Erzeugung und Kultur von lingualen Organoiden aus adulten Mausgeschmacksstammzellen

Zusammenfassung

Das Protokoll stellt eine Methode zur Kultivierung und Verarbeitung von lingualen Organoiden vor, die aus Geschmacksstammzellen gewonnen werden, die aus der hinteren Geschmackspapille erwachsener Mäuse isoliert wurden.

Zusammenfassung

Der Geschmackssinn wird durch Geschmacksknospen auf der Zunge vermittelt, die sich aus sich schnell erneuernden Geschmacksrezeptorzellen (TRCs) zusammensetzen. Dieser kontinuierliche Umsatz wird von lokalen Vorläuferzellen angetrieben und macht die Geschmacksfunktion anfällig für Störungen durch eine Vielzahl von medizinischen Behandlungen, was wiederum die Lebensqualität stark beeinträchtigt. Daher ist die Untersuchung dieses Prozesses im Kontext der medikamentösen Behandlung von entscheidender Bedeutung, um zu verstehen, ob und wie die Funktion des Geschmacksvorläufers und die TRC-Produktion beeinflusst werden. Angesichts der ethischen Bedenken und der begrenzten Verfügbarkeit von menschlichem Geschmacksgewebe werden häufig Mausmodelle verwendet, die ein ähnliches Geschmackssystem wie der Mensch haben. Im Vergleich zu In-vivo-Methoden, die zeitaufwendig, teuer und für Hochdurchsatzstudien nicht nutzbar sind, können murine linguale Organoide experimente mit vielen Replikaten und weniger Mäusen schnell durchführen. Hier wurden zuvor veröffentlichte Protokolle angepasst und eine standardisierte Methode zur Erzeugung von Geschmacksorganoiden aus Geschmacksvorläuferzellen vorgestellt, die aus der Circumvallat-Papille (CVP) erwachsener Mäuse isoliert wurden. Geschmacksvorläuferzellen im CVP exprimieren LGR5 und können mittels EGFP-Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) von Mäusen isoliert werden, die ein Lgr5^{EGFP-IRES-CreERT2-Allel} tragen. Sortierte Zellen werden auf ein Matrix-Gel-basiertes 3D-Kultursystem auf plattiert und 12 Tage lang kultiviert. Organoide dehnen sich für die ersten 6 Tage der Kulturperiode durch Proliferation aus und treten dann in eine Differenzierungsphase ein, in der sie alle drei Geschmackszelltypen zusammen mit Nicht-Geschmacksepithelzellen erzeugen. Organoide können bei der Reifung am Tag 12 oder jederzeit während des Wachstumsprozesses für die RNA-Expression und immunhistochemische Analyse entnommen werden. Die Standardisierung von Kulturmethoden zur Herstellung von lingualen Organoiden aus adulten Stammzellen wird die Reproduzierbarkeit verbessern und linguale Organoide als leistungsfähiges Arzneimittel-Screening-Werkzeug im Kampf gegen Patienten mit Geschmacksstörungen fördern.

Einleitung

Bei Nagetieren sind linguale Geschmacksknospen in fungiformen Papillen untergebracht, die anterior verteilt sind, bilaterale Blattpapillen nach dem Hinterteil sowie eine einzelne zirkumvallate Papille (CVP) an der posterodorsalen Mittellinie der Zunge¹. Jede Geschmacksknospen besteht aus 50-100 kurzlebigen, sich schnell erneuernden Geschmacksrezeptorzellen (TRCs), zu denen gliaartige Unterstützungszellen vom Typ I, Zellen vom Typ II, die süße, bittere und Umami erkennen, und Typ III-Zellen, die saure²,^3,4erkennen , umfassen. Im CVP der Maus produzieren LGR5⁺ Stammzellen entlang der Basallamina alle TRC-Typen sowie Nicht-Geschmacksepithelzellen⁵. Bei der Erneuerung der Geschmackslinie werden LGR5-Tochterzellen zunächst als postmiotische Geschmacksvorläuferzellen (Typ IV-Zellen) spezifiziert, die in eine Geschmacksknospen eintreten und in der Lage sind, sich in einen der drei TRC-Typen^{6 zu}differenzieren. Der schnelle Umsatz von TRCs macht das Geschmackssystem anfällig für Störungen durch medizinische Behandlungen, einschließlich Bestrahlung und bestimmter medikamentöser Therapien^{7,8,9,10,11,12,13}. Daher ist die Untersuchung des Geschmackssystems im Kontext der Regulierung von Geschmacksstammzellen und der TRC-Differenzierung von entscheidender Bedeutung, um zu verstehen, wie Geschmacksstörungen gemildert oder verhindert werden können.

