handelt. Vergewissern Sie sich, dass kein freiliegender Kunststoff mehr vorhanden ist, da der Kunststoff möglicherweise mit dem Silikon reagiert und verhindert, dass es sich richtig verfestigt. Die Qualität der besprühten Oberfläche bestimmt die Qualität der Oberfläche des endgültigen Silikonmodells.
4. Schneiden Sie transparente rechteckige Dias / Streifen aus glattem Kunststoff mit den gleichen Abmessungen wie der Formrahmen und kleben Sie sie mit dem Lack auf allen Seiten und von einer Seite des Rahmens auf den Rahmen, so dass er unten versiegelt und oben geöffnet wird. Tragen Sie den Lack mit einem Pinsel in eine chemische Haube auf und lassen Sie die Dias mindestens 24 Stunden vollständig trocknen(Abbildung 2F).
5. Um die Silikonkautschukmischung vorzubereiten, fügen Sie Flüssigsilikon mit seinem Härter (Massenverhältnis 1:10) in eine Kunststoffplatte ein und rühren Sie gründlich um, um eine vollständige Mischung zu gewährleisten. Für das Carotis-Modell fügen Sie 54 g des Silikons und 6 g seines Härters hinzu.
6. Kühlen Sie das Gemisch für 15 min bei 4 °C ab und entgasen Sie es dann in einem Vakuum-Trockenmittel, bis alle Luftblasen beseitigt sind. Legen Sie die Form in den Trockenmittel (mit der offenen Seite nach oben), gießen Sie die Silikonmischung langsam in die Form und entfernen Sie die Luftblasen erneut, bis die Mischung klar ist.
7. Lassen Sie die Form mit dem Silikon über Nacht bei Raumtemperatur stehen (wenn möglich, lassen Sie es ohne Vakuum im Ausstecher). Wenn die Mischung noch nicht vollständig getrocknet ist, inkubieren Sie sie bei 60 °C für weitere Stunden.
8. Sobald die Mischung vollständig getrocknet ist, entfernen Sie die transparenten Dias und tauchen Sie das Modell 48 h lang in absolutes Aceton in eine chemische Haube, bis der Kunststoff vollständig gelöst ist. Entfernen Sie alle Plastikreste mit einem Holzstab. Um das im Modell eingeschlossene Aceton zu verdampfen, inkubieren Sie es bei 60 °C für mindestens 4 Tage, bevor Sie die Zelle aussäen.

2. Zellkultur und Seeding in Modellen

1. Bereiten Sie drei Anschlüsse für das Carotismodell vor: einen für den Einlass und zwei für die Auslässe (siehe Materialtabelle). Sterilisieren Sie das Modell und die Anschlüsse durch ultraviolette Bestrahlung in einer biologischen Haube für 20 min.
2. Beschichten Sie die Modelle mit 4 mL 100 μg/ml Fibronektin (in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung, (PBS)) für 2 h bei 37 °C oder über Nacht bei 4 °C. Injizieren Sie die Fibronektinlösung durch den Einlass mit einer 5- oder 10-ml-Kunststoffspritze in das Modell. Entfernen Sie das Fibronektin durch den Auslass und waschen Sie das Modell mit EC-Medium.
3. Suspendieren Sie 2,5 × 10⁶ Zellen/ml humane Nabelschnurvenendothelzellen (HUVECs, Passage < 6) und füllen Sie das Modell mit 4 ml der Zellsuspension mit einer 5 oder 10 ml Kunststoffspritze (Abbildung 3A). Legen Sie das Modell auf einen Rotator in einem Inkubator (37 °C) mit einer Geschwindigkeit von 1 U / min für 48 h, um eine homogene Aussaat zu gewährleisten. Stellen Sie sicher, dass das Modell gut am Rotator befestigt ist (Abbildung 3B). Wechseln Sie das Medium nach 24 h in einer biologischen Haube und kehren Sie für weitere 24 h zum Rotator im Inkubator zurück.
   HINWEIS: Nach 24 h sind die Zellen ausgesät und können mit einem Mikroskop abgebildet werden.
4. Entfernen Sie das Modell aus dem Rotator und waschen Sie es mit 1x PBS mit einer 10-ml-Kunststoffspritze. Um die Zellen zu fixieren, inkubieren Sie die Zellen mit 4 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) für 15 minuten in einer chemischen Haube zum Modell und spülen Sie sie dann 3x mit PBS ab. Fügen Sie 4 ml PBS hinzu und lagern Sie es bei 4 °C bis zum Experiment (Abbildung 3C). Färben Sie die Zellen innerhalb des Modells mit Standard-Färbeprotokollen (z. B. Kernfärbung mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI), Abbildung 3D).

