Generierung eines vereinfachten dreidimensionalen Skin-on-a-Chip-Modells in einer mikrobearbeiteten mikrofluidischen Plattform

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um ein dreidimensionales vereinfachtes und undifferenziertes Hautmodell unter Verwendung einer mikrobearbeiteten mikrofluidischen Plattform zu generieren. Ein paralleler Strömungsansatz ermöglicht die In-situ-Ablagerung eines Hautkompartiments für die Aussaat von Epithelzellen auf der Oberseite, die alle von Spritzenpumpen gesteuert werden.

Zusammenfassung

Diese Arbeit stellt eine neue, kostengünstige und zuverlässige mikrofluidische Plattform mit dem Potenzial dar, komplexe mehrschichtige Gewebe zu erzeugen. Als Proof of Concept wurde eine vereinfachte und undifferenzierte menschliche Haut modelliert, die ein dermales (stromales) und ein epidermales (epitheliales) Kompartiment enthält. Um dies zu erreichen, wurde ein vielseitiges und robustes, vinylbasiertes Gerät entwickelt, das in zwei Kammern unterteilt ist und einige der Nachteile mikrofluidischer Geräte auf Basis von Polydimethylsiloxan (PDMS) für biomedizinische Anwendungen überwindet, wie z.B. die Verwendung teurer und spezialisierter Geräte oder die Absorption kleiner, hydrophober Moleküle und Proteine. Darüber hinaus wurde eine neue Methode entwickelt, die auf parallelem Fluss basiert und die In-situ-Ablagerung sowohl des dermalen als auch des epidermalen Kompartiments ermöglicht. Das Hautkonstrukt besteht aus einer Fibrinmatrix, die menschliche primäre Fibroblasten enthält, und einer Monoschicht aus immortalisierten Keratinozyten, die oben ausgesät sind und anschließend unter dynamischen Kulturbedingungen aufrechterhalten werden. Diese neue mikrofluidische Plattform eröffnet die Möglichkeit, menschliche Hautkrankheiten zu modellieren und die Methode zu extrapolieren, um andere komplexe Gewebe zu erzeugen.

Einleitung

In jüngster Zeit wurden Fortschritte bei der Entwicklung und Produktion von In-vitro-Modellen für die menschliche Haut zur Analyse der Toxizität kosmetischer und pharmazeutischer Produkte^{erzielt 1}. Forscher in der Pharma- und Hautpflegeindustrie haben Tiere verwendet, wobei Mäuse am häufigsten vorkommen, um ihre Produkte zu testen^2,3,4,5. Das Testen von Produkten an Tieren ist jedoch nicht immer prädiktiv für das Ansprechen beim Menschen, was häufig zu Arzneimittelversagen oder nebenwirkungen beim Menschen und folglich zu wirtschaftlichen Verlusten führt^5,6. Das Vereinigte Königreich war das erste Land, das 1998 die Verwendung von Tieren für kosmetische Tests verbot. Später, im Jahr 2013, verbot die EU die Prüfung und Approbation von Kosmetika an Tieren (EU-Kosmetikverordnung Nr. 1223/2009)⁷.

Dieses Verbot wird auch von anderen Ländern in Betracht gezogen, wie z.B. im "Humane Cosmetics Act" in den USA⁸. Neben ethischen Bedenken machen die anatomischen Unterschiede zwischen Tier- und Menschenhaut Tierversuche zeitaufwendig, teuer und oft unwirksam. Darüber hinaus wird erwartet, dass der globale Markt für In-vitro-Toxikologie-Tests bis 2025 26,98 Milliarden US-Dollar erreichen^{wird 9}. Aus diesen Gründen besteht die Notwendigkeit, neue Methoden und Alternativen für diese In-vitro-Studien zu entwickeln, wie z. B. biotechnologisch hergestellte menschliche Hautmodelle, die es ermöglichen, die Sicherheit und toxische Wirkung von Kosmetika und Arzneimitteln ohne den Einsatz von Tieren zu testen.