Mäuse sind ein traditionelles Modell für In-vivo-Studien in der Geschmackswissenschaft, da sie ein Geschmackssystem haben, das ähnlich wie Menschen organisiert ist^14,15,16. Mäuse sind jedoch nicht ideal für Studien mit hohem Durchsatz, da sie teuer in der Wartung und zeitaufwendig in der Arbeit sind. Um dies zu überwinden, wurden in den letzten Jahren in vitro Organoidkulturmethoden entwickelt. Geschmacksorganoide können aus nativem CVP-Gewebe erzeugt werden, einem Prozess, bei dem Organoide aus isoliertem Maus-CVP-Epithel abknabknabken, das ex vivo¹⁷kultiviert wird. Diese Organoide zeigen ein mehrschichtiges Epithel, das mit dem In-vivo-Geschmackssystem übereinstimmt. Ein effizienterer Weg zur Erzeugung von Organoiden, die keine Ex-vivo-CVP-Kultur erfordern, wurde von Ren etal. im Jahr 2014¹⁸entwickelt. Sie adaptierten Methoden und Nährmedien, die zuerst entwickelt wurden, um Darmorganoide zu züchten, isolierten einzelne Lgr5-GFP⁺ Vorläuferzellen aus Maus-CVP und plattierten sie mit Matrixgel¹⁹. Diese einzelnen Zellen erzeugten linguale Organoide, die sich während der ersten 6 Tage der Kultur vermehren, beginnen sich um Tag 8 zu differenzieren und enthalten am Ende der Kulturperiode nicht schmeckende Epithelzellen und alle drei TRC-Typen^18,20. Bis heute wurden mehrere Studien veröffentlicht, die das linguale Organoidmodellsystem verwenden^{17,18,20,21,22}; Die Methoden und Kulturbedingungen, die zur Erzeugung dieser Organoide verwendet werden, variieren jedoch je nach Veröffentlichung (Ergänzende Tabelle 1). Daher wurden diese Methoden hier angepasst und optimiert, um ein detailliertes standardisiertes Protokoll für die Kultur von lingualen Organoiden zu präsentieren, die von LGR5⁺ Vorläufern der adulten Maus CVP abgeleitet sind.

Linguale Organoide bieten ein einzigartiges Modell für die Untersuchung der zellbiologischen Prozesse, die die Entwicklung und Erneuerung von Geschmackszellen vorantreiben. Da sich die Anwendungen von lingualen Organoiden ausweiten und immer mehr Labore sich der Verwendung von In-vitro-Organoidmodellen zuwenden, ist es wichtig, dass das Feld bestrebt ist, standardisierte Protokolle zu entwickeln und einzuführen, um die Reproduzierbarkeit zu verbessern. Die Etablierung von lingualen Organoiden als Standardwerkzeug in der Geschmackswissenschaft würde Hochdurchsatzstudien ermöglichen, die auseinandernehmen, wie einzelne Stammzellen die differenzierten Zellen des adulten Geschmackssystems erzeugen. Darüber hinaus könnten linguale Organoide eingesetzt werden, um Medikamente schnell auf mögliche Auswirkungen auf die Geschmacksöostase zu untersuchen, die dann in Tiermodellen gründlicher untersucht werden könnten. Dieser Ansatz wird letztendlich die Bemühungen verstärken, Therapien zu entwickeln, die die Lebensqualität zukünftiger Arzneimittelempfänger verbessern.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden in einer AAALAC-akkreditierten Einrichtung in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren, dem Tierschutzgesetz und der Richtlinie des öffentlichen Gesundheitsdienstes durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am Anschutz Medical Campus der University of Colorado genehmigt. Lgr5^{EGFP-IRES-CreERT2} Mäuse, die in diesem Protokoll verwendet werden, stammen vom Jackson Laboratory, Stock No. 008875.