3. Aufbau des Perfusionssystems

1. Das Perfusionssystem verfügt über zwei Einlässe und zwei Auslassröhrchen. Verschmelzen Sie die beiden Einlässe zu einem einzigen 4 mm ID-Rohr und wieder zu zwei 6 mm ID-Rohren, die mit der Peristaltikpumpe verbunden sind. Verschmelzen Sie die beiden 6-mm-ID-Rohre, die aus der Peristaltikpumpe kommen, zu einem einzigen 4-mm-Rohr und verbinden Sie es mit einem Schwingungsdämpfer, um Schwingungen von der Pumpe zu eliminieren. Verwenden Sie eine 250 ml schmalmundige Flasche mit einem dreiblendeigen Deckel als Dämpfer.
2. Schließen Sie eine Öffnung an den Einlass der Pumpe an, schließen Sie die zweite mit einem Korken, der in Notfällen zur Druckentlüftung verwendet wird, und verlängern Sie die dritte Öffnung (die der Auslass ist) bis zum Boden der Flasche.
3. Verbinden Sie den Dämpfer mit dem Einlass des kultivierten Halsschlagadermodells über den Auslassschlauch. Verschmelzen Sie die beiden Auslässe des Modells zu einem Schlauch, der der Auslass des Systems ist (Alle Schläuche sind 4 mm ID).
4. Teilen Sie den Auslassschlauch in zwei Auslassrohre auf (eines für den geschlossenen Kreislauf und das andere für den Abfallbehälter im offenen Kreislauf). Befestigen Sie an jedem Rohr eine Kunststoffklemme.
   HINWEIS: Die Kombination aus offenen/geschlossenen Klemmen bestimmt, ob sich das System in einer geschlossenen oder offenen Konfiguration befindet. Wie in Abbildung 1dargestellt, ist das System ein geschlossener Stromkreis, wenn die Klemmen a und d geschlossen sind, während b und c geöffnet sind. Die Rückseite bringt das System zur Konfiguration des offenen Stromkreises.
5. Bereiten Sie drei Behälter vor: einen, der 300 ml Flüssigkeit aufnehmen kann (für geschlossenen Kreislauf) und zwei weitere von jeweils 1 L: einen zum Waschen und den anderen für Abfälle (für den offenen Kreislauf).

4. Geschlossene Konfiguration: Perfusionsexperiment und Bildgebung

1. Fügen Sie dem Behälter mit geschlossenem Kreislauf 300 ml PBS hinzu, was ausreicht, um das gesamte System einschließlich des Schlauchs und des Modells zu füllen. Legen Sie ein Einlassrohr und ein Auslassrohr (offene Klemmen b und c) in den Behälter.
2. Füllen Sie den 1 L Waschbehälter mit destilliertem Wasser (zum Waschen am Ende des Experiments) und lassen Sie den anderen 1 L Abfallbehälter leer. Legen Sie die anderen Ein- und Auslassschläuche (schließen Sie die Klemmen a und d) in die Wasch- bzw. Abfallbehälter.
3. Nehmen Sie das fest zellkulierte Carotismodell aus dem 4 °C-Speicher und leeren Sie das PBS. Schließen Sie den Ein- und Auslass der Halsschlagader wie in den Schritten 3.3-3.4 beschrieben an. Lassen Sie das Modell nicht lange trocken. Sobald das Modell angeschlossen ist, aktivieren Sie die Pumpe, um Flüssigkeit zu perfundieren.
4. Legen Sie das Carotismodell unter das Mikroskop. Öffnen Sie den Schlauch vor dem Einlass und nach dem Auslass des Halsschlagadermodells. Stellen Sie die Peristaltikpumpe auf 10 U / min ein und schalten Sie sie ein. Erhöhen Sie die Geschwindigkeit in Schritten von 5 U / min, alle 4-5 minuten. Stellen Sie sicher, dass es keine Leckagen gibt.
5. Bei 100 U/min, was der maximalen Durchflussrate der physiologischen Wellenform der menschlichen Halsschlagader (~400 ml/min) entspricht, fügen Sie fluoreszierende carboxylierte Polystyrolpartikel (PS) (2 μm, in einer Konzentration von 1,6 μg/ml) zu den 300 ml PBS im geschlossenen Kreislaufbehälter hinzu. Stellen Sie die Region von Interesse alle 10 s für 1,5 h ab (standbildlich einzelne Bilder oder Videos nach Bedarf).

