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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt und demonstriert die Verabreichung von intranasalen Impfstoffen und die Sammlung von Milch von stillenden Kaninchen (Oryctolagus cuniculus) als Mittel zur Beurteilung der Schleimhautimmunität in einem translational geeigneten Modell der mütterlichen Immunisierung.

Zusammenfassung

Aufgrund von Ähnlichkeiten in der Plazentation und dem Antikörpertransfer mit dem Menschen sind Kaninchen ein hervorragendes Modell für die mütterliche Immunisierung. Weitere Vorteile dieses Forschungsmodells sind die einfache Züchtung und Probenentnahme, die relativ kurze Tragzeit und die großen Wurfgrößen. Häufig bewertete Immunisierungswege umfassen subkutane, intramuskuläre, intranasale und intradermale. Die nichtterminale Probenentnahme zum chronologischen Nachweis der immunologischen Reaktionen auf diese Impfungen umfasst die Entnahme von Blut sowohl von Muttertieren als auch von Kits sowie von Milch von der Stillzeit. In diesem Artikel werden wir Techniken demonstrieren, die unser Labor in Studien zur mütterlichen Immunisierung bei neuseeländischen Weißen Kaninchen (Oryctolagus cuniculus) verwendet hat, einschließlich intranatale Immunisierung und Milchsammlung.

Einleitung

Studien zur mütterlichen Immunisierung und zum Antikörpertransfer sind aus zahlreichen Gründen von unschätzbarem Wert, da dies der erste Weg des Immunitätstransfers und des anschließenden Schutzes vor Krankheitserregern und Krankheiten bei Neugeborenen und Säuglingen ist. Die Immunisierung von Müttern hat das Potenzial, sowohl die Gesundheit von Müttern als auch von Säuglingen/ Kindern auf globaler Ebene positiv zu beeinflussen, indem die Morbidität und Mortalität im Zusammenhang mit bestimmten Krankheitserregern während dieser anfälligen Periode reduziert wird1. Das Hauptziel dieser Strategie ist es, die Spiegel spezifischer mütterlicher Antikörper während der Schwangerschaft zu erhöhen. Diese Antikörper können dann auf das Neugeborene und den Säugling in einem Niveau übertragen werden, das ausreicht, um vor Infektionen zu schützen, bis sein Immunsystem reif genug ist, um angemessen auf die Herausforderungen1,2,3zu reagieren. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass höhere Antikörpertiter bei der Geburt entweder mit einem vollständigen Schutz oder einem verzögerten Auftreten und einer reduzierten Schwere zahlreicher verschiedener Infektionskrankheiten beim Neugeborenen verbunden sind, einschließlich Tetanus, Pertussis, respiratorisches Synzytialvirus (RSV), Influenza und Streptokokkeninfektionen der Gruppe B1,2,3.

Beim Menschen werden mütterliche Antikörper passiv über die Plazenta übertragen und über das Stillen auch durch die Muttermilch übertragen. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass HIV-spezifische IgA-Spiegel in der mutterstillenden Muttermilch von müttern, die mit dem Virus infiziert waren, mit einer reduzierten postnatalen Übertragung des Virus verbunden waren, was auf eine schützende Rolle für Muttermilch gegen HIV IgA4hindeutet. Studien an nichtmenschlichen Primaten haben gezeigt, dass eine Immunisierung gegen HIV eine signifikante Antikörperreaktion in der Muttermilch auslösen kann, und obwohl ähnliche Serum-IgG-Reaktionen nach systemischer versus Schleimhautimmunisierung induziert wurden, induzierte die Schleimhautimmunisierung eine signifikant höhere IgA-Reaktion in der Milch5,6.