HINWEIS: Die folgenden Schritte sollten vor Beginn abgeschlossen werden, um einen reibungslosen und rechtzeitigen Ablauf des Protokolls zu gewährleisten: Wasserbad auf 37 ° C einstellen, Zentrifuge auf 4 ° C einstellen, Injektions- und Dissoziationsenzymlösungen aus den 10 mg / ml Dispase-, Kollagenase- und Elastase-Stammlösungen herstellen (siehe Materialtabelle),Matrixgel aus dem Gefrierschrank mit -20 ° C entfernen (~ 750 μL für eine 48-Well-Platte erforderlich) und auftauen, indem Sie die Durchstechflasche in Eis tauchen für bei mindestens 3-4 h, Mikrozentrifugenröhrchen in unverdünntem FBS durch sanftes Schaukeln bei Raumtemperatur für mindestens 30 min vorbeschichten (zwei 2-ml-Röhrchen für die Gewebeentnahme, zwei 1,5-ml-Röhrchen für dissoziierte Zellen und ein 1,5-ml-Röhrchen für die Sammlung einzelner Zellen aus dem Zellsortierer; überschüssiges FBS vor Gebrauch entfernen).

1. Isolierung des CVP-Epithels

HINWEIS: Um genügend LGR5⁺ -Zellen für eine vollständige 48-Well-Platte zu erhalten, sammeln Sie drei Lgr5-EGFP-CVPs in derselben Röhre und verarbeiten Sie sie gleichzeitig. Wichtig ist, dass Sie das CVP von mindestens einem Wildtyp-Littermat parallel in einem separaten Rohr ernten und verarbeiten und es als Gating-Kontrolle zum Einstellen von FACS-Parametern verwenden (siehe Repräsentative Ergebnisse).

1. Euthanisieren Sie die Mäuse mit CO 2-Erstickung gemäß den IACUC-Vorschriften, gefolgt von einer zugelassenen Sekundärmethode wie bilateraler Thorakotomie, zervikaler Dislokation, Enthauptung oder Exsanguination.
2. Verwenden Sie eine große sterile Dissektionsschere, um die Wangen zu schneiden und den Kiefer zu brechen. Heben Sie die Zunge an und schneiden Sie das linguale Frenulum, um die Zunge vom Boden der Mundhöhle zu trennen. Schneiden Sie die Zunge aus und sammeln Sie sie in steriler eiskalter Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (dPBS) mit Ca²⁺ und Mg²⁺.
3. Entfernen und entsorgen Sie die vordere Zunge, indem Sie nur die intermolare Eminenz mit einer Rasierklinge vorn schneiden (Abbildung 1A, gestrichelte Linie). Verwenden Sie ein zartes Aufgabentuch, um Haare und überschüssige Flüssigkeit von der hinteren Zunge zu entfernen.
4. 1 ml Spritze mit 200-300 μL Injektionsenzymlösung füllen (Endkonzentration: 2 mg/ml Typ-I-Kollagenase und 5 mg/ml Dispase II in Ca^2+/Mg2+-haltige dPBS, verdünnt aus 10 mg/ml Stammlösungen) und eine 30 G x 1/2 Nadel knapp über der intermolaren Eminenz(Abbildung 1B,schwarzer Pfeil)bis knapp vor dem CVP einsetzen(Abbildung 1B), Black Box). Injizieren Sie die Enzymlösung unter und an den seitlichen Rändern des CVP zwischen dem Epithel und den darunter liegenden Geweben (Lamina propria, Muskel). Ziehen Sie die Spritze langsam und kontinuierlich aus der Zunge, während die Injektion durchgeführt wird.
5. Inkubieren Sie die Zunge in sterilem Ca²⁺/Mg²⁺-freiem dPBS bei Raumtemperatur für genau 33 min.
6. Machen Sie kleine Schnitte im Epithel bilateral und nur vor dem CVP mit einer extra feinen Dissektionsschere und schälen Sie das Epithel vorsichtig, indem Sie es mit einer feinen Zette anheben. Sobald das Grabenepithel frei vom darunter liegenden Bindegewebe ist, legen Sie es in ein leeres 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, das mit FBS vorbeschichtet ist. Führen Sie das Epitheltrimmen vor oder nach dem Ablösen des CVP-Epithels durch (Abbildung 1C, D).