5. Open-Circuit-Konfiguration: der Waschschritt

1. Öffnen Sie die Klemmen der Wasch- und Abfallrohre in den 1-L-Behältern (Klemmen a und d) und schließen Sie sofort die Klemmen der Einlass- und Auslassrohre im 300-ml-Behälter (Klemmen b und c), um das System von einer geschlossenen in eine offene Kreislaufkonfiguration zu wechseln.
2. Lassen Sie den größten Teil des Wassers mit 100 U / min vom Waschbehälter zum Abfallbehälter fließen. Bevor es vollständig übertragen wird, drücken Sie Stopp auf der Peristaltikpumpe und schließen Sie die Rohrklemmen vor dem Einlass und nach dem Auslass des Halsschlagadermodells.
3. Erfassen Sie mit den entsprechenden Filtern Bilder des Modells im interessierende Bereich, um die Ablagerung und Haftung von Partikeln an den Zellen zu zeigen. Trennen Sie das Carotismodell. Fügen Sie vorsichtig und langsam 4 ml PBS mit einer 10-ml-Spritze durch den Einlass des Modells hinzu.
4. Verbinden Sie ein "Dummy-Modell" (das auch ein Silikonkautschuk-3D-Carotismodell ist, das nur zum Waschen ohne kultivierte Zellen verwendet wird) anstelle des Carotismodells und spülen Sie das System aus. Fügen Sie weitere 1 L Wasser hinzu und waschen Sie das System erneut, bis das gesamte Wasser aus dem Waschbehälter in den Abfall überführt ist. Schalten Sie die Peristaltikpumpe aus.

6. Datenerfassung und -analyse

1. Erfassen Sie einen digitalen Film der Partikelablagerung im interessierende Bereich mit den während des Experiments aufgenommenen Bildern mit einem benutzerdefinierten Softwarecode (siehe Materialtabelle).
2. Für die Abbildung der Ablagerung der Partikel entlang des Modells kacheln Sie mehrere Bilder, um den untersuchten Bereich von Interesse abzudecken (Abbildung 4A, B).
   HINWEIS: Ein benutzerdefinierter Softwarecode kann geschrieben werden, um die Anzahl der anhaftenden Partikel an einem interessanten Ort zu quantifizieren (eine Beispieldatei wurde als ergänzende Informationbereitgestellt)¹⁷.

Ergebnisse

Dieser Artikel stellt ein neues Protokoll vor, um die Ablagerung von Partikeln in realen 3D-Modellen menschlicher Arterien abzubilden, die eine neue Plattform für die Erforschung der Wirkstoffabgabe bieten könnten. Mit Hilfe einer 3D-Drucktechnik wurde ein Modell der menschlichen Karotisverzweigungsarterie hergestellt (Abbildung 2). Das Modell wurde aus Silikonkautschuk gefertigt und mit menschlichen ECs ausgesät (Abbildung 3). Wichtig ist, dass dieses Protok...

Diskussion

Aktuelle Ansätze zur Untersuchung des vaskulären Targetings von Partikeln versagen bei der Replikation der physiologischen Bedingungen im menschlichen Körper. Hier wird ein Protokoll zur Herstellung von 3D-rekonstruierten Modellen menschlicher Arterien vorgestellt, um das Partikel-Targeting auf die ECs zu untersuchen, die die Arterie unter physiologischem Fluss auskleiden, der mit einem maßgeschneiderten Perfusionssystem angewendet wird. Bei der Auswahl des Materials für den 3D-Druck ist es am besten, einen klaren K...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D printer	FormLabs	PKG-F2-REFURB
Acetone, absolute (AR grade)
Connectors	Nordson Medical	FTLL013-1	Female Luer
		FTLL230-1	Female Luer
		FTLL360-1	Female Luer
		LP4-1	Male Luer Integral Lock
Damper	Thermo-Fisher Scientific	DS2127-0250	Nalgene Polycarbonate, Validation Bottle
Damper Cover	Thermo-Fisher Scientific	2162-0531	Nalgene Filling/Venting Closures
Elastosil Elastosil RT 601 A	Wacker	60003805
Elastosil RT 601 B	Wacker	60003817	The crosslinker
Endothelial Cell Media	ScienCell	1001
Fibrontectin	Sigma Aldrich	F0895-5mg
HUVEC	Lonza	CC-2519
Isopropyl alcohol, AR grade 99.5%			Remove plastic dust from the sanded model
Lacquer	Rust-Oleum		2X-Ultra cover Gloss Clear
Matlab	Mathworks		https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Microscope	Nikon	SMZ25
Microscope Camera	Nikon	DS-Qi2
Peristaltic pump	Watson Marlow	530U IP31	With 2 pumpheads: 313D
Plastic tube clamp	Quickun	1-2240-stopvalve-2pcs
Polystyrene Particles	Thermo-Fisher Scientific	F8827	Diameter = 2 µm
Printer resin	FormLabs	RS-F2-GPCL-04
Rotator	ELMI Ltd.		Intelli-Mixer RM-2
Solidworks	SolidWorks Corp., Dassault Systèmes		https://www.solidworks.com/
Tubing	Watson Marlow	933.0064.016	Tubing for the pump: 6.4 mm ID
All the other tubing: Silicon tubing: 4 mm ID