Bei der Identifizierung eines translational geeigneten Tiermodells für diese Studien sollten die Plazentationsart und die Mechanismen des passiven Antikörpertransfers sowie der Transfer von Antikörpern durch die Muttermilch berücksichtigt werden. Es gibt drei Haupttypen der Plazentation bei Säugetieren, basierend auf den Gewebetypen und Schichten an der materno-fetalen Grenzfläche, einschließlich Hämochorial (Primaten, Nagetiere und Kaninchen), Endotheliochorial (Fleischfresser) und Epitheliochorial (Pferde, Schweine und Wiederkäuer). Die hämochoriale Plazenta ist der invasivste Typ, der eine direkte Kommunikation zwischen der mütterlichen Blutversorgung und dem Chorion oder der äußersten fetalen Membran ermöglicht. Basierend auf der Anzahl der Trophoblastenschichten gibt es mehrere Variationen der hämochorialen Plazentation, einschließlich der hämomonochorialen Plazenta bei Primaten, der hämodichorialen Plazenta bei Kaninchen und der hämotrichorialen Plazenta, die bei Ratten und Mäusen beobachtet wird7. Dieser direkte Kontakt zwischen mütterlicher Blutversorgung und Chorion ermöglicht den passiven Transfer von Antikörpern über die Plazenta während der Schwangerschaft. IgG ist die einzige Antikörperklasse, die die menschliche Plazenta8signifikant durchquert, während IgA die vorherrschende Klasse von Ig in der menschlichen Muttermilchist 9. Von den wissenschaftlich relevanten Modellen übertragen nur Primaten (einschließlich Menschen), Kaninchen und Meerschweinchen IgG in utero und IgA in der Milch10,11. Daher enthält das Kaninchenmodell Faktoren, die mit denen beim Menschen vergleichbar sind, die den transplazentaren Transfer von IgG und den Laktationstransfer von IgA steuern.

Neben der Funktion als außergewöhnliches Modell für die mütterliche Immunität und Impfstoffentwicklung machen Ähnlichkeiten zwischen dem Kaninchen und den menschlichen Nasenhöhlen sie zu einem geeigneten Modell für die intranasale Immunisierung. Das Volumen der Kaninchennasenhöhle ist dem Menschen ähnlicher als Nagetiermodelle, die auf der relativen Körpermasse basieren12. Darüber hinaus zeigten Casteleyn et al. 12, dass das nasenbegbundene lymphatische Gewebe (NALT) beim Kaninchen im Vergleich zu Nagetieren voluminöser ist. Die NALT befindet sich hauptsächlich am ventralen und ventromedialen Aspekt des ventralen Nasenfleisches und am lateralen und dorsolateralen Aspekt des Nasopharynxfleisches bei Kaninchen, während bei Nagetieren das lymphatische Gewebe nur entlang des ventralen Aspekts des nasopharyngealen meatus vorhanden ist12. Bei Kaninchen ähneln strukturell und lage der intraepithelialen und lamina propria lymphatischen Lymphozyten sowie der isolierten lymphatischen Follikel dem Menschen12.

Weitere Vorteile der Verwendung des Kaninchens als Modell für die mütterliche und mukosale Immunität sind ihre hohe Fruchtbarkeit und relativ kurze Tragzeit. Große aurikuläre Blutgefäße ermöglichen einen relativ einfachen Zugang zu großen Blutmengen für serielle Sammlungen. Eine Vielzahl von Schleimhautproben kann für antigenspezifische Antikörper-Response-Assays gesammelt werden, einschließlich Muttermilch13 (beim Stillen), Schleimhautsekreten oder Waschungen (z. B. oral14,15,16, bronchoalveoläre Lavage13,17,18,19, vaginal20,21,22) und Kot20,23,24,25. Milchproben können während der Stillzeit leicht gesammelt werden, um das Vorhandensein antigenspezifischer Antikörperreaktionen zu beurteilen. Obwohl nicht so reichlich wie bei Menschen und Mäusen, steht eine Vielzahl von experimentellen Reagenzien für kaninchenspezifische Studien und Assays zur Verfügung. In diesem Artikel werden wir die intranasale Immunisierung und Milchsammlung bei neuseeländischen Weißen Kaninchen (Oryctolagus cuniculus )beschreiben und demonstrieren.

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Protokoll

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den IACUC-Richtlinien der Duke University genehmigt und durchgeführt.

HINWEIS: Benötigte Materialien sind in der Materialtabelle angegeben.

1. Kaninchensedierung und Anästhesie

  1. Sedieren Sie das weibliche Kaninchen (geschlechtsreif; ca. 5-30 Monate alt) durch intramuskuläre Verabreichung von Acepromazin (IM) in einer Dosis von 1 mg/kg. Je nach Größe des Tieres verwenden Sie eine 1 oder 3 ml Spritze mit einer 25 G Nadel. Die Epaxialmuskulatur ist die bevorzugte Stelle der intramuskulären Injektion.
    HINWEIS: Acepromazin kann auch subkutan verabreicht werden, aber IM wird vom Labor bevorzugt, da es schneller wirkt und die Inzidenz von Hautläsionen reduziert.
  2. Warten Sie 10-15 Minuten, damit das Acepromazin wirksam wird.
  3. Betäuben Sie das Kaninchen mit Isofluran, indem Sie den verbundenen Nasenkegel über die Nase des Tieres legen. Stellen Sie den Vaporizer auf bis zu 4% Isofluran in Kombination mit bis zu 4 Litern / Minute Sauerstoff ein. Kaninchen haben eine hohe Abneigung gegen Isofluran, so dass bei der Maskierung des Tieres eine angemessene Zurückhaltung erforderlich ist.
  4. Nach der vollständigen Betäubung, wie durch die Pinna, das Pedal und / oder den palpebralen Reflex beurteilt, tragen Sie ophthalmisches Gleitmittel auf jedes Auge auf, um das Austrocknen der Augen und nachfolgende Hornhautgeschwüre zu verhindern.
  5. Überwachen Sie kontinuierlich die Reflexe und die Atmung während der Anästhesie und reduzieren Sie die Isofluranrate auf 1-2%, sobald eine angemessene Anästhesieebene erreicht wurde.