2. Dissoziation des CVP-Epithels

HINWEIS: Dissoziation des CVP-Epithels und Beschichtung sind in Abbildung 2grafisch dargestellt.

1. Der Dissoziationsenzymcocktail (Endkonzentration: 2 mg/ml Typ-I-Kollagenase, 2 mg/ml Elastase und 5 mg/ml Dispase II in Ca^2+/Mg2+-enthaltend dPBS, verdünnt aus 10 mg/ml Stammlösungen) wird in Röhrchen mit geschälten CVP-Epithelien (200 μL pro CVP) geben. Inkubieren Sie in einem 37 °C Wasserbad für 45 min. Wirbel kurz alle 15 min.
   HINWEIS: 0,25% Trypsin-EDTA im 37 °C Wasserbad während der letzten 15 Minuten der Enzymcocktail-Inkubation vorwärmen.
2. Nach der Inkubation, Wirbel (drei Impulse) dann triturate mit einer Glas-Pasteur-Pipette für 1 min. Nachdem sich die Gewebestücke absetzen, pipetten Sie den Überstand, der die erste Sammlung dissoziierter Zellen enthält, in neue FBS-beschichtete 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, die dem Genotyp entsprechen. Verarbeiten Sie die verbleibenden Gewebestücke wie in Schritt 2.3 beschrieben weiter. unter.
   1. Den Überstand für 5 min bei 370 x g und 4 °C zu Pelletzellen drehen.
   2. Entfernen Sie den resultierenden Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) Puffer (1 mM EDTA, 25 mM HEPES (pH 7,0) und 1% FBS in Ca²⁺/Mg²⁺-freiem PBS (50 μL pro CVP)). Auf Eis lagern.
3. Bei der Durchführung der Schritte 2.2.1 und 2.2.2 dissoziieren Sie die verbleibenden Gewebestücke aus Schritt 2.2, indem Sie den ursprünglichen 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen vorgewärmte 0,25% Trypsin-EDTA (200 μL pro CVP) zugaben und in einem 37 °C-Wasserbad für 30 min inkubieren. Wirbel kurz alle 10 min.
4. Nach der Inkubation das Röhrchen mit den Gewebestücken (drei Impulse) vortexen und dann mit einer Pasteur-Pipette aus Glas für 1 min triturieren. Nachdem sich die Gewebestücke absetzen, wird der Überstand in die 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen pipettet, die Zellen aus Schritt 2.2.2 enthalten. Entsorgen Sie die Röhrchen mit den verbleibenden Gewebestücken.
   1. Die Röhrchen mit dissoziierten Zellen 5 min bei 370 x g und 4 °C zu Pelletzellen drehen.
   2. Entfernen Sie den Überstand und die Zellpellets in FACS Buffer (100 μL pro CVP). Auf Eis lagern.
5. Führen Sie die Zellen durch einen 30 μm Nylon-Mesh-Filter und fügen Sie DAPI (λ_Emission = 450 nm) vor DEM FACS zu Zellmischungen hinzu. Isolieren Sie Lgr5-GFP⁺ Zellen über FACS unter Verwendung des grün fluoreszierenden Proteinkanals (λ_Anregung = 488 nm; λ_Emission = 530 nm). Sortieren Sie die Zellen mit einer 100 μm-Düse in ein frisches FBS-beschichtetes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 300 μL Ca^2+/Mg2+ freiem dPBS. Legen Sie die Zellen bis zur Beschichtung auf Eis.