Es gibt zwei verschiedene Arten von kommerziell erhältlichen, in vitro, menschlichen Hautmodellen. Der erste Typ besteht aus geschichteten epidermalen Äquivalenten, die mehrere Schichten differenzierender Keratinozyten enthalten, die auf verschiedenen Materialien ausgesät werden. Einige von ihnen wurden von der Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung (OECD) genehmigt und vom Europäischen Zentrum zur Validierung alternativer Methoden (ECVAM) für Hautkorrosions- und Reizungstests validiert, wie EpiDerm oder SkinEthic^10,11,12. Der zweite Typ sind Vollhautäquivalente mit einer Schicht differenzierender menschlicher Keratinozyten, die auf einem dreidimensionalen (3D) Gerüst ausgesät sind, das Fibroblasten wie T-Skin und EpiDerm-FT enthält. Diese Modelle werden jedoch unter statischen Bedingungen kultiviert, was sie nicht in der Lage macht, die physiologischen Bedingungen des Menschen genau darzustellen.

Das jüngste Interesse konzentrierte sich auf die Generierungvon In-vitro-3D-Hautmodellen in Zellkultur-Insert-Formaten (CCI) mit dynamischer Perfusion^{13,14,15,16,17},^18,19. Diese Systeme können jedoch nicht streng sensu als mikrofluidische Skin-on-Chips im Sinne ihrer klassischen Definition im Feld betrachtet werden. Ingbers Definition für Organe auf einem Chip besagt, dass das Organ innerhalb der mikrofluidischen Kanäle platziert werden muss, was eine Bedingung ist, dass nur wenige Geräte^20,21erfüllen. Skin-on-Chips haben bisher meist einfache Epithelien als Einzelzellschichten und/oder dermale Zellschichten modelliert, die durch eine poröse Membran getrennt sind^22,23. Obwohl es einige Fortschritte bei der Modellierung der Haut in mikrofluidischen Systemen gegeben hat^16,24, gibt es derzeit keine Literatur, die ein Organ-on-a-Chip-System zeigt, das Ingbers Definition entspricht, das in der Lage ist, eine mehrschichtige Haut in situ zu erzeugen und sowohl epitheliale als auch stromale Komponenten zu enthalten.

In dieser Arbeit wird eine neue, kostengünstige, robuste, vinylbasierte mikrofluidische Plattform für Skin-on-a-Chip-Anwendungen vorgestellt. Diese Plattform wurde durch Mikrobearbeitung hergestellt, die mehr Einfachheit im Herstellungsprozess sowie erhöhte Flexibilität und Vielseitigkeit im Layout des Geräts bietet und einige der Einschränkungen von PDMS^{25 überwindet.} Es wurde auch eine Möglichkeit entwickelt, ein vereinfachtes Hautkonstrukt durch einen parallelen, mit Spritzenpumpen gesteuerten Durchfluss einzuführen. Durch den parallelen Fluss können zwei Flüssigkeiten mit sehr unterschiedlichen Viskositäten (in diesem Fall ein Puffer und ein Fibrin-Pre-Gel) durch einen Kanal durchblutet werden, ohne sich miteinander zu vermischen. Als Proof of Concept wurde ein dermo-epidermales Konstrukt mit Fibroblasten, die in eine Fibrinmatrix eingebettet sind, die die Dermis nachahmt, in das Gerät eingeführt, auf dem eine Monoschicht von Keratinozyten geladen wurde, um die undifferenzierte Epidermis zu emulieren. Die Höhe des Hautfachs kann durch Modifikation der Durchflussraten moduliert werden. Die Hauptneuheit dieser Arbeit ist im Vergleich zu den zuvor beschriebenen Modellen^{22,26,27,28,29}, die Entwicklung eines 3D-Konstrukts innerhalb einer Mikrokammer mittels Mikrofluidik. Obwohl dieser Artikel eine vereinfachte undifferenzierte Haut vorstellt, besteht das langfristige Ziel darin, ein vollständig differenziertes Hautkonstrukt zu generieren und zu charakterisieren, um seine Lebensfähigkeit und Funktionalität für arzneimittel- und kosmetische Testzwecke zu demonstrieren.

Protokoll

1. Chipdesign und Mikrobearbeitungsparameter

1. Entwerfen Sie die mikrofluidischen Chipschichten mit der Open-Source-Designsoftware FreeCAD. Die Abmessungen der Kanäle sind Tabelle 1 zu entnehmen. Fügen Sie vier Löcher mit einem Durchmesser von 2,54 mm in das Design ein, um einen maßgeschneiderten Aligner für eine korrekte Schichtüberlagerung zu verwenden.

	Länge (μm)	Breite (μm)
Unterhaus	28,400	800
Obere Kammer	31,000	800

Tabelle 1: Abmessungen des oberen und unteren Kanals des Geräts.