2. Intranasale Immunisierung

  1. Bereiten Sie die Impflösung vor dem Umgang mit Tieren vor.
  2. Sedieren Sie das Kaninchen wie oben beschrieben.
  3. Sobald das Labormitglied bereit ist, den Impfstoff zu verabreichen und sich das Kaninchen in einer angemessenen Anästhesieebene befindet, schalten Sie das Isofluran und den Sauerstoff aus und entfernen Sie den Nasenkegel.
  4. Legen Sie das Kaninchen in die dorsale Liege und stützen Sie Hals und Kopf in einem Winkel von etwa 45 °, der einen einfachen Zugang und die Visualisierung beider Nares durch das Labormitglied ermöglicht, das den Impfstoff verabreicht.
  5. Laden Sie die Pipette mit nicht mehr als 100 μL der Impfstofflösung und verabreichen Sie die Lösung schnell in jedes Nasenloch. Die Pipette sollte in einem Winkel von etwa 45° gehalten werden, der zum medialen Aspekt des Nasengangs geneigt ist.
    HINWEIS: Das Ziel der Immunisierung ist es, dass die Lösung die Schleimhaut der Nares berührt, daher sollte die Spitze nicht in den Nares platziert werden, da dies zu Abrieb oder Reizung des Schleimhautgewebes führen und möglicherweise die Immunogenität des nasal verabreichten Impfstoffs beeinflussen kann. Der Impfstoff sollte schnell verabreicht und auf die gleiche Weise in der anderen Nare durchgeführt werden.
  6. Nach der Verabreichung in beiden Nasengängen halten Sie das Kaninchen 30 Sekunden lang in dorsaler Liege, um das Austreten der Impfstofflösung zu minimieren.
    HINWEIS: Das Labor verabreicht in der Regel nicht mehr als 100 μL pro Nasenloch gleichzeitig. Wenn ein größeres Volumen mit einer maximalen Gesamtmenge von 500 μL verabreicht werden soll, kann der Impfstoff in 100 μL Aliquoten mit einer 30-sekundenigen Ruhezeit zwischen den Impfungen und zusätzlichen Impfstoffverabreichungen wiederholt werden, wobei 30 Sekunden Ruhe zwischen jeder Verabreichung erfolgen, bis das gesamte Impfstoffvolumen abgegeben wird.
  7. Legen Sie das Kaninchen nach der Immunisierung zur Genesung auf das Ventrum und überwachen Sie das Tier genau, bis es die sternale Liegehaltung aufrechterhalten kann.