3. Beschichtung von Lgr5-EGFP-Zellen

1. Bestimmen Sie das Volumen der LGR5⁺ Zellsuspension, die vom Durchflusszytometer empfangen wird.
2. Berechnen Sie basierend auf der Anzahl der Zellen, die vom Sortierer erhalten wurden, die Anzahl der Zellen pro μL. Bestimmen Sie dann das Volumen, das benötigt wird, um die gewünschte Anzahl von Zellen für die Beschichtung zu erhalten (wir verwenden 200 Zellen pro Vertiefung einer 48-Well-Platte) und übertragen Sie dieses Gesamtvolumen der suspendierten Zellen in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen.
3. Drehen Sie das Röhrchen für 5 min bei 370 x g und 4 °C zu Pelletzellen (Pellet ist möglicherweise nicht sichtbar). Entfernen Sie den Überstand und legen Sie das Rohr auf Eis.
4. Das Zellpellet vorsichtig in der entsprechenden Menge Matrixgel (15 μL pro Vertiefung für 48-Well-Platten) wieder aufschnappen; Pipette sanft auf und ab, um die Zellen in Matrixgel gründlich zu verteilen. Legen Sie 15 μL Matrixgel/Zell-Mischung in die Mitte jeder Vertiefung. Halten Sie das Mikrozentrifugenröhrchen während der Beschichtung in einem konischen 50-ml-Röhrchen auf Eis, um zu verhindern, dass Matrixgel geliert. Mischen Sie weiterhin die Matrixgel/Zell-Mischung während der gesamten Beschichtung, indem Sie alle drei Vertiefungen auf und ab pipettieren, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen über die Vertiefungen zu gewährleisten.
5. Legen Sie die Platte für 10 min in den Inkubator (37 °C, 5% CO_2,~95% Luftfeuchtigkeit), damit matrix geliert werden kann. Dann fügen Sie 300 μL WENRAS + Y27632-Medien bei Raumtemperatur in jede Vertiefung hinzu und geben Sie die Platte in den Inkubator zurück.

4. Organoid-Erhaltung

HINWEIS: Organoide werden in herkömmlichen organoiden Medien (WENR) gezüchtet, die rekombinante EGF und 50% konditionierte Medien enthalten, die Wnt3a, Noggin und R-Spondin²³enthalten. Die Medikamente A8301 und SB202190 werden für die ersten 6 Tage der Kulturperiode hinzugefügt, um das Wachstum zu optimieren (WENRAS-Medien)(Abbildung 5),dann entfernt, um die Differenzierung zu fördern (WENR-Medien)²⁰. Y27632 wird für die ersten 2 Tage der Kultur hinzugefügt, um das Überleben zu fördern. Die Medienbedingungen in Bezug auf die Kulturzeitleiste sind in Abbildung 4 dargestellt.

1. Entfernen Sie zwei Tage nach der Beschichtung weNRAS + Y27632-Medien aus jeder Vertiefung mit einer 1-ml-Pipette, um sicherzustellen, dass keine Kreuzkontamination besteht. Fügen Sie 300 μL WENRAS-Medien an der Seite des Brunnens hinzu, um das Matrixgel nicht zu stören. Bringen Sie die Platte in den Inkubator zurück.
2. Wechseln Sie die Medien alle 2 Tage, indem Sie die entsprechenden Medien für die Kulturphase verwenden (Abbildung 4). Halten Sie Organoide bis zum Tag 12, wenn die Organoide zur Ernte bereit sind.