2. Schneiden Sie 95 μm dicke, klebende, transparente Vinylplatten in 30 cm x 30 cm große Quadrate, damit sie richtig in den Plotter passen.
3. Verwenden Sie die Brother CanvasWorkspace-Software, um einen 30 cm x 30 cm großen Arbeitsbereich zu erstellen und ihn mit den entworfenen Mustern für die verschiedenen Schichten des Chips zu füllen (Abbildung 1A). Speichern Sie es in einer .svg Datei.
4. Schneiden Sie die 30 cm x 30 cm großen Vinylplatten mit dem Kantenplotter aus (Abbildung 1B-D).
   1. Kleben Sie die Vinylplatte auf eine Klebematte mit geringer Klebrigkeit und beseitigen Sie bei Bedarf alle Luftblasen.
   2. Laden Sie die .svg Datei auf den Plotter hoch und stellen Sie die Schnittparameter ein: Schneidklinge: Ebene 3; Schnittdruck: Stufe 0; Schnittgeschwindigkeit: Stufe 1. Legen Sie die Klebematte mit dem Vinyl in den Plotter und starten Sie den Schneidvorgang.
5. Schneiden Sie das obere Kanalmuster auf 12 μm dickem doppelseitigem Klebeband-Vinyl aus, indem Sie die vorherigen Schritte ausführen.

Abbildung 1: Chip-Design und Mikrobearbeitungsprozess. (A) Software-Layout, das den Arbeitsbereich zeigt, der sowohl mit den oberen als auch mit den unteren Mustern gefüllt ist, die für den Chip entworfen wurden. ( B) Kantenplotter während des Schneidvorgangs; Schneidklinge, ganze Vinylplatte und Klebematte werden gezeigt. (C) Gemustertes Vinyl, das vom geschnittenen Blatt getrennt wird. (D) Probe einer selbstklebenden Vinylschicht, die mit dem oberen Kanaldesign gemustert ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. PDMS-Schichtherstellung

1. Mischen Sie das PDMS und das Härter im Verhältnis 10: 1 (v / v) und legen Sie die Mischung für 15 min unter Vakuum, um Luftblasen zu entfernen. Gießen Sie 55 ml der Mischung in eine 55 cm² quadratische Kulturschale, um eine 2 mm dicke Schicht zu erhalten. Entfernen Sie Blasen mit einer Nadel.
2. Härten Sie die Mischung (Schritt 2.1) im Ofen für 1 h bei 80 °C aus. Entformen Sie das PDMS und schneiden Sie es mit den Chipabmessungen in Rechtecke. Machen Sie mit einer 18 G Spritzennadel Löcher für den Schlauch.

3. Chipmontage

HINWEIS: Zum besseren Verständnis siehe Abbildung 2.

1. Montieren Sie das gesamte Gerät mit einem Aligner, um Kanäle, Ein- und Auslässe richtig einzustellen. Stapeln Sie vier Vinylschichten (mit dem entsprechenden unteren Mikromuster) für die Montage des unteren Kanals und bewahren Sie das Abdeckband der unteren Schicht auf, um ein Verkleben am Aligner zu vermeiden.
2. Schneiden Sie die poröse Membran aus Polycarbonat (PC) aus und legen Sie sie auf den unteren Kanal, um sie vom oberen kanal zu trennen. Achten Sie darauf, die Einlässe des unteren Kanals nicht zu bedecken.
3. Fügen Sie zehn Vinylschichten mit dem oberen Kammerdesign hinzu. Kleben Sie eine doppelseitige Klebeband-Vinylschicht mit dem oberen Kanalmuster auf die Oberseite. Entfernen Sie den Chip aus dem Aligner und kleben Sie ihn auf den Glasobjektträger.
4. Legen Sie eine 2 mm dicke PDMS-Folie auf die doppelseitige Bandvinylschicht, um eine angemessene Verankerung für den Schlauch zu gewährleisten und Leckagen zu vermeiden. Lassen Sie über Nacht ein Gewicht auf dem Chip, um sicherzustellen, dass der Chip vollständig wasserdicht ist. Sterilisieren Sie den Chip, indem Sie 70% v / v Ethanol für 5 min spülen, und waschen Sie ihn dann mit destilliertem_H2O.