3. Milchabholung

  1. Sedieren Sie das stillende Kaninchen wie oben beschrieben.
  2. Reinigen Sie die Haut über der Randvene des Ohres mit dem Alkoholtupfer / -tuch.
  3. Mit einer 1 ml Spritze und einer 25 g Nadel ca. 1-2 IE Oxytocin intravenös über die marginale Ohrvene verabreichen, um eine Milchentlassung zu induzieren.
    HINWEIS: Aufgrund der Entspannung der glatten Muskulatur ist es üblich, dass das Kaninchen nach der Verabreichung von Oxytocin uriniert oder defäkiert.
  4. Nach der Verabreichung von Oxytocin mit dem Stück Gaze Druck auf die Injektionsstelle ausüben.
  5. Während Sie die Anästhesiemaske über der Nase des Kaninchens halten, stützen Sie das Kaninchen auf seine Hinterhand.
    HINWEIS: Die Milchsammlung kann auch mit dem Tier in seitlicher Liege durchgeführt werden, aber das Labor stellt fest, dass die Sammlung einfacher ist, wenn das Kaninchen auf seinem Hintern gestützt wird, wobei ein Assistent das Kaninchen mit der Anästhesiemaske aufrecht hält.
  6. Öffnen Sie das sterile Röhrchen, um sich auf die Milchsammlung vorzubereiten, und lokalisieren Sie das Brustgewebe und die zugehörigen Zitzen. Die Zitzen sind typischerweise von nassem Fell aus der jüngsten Stillzeit umgeben, und das Brustgewebe ist leicht tastbar, wenn es voller Milch ist.
  7. Greifen Sie das Brustgewebe, das mit einer Zitze zwischen Daumen und Zeigefinger verbunden ist, und drücken Sie einen sanften, massierenden Druck auf das Drüsengewebe in Richtung der Zitze aus. Legen Sie das Auffangrohr über die Zitze, um die abgepumpte Milch zu sammeln.
    HINWEIS: Es kann manchmal mehrere Minuten dauern, bis das Oxytocin wirksam ist, und die Milchproduktion scheint zwischen den Brustdrüsen zu variieren. Wenn die Milchexpression nicht erfolgreich ist, warten Sie einige Minuten oder drehen Sie sich zu den zusätzlichen Brustdrüsen. Milch aus allen Zitzen kann in derselben Durchstechflasche gesammelt werden. Typischerweise können mehrere Milliliter Milch leicht von einem stillenden Doe gesammelt werden.
  8. Schalten Sie nach der Milchsammlung das Isofluran und den Sauerstoff aus und lassen Sie das Kaninchen sich erholen, während es engmaschig überwacht wird, bis das Tier in der Lage ist, die sternale Liege zu erhalten.

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Ergebnisse

Ein Überblick über ein typisches design einer mütterlichen intranasalen Immunisierungsstudie ist in Abbildung 1dargestellt, die die Immunisierungen, Züchtung, Anzündung, Laktation und Antikörpertransfer umfasst. Obwohl nicht dargestellt, sollte Blut vor der ersten Immunisierung für Baseline-Messungen und während des restlichen Verlaufs der Studie in regelmäßigen Abständen entnommen werden. Blut wird leicht über die zentrale Ohrarterie mit leichter Sedierung und einem topischen An...

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Diskussion

Obwohl im obigen Protokoll nicht beschrieben, ist eine erfolgreiche Zucht der Kaninchen für dieses mütterliche Modell und für die Milchsammlung notwendig. Kaninchen können leicht durch Live-Deckung in einer Forschungsumgebung gezüchtet werden. Es wird empfohlen, dass sie zur Zucht in den Käfig des Bocks überführt werden, da dies territorial und aggressiv sein kann, wenn sie mit dem Bock in ihrem eigenen Käfig gehalten werden. Wenn Weibchen nach 15 Minuten nicht empfänglich sind (wie durch Weglaufen oder Vokalis...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Danksagungen

Die Autoren möchten der Abteilung für Labortierressourcen an der Duke University und ihrem Haltungsteam für ihre Unterstützung und große Sorgfalt für die Tiere danken. Darüber hinaus möchten die Autoren das PhotoPath-Team innerhalb der Abteilung für Pathologie für ihre Unterstützung bei den Audio- und Videoabschnitten des Manuskripts anerkennen. Diese Arbeit wurde durch diskretionäre Forschungsmittel des Staatslabors unterstützt.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Intranasal Immunization
Anesthesia Machine/VaporizerVet Equip901807
Hypodermic Needle (25 g)Terumo07-806-7584
Isoflurane (250 mL Bottle)Patterson Veterinary07-893-13892-4%
Luer Lock Syringe (1 mL)Air-Tite07-892-7410
Mucosal VaccineN/AN/AExperimental Vaccine
Nose ConeMcCulloch Medical07891-1097
Pipette TipsVWR53503-290
PipettorVWR89079-962
PromAce (Acepromazine maleate)Boehringer Ingelheim07-893-57341mg/kg IM
Puralube Sterile Ophthalmic OintmentDechra07-888-2572
Milk Collection
Alcohol Prep 2-plyCovidien07-839-8871
Anesthesia Machine/VaporizerVet Equip901807
Hypodermic Needles (25 g)Terumo07-806-7584
Isoflurane (250 mL Bottle)Patterson Veterinary07-893-13892-4%
Luer Lock Syringe (1 mL)Air-Tite07-892-7410
Non-Woven Sponge (4x4)Covidien07-891-5815
Nose ConeMcCulloch Medical07891-1097
PromAce (Acepromazine Maleate)Boehringer Ingelheim07-893-57341mg/kg IM
Puralube Sterile Ophthalmic OintmentDechra07-888-2572
Sterile Conical Vial (15 mL)Falcon14-959-49B

Referenzen

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