5. RNA-Verarbeitung

1. Gewinnung von Organoiden für RNA
   1. Legen Sie die 48-Well-Platte für 30 Minuten auf Eis, um das Matrixgel zu depolymerisieren.
   2. Ziehen Sie mit einer 1 ml Pipette das organoide Medium hoch; Dann, wenn das Medium in den Brunnen zurückgeführt wird, verwenden Sie die Spitze der Pipette, um das Matrixgel zu zerkratzen und weiter aufzubrechen. Übertragen Sie den Inhalt in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und bündeln Sie den Inhalt von drei Vertiefungen in einem Rohr. Zentrifugieren Sie die Röhrchen für 5 min bei 300 x g bei Raumtemperatur.
   3. Entfernen Sie so viel Medienüberstand wie möglich, ohne Organoide zu entfernen; dann die Rohre erneut für 5 min bei 300 x g bei Raumtemperatur drehen.
   4. Entfernen Sie die verbleibenden Medien und resuspendieren Sie die Organoide in 350 μL Lysepuffer + β-Mercaptoethanol (βME) (10 μL βME pro 1 ml Lysepuffer). Legen Sie die Proben zur sofortigen RNA-Extraktion auf Eis oder lagern Sie sie bei -80 °C.
2. Quantitative RT-PCR-Analyse
   1. Messen Sie die RNA-Menge mit einem Spektralphotometer. Reverse-transkribierte RNA mit einem cDNA Synthesis Kit.
   2. Mischen Sie cDNA äquivalent zu 5 ng RNA mit 200 nM vorvalidierten Vorwärts- und Rückwärtsprimern (Tabelle 1) und fluoreszierendem PCR Master Mix. Führen Sie die qRT-PCR-Reaktion für 40 Zyklen bei 95 °C für 15 s, dann 60 °C für 60 s durch.

6. Immunhistochemie

1. Entnahme und Fixierung der Organoide
   1. 48-Well-Platte für 30 Minuten auf Eis legen, um das Matrixgel zu lösen.
   2. Entfernen Sie das organoide Medium und fügen Sie 400 μL eiskaltes PBS zu jeder Vertiefung hinzu. Entfernen Sie dann PBS und fügen Sie 400 μL eiskalte Zellrückgewinnungslösung zu jeder Vertiefung hinzu. 30 min sanft bei 4 °C schaukeln.
   3. Beschichten Sie eine 1 mL Pipettspitze mit 1% BSA in PBS und pipetieren Sie den Inhalt der Vertiefung vorsichtig nach oben und unten, um das Matrixgel aufzubrechen. Übertragen Sie die Organoide in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, das auf Eis gelegt wird.
   4. Spülen Sie jeden Brunnen mit 300 μL PBS + 1% BSA ab und übertragen Sie alle verbleibenden Organoide in die entsprechenden Röhrchen. Cell Recovery Solution/PBS + BSA aus jeder Tube entfernen. Fügen Sie 400 μL eiskaltes PBS hinzu und wiederholen Sie es dann mit einer weiteren eiskalten PBS-Spülung.
   5. PBS entfernen und Organoide mit 300 μL eiskaltem 4% PFA (in 0,1 M PB) für 20 min fixieren und bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie PFA und spülen Sie Organoide mit 400 μL eiskaltem PBS.
   6. PBS entfernen; Fügen Sie dann 400 μL PBS + 1% BSA hinzu. Bei 4 °C lagern.
2. Immunfluoreszenzfärbung
   1. Organoide in 500 μL PBS + 1% BSA ausspülen. Dann Organoide in Blockierungslösung (5% normales Ziegen- oder Eselserum, 1% Rinderserumalbumin, 0,3% Triton X 100 in 1x PBS pH 7,3) für 2 h inkubieren und bei Raumtemperatur sanft schaukeln.
   2. Die primäre Antikörperlösung (primäre Antikörper in Blockierungslösung verdünnt) fünken und 3 Nächte bei 4 °C vorsichtig einschlagen.
   3. Organoide 4x für 1 h mit 500 μL PBS + 0,2% Triton waschen und bei Raumtemperatur sanft schaukeln. Sekundäre Antikörperlösung (sekundäre Antikörper in Blocklösung verdünnt) und Gesteinsorganoide über Nacht, vor Licht geschützt, bei 4 °C hinzufügen.
   4. Organoide 3x für 1 h mit 500 μL PBS + 0,2% Triton waschen, lichtgeschützt und bei Raumtemperatur sanft schaukelnd. Mit DAPI verdünnt 1:10.000 in 0,1 M PB für 20 min inkubieren, schaukeln und bei Raumtemperatur abdecken.
   5. Die Organoide 3x 20 min mit 0,1 M PB waschen, sanft schaukeln und bei Raumtemperatur abdecken.
3. Objektträgermontage von Organoiden für die invertierte konfokale Mikroskopie.
   HINWEIS: Schritt-für-Schritt-Bilder des Diamontagevorgangs sind in Abbildung 7 dargestellt.
   1. Erstellen Sie einen ~ 1 mm dicken 22 x 22 mm quadratischen Umfang aus ungiftigem Modellierton auf einem Objektträger.
   2. Entfernen Sie 0,1 M PB aus dem Mikrozentrifugenröhrchen und entfernen Sie organoide vorsichtig in einem 100 μL-Montagemedium Ihrer Wahl. Dann in die Mitte des Tonquadrates übertragen.
   3. Füllen Sie das Tonquadrat, bis das Montagemedium fast bis zur Spitze ist. Dann 22 x 22 mm quadratischen Abdeckrlip über Ton legen und fest auf die Seiten des Coverlips drücken, um zu versiegeln. Gemäß Herstellerangaben aushärten lassen (hier Raumtemperatur 1-2 Tage) und bei 4 °C lagern.