Abbildung 2: Mikrofluidische Chip-Baugruppe. (A) Allgemeines Schema der Montage des Produkts. Die untere und die obere Kammer bestehen aus vier bzw. elf übereinander liegenden Vinylplatten. (B) Obere und seitliche Ansichten des mikrofluidischen Chips. Der obere und untere Kanal werden in Rosa bzw. Blau dargestellt. (C) Bild der Chip-Baugruppe mit einem maßgeschneiderten Aligner. (D) Chipbild nach vollständiger Montage. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

4. Pumpenanschlüsse

ANMERKUNG: Die grafische Darstellung der Pumpenanschlüsse ist in Abbildung 3 dargestellt.

1. Schließen Sie Pumpe 1 an den oberen Kammereinlass 1 (UCi1) an.
2. Schließen Sie Pumpe 2 an den oberen Kammereinlass 2 (UCi2) an.
3. Schließen Sie Pumpe 3 an den Unteren Kammereinlass (LCi) an.
4. Schließen Sie Upper Chamber Outlet (UCo) und Lower Chamber Outlet (LCo) an ein Abfallrohr an.
5. Verbinden Sie die Spritzen mit Polytetrafluorethylen (PTFE)-Schläuchen und 18 G Edelstahlsteckern mit jedem Einlass.

Abbildung 3: Pumpenanschlüsse und Position der Ein-/Auslässe. (A) Diagramm, das den Anschluss der drei verschiedenen Pumpen an ihre jeweiligen Einlässe zeigt. Auslässe werden an einen Abfallbehälter angeschlossen. (B) Chipbild mit beschrifteten Ein- und Auslässen. Abkürzungen: LCi = Unterkammereinlass; LCo = unterer Kammerauslass; UCi1 = Oberkammereinlass 1; UCi2 = Oberkammereinlass 2; UCo = oberer Kammerauslass. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

5. Zellkultur

HINWEIS: Die HaCaT-Zelllinie hat einen kommerziellen Ursprung. Menschliche primäre Fibroblasten stammen von gesunden Spendern und wurden aus der Sammlung biologischer Proben menschlichen Ursprungs gewonnen, die im "Registro Nacional de Biobancos para Investigación Biomédica del Instituto de Salud Carlos III" registriert sind.

1. Arbeiten Sie in einer Zellkulturhaube, die zuvor unter ultraviolettem Licht sterilisiert und mit Ethanol abgewischt wurde.
2. H2B-GFP-HaCaT-Zellen (humane immortalisierte Hautkeratinozyten, hKCs) und GFP-humane primäre Fibroblasten (hFBs) bei 37 °C auftauen, 2 ml Kulturmedium hinzufügen und 7 min bei 20 °C bei 250 × gzentrifugieren.
   HINWEIS: H2B-GFP-HaCaT-Zellen sind humane immortalisierte Keratinozyten, die modifiziert wurden, um ein hybrides H2B-grün fluoreszierendes Protein (GFP) aus Histon zu exprimieren, das ihre Kerne mit grüner Fluoreszenz versorgt. GFP-hFBs sind humane primäre Fibroblasten, die mit dem Vektor pLZRS-IRES-EGFP transformiert wurden, um zytoplasmatische grüne Fluoreszenz zu exprimieren. Diese Zellen wurden nach den zuvor veröffentlichten Protokollen^{30,31 modifiziert.}
3. Kultur sowohl hKCs als auch hFBs in 1x DMEM, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum und 1% antibiotischer/antimykotischer Lösung. Das Kulturmedium vor Gebrauch bei 37 °C vorwärmen.
4. Lösen Sie die Zellen, indem Sie sie mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) waschen, 2 ml Trypsin/Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) hinzufügen und 10 min bei 37 °C inkubieren.
5. Inaktivieren Sie Trypsin und fügen Sie 4 ml Kulturmedium hinzu. Resuspendieren Sie die Zellen und übertragen Sie sie in eine 15 ml Röhre. Entfernen Sie 10 μL, um die Zellen auf einer Neubauer-Kammer zu zählen und die entsprechende Konzentration zu bestimmen.
6. Zentrifugieren Sie das 15 mL Röhrchen für 7 min bei 20 °C bei 250 × g. Entfernen Sie den Überstand und resuspenieren Sie die Pellets in der gewünschten Konzentration: hFBs bei 50.000 Zellen/ml und hKCs bei 5·× 10⁶ Zellen/ml.

6. Fibrinogen-Pre-