Ergebnisse

Mäuse haben ein CVP, das sich posterior auf der Zunge befindet, aus dem LGR5⁺ Stammzellen isoliert werden können (Abbildung 1A, Black Box). Die Injektion einer Enzymlösung unter und um das CVP (Abbildung 1B) führt zu einer leichten Schwellung des Epithels und einer Verdauung des Bindegewebes. Eine ausreichende Verdauung wird nach einer 33-minütigen Inkubation erreicht, die eine einfache Trennung des CVP-Epithels vom darunter lieg...

Diskussion

Hier wird eine effiziente und leicht wiederholbare Methode zur Kultivierung, Aufrechterhaltung und Verarbeitung von lingualen Organoiden aus adulten Mausgeschmacksstammzellen berichtet. Es wurde festgestellt, dass die Verwendung von drei CVPs von 8 bis 20 Wochen alten Lgr5 -EGFP-Mäusen ausreicht, um ~ 10.000 GFP⁺ -Zellen für den experimentellen Einsatz zu erhalten, was zu 50 Wells mit einer Dichte von 200 Zellen pro Well in 48-Well-Platten führt. Die Entfernung von CVP-Grabenepithelien wird optimie...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgG	Molecular Probes	A11056, RRID: AB_142628	1:2000
Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgG	Molecular Probes	A11010, RRID:AB_2534077	1:2000
Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgG	Invitrogen	A11075, RRID:AB_2534119	1:2000
Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgG	Molecular Probes	A31573, RRID:AB_2536183	1:2000
Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgG	Molecular Probes	A21247, RRID:AB_141778	1:2000
DAPI (for FACS)	Thermo Fischer	62247
DAPI (for immunohistochemistry)	Invitrogen	D3571, RRID:AB_2307445	1:10000
Goat anti-CAR4	R&D Systems	AF2414, RRID:AB_2070332	1:50
Guinea pig anti-KRT13	Acris Antibodies	BP5076, RRID:AB_979608	1:250
Rabbit anti-GUSTDUCIN	Santa Cruz Biotechnology Inc.	sc-395, RRID:AB_673678	1:250
Rabbit anti-NTPDASE2	CHUQ	mN2-36LI6, RRID:AB_2800455	1:300
Rat anti-KRT8	DSHB	TROMA-IS, RRID: AB_531826	1:100
Equipment
2D rocker	Benchmark Scientific Inc.	BR2000
3D Rotator	Lab-Line Instruments	4630
Big-Digit Timer/Stopwatch	Fisher Scientific	S407992
Centrifuge	Eppendorf	5415D
CO2 tank	Airgas	CD USP50
FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 Incubator	Thermo Scientific	4110	184 L, Polished Stainless Steel
Incucyte	Sartorius	Model: S3	Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus
MoFlo XDP100	Cytomation Inc	Model: S13211997	Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus
Orbital Shaker	New Brunswick Scientific	Excella E1
Real-Time PCR System	Applied Biosystems	4376600
Refrigerated Centrifuge	Eppendorf	5417R
Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-1000
Stereomicroscope	Zeiss	Stemi SV6
Thermal Cycler	Bio-Rad	580BR
Vortex	Fisher Scientific	12-812
Water bath	Precision	51220073
Media
A83 01	Sigma	SML0788-5MG	Stock concentration 10 mM, final concentration 500 nM
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634-010
B27 Supplement	Gibco	17504044	Stock concentration 50X, final concentration 1X
Gentamicin	Gibco	15750-060	Stock concentration 1000X, final concentration 1X
Glutamax	Gibco	35050061	Stock concentration 100X, final concentration 1X
HEPES	Gibco	15630080	Stock concentration 100X, final concentration 1X
Murine EGF	Peprotech	315-09-1MG	Stock concentration 500 µg/mL, final concentration 50 ng/mL
Murine Noggin	Peprotech	250-38	Stock concentration 50 µg/mL, final concentration 25 ng/mL
N-acetyl-L-cysteine	Sigma	A9165	Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM
Nicotinamide	Sigma	N0636-100g	Stock concentration 1 M, final concentration 1 mM
Pen/Strep	Gibco	15140-122	Stock concentration 100X, final concentration 1X
Primocin	InvivoGen	ant-pm-1	Stock concentration 500X, final concentration 1X
SB202190	R&D Systems	1264	Stock concentration 10 mM, final concentration 0.4 µM
WRN Conditioned media			Received from Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Derived from L-WRN (ATCC® CRL-3276™) cells
Y27632 dihydochloride 10ug	APExBIO	A3008-10	Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM
Other
1 ml TB Syringe	BD Syringe	309659
2-Mercaptoethanol, min. 98%	Sigma	M3148-25ML	β-mercaptoethanol
2.0 mL Microcentrifuge Tubes	USA Scientific	1420-2700
48-well plates	Thermo Scientific	150687
5 3/4 inch Pasteur Pipets	Fisherbrand	12-678-8A
Albumin from bovine serum (BSA)	Sigma Life Science	A9647-100G
Buffer RLT Lysis buffer	QIAGEN	1015750
Cell Recovery Solution	Corning	354253
Cohan-Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-02
Collagenase from Clostridium histolyticum, type I	Sigma Life Science	C0130-1G
Cultrex RGF BME, Type 2, Pathclear	R&D Systems	3533-005-02	Matrigel
Dispase II (neutral protease, grade II)	Sigma-Aldrich (Roche)	4942078001
Disposable Filters	Sysmex	04-0042-2316
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X) (Ca2+ & Mg2+ free)	Gibco	10010-023
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline with Ca2+ & Mg2+	Sigma Life Sciences	D8662-500ML
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30
EDTA, 0.5M (pH 8.0)	Promega	V4231
Elastase Lyophilized	Worthington Biochemical	LS002292
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26140-079
Fluoromount G	SouthernBiotech	0100-01
HEPES Solution	Sigma Life Science	H3537-100ML
HyClone Tryspin 0.25% + EDTA	Thermo Scientific	25200-056
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad	1706691
Modeling Clay, Gray	Sargent Art	22-4084
Needle	BD Syringe	305106
Normal Donkey Serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Normal Goat Serum	Jackson ImmunoResearch	005-000-121
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
PowerSYBR Green PCR Master Mix	Applied Biosystems	4367659
RNeasy Micro Kit	QIAGEN	74004
Safe-Lock Tubes 1.5 mL	Eppendorf	022363204
Sodium Chloride	Fisher Chemical	7647-14-5
Sodium Phosphate dibasic anhydrous	Fisher Chemical	7558-79-4
Sodium Phosphate monobasic anhydrous	Fisher Bioreagents	7558-80-7
SuperFrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Surgical Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14002-14
Triton X-100	Sigma Life Science	T8787-100ML
VWR micro cover glass	VWR	48366067	22x22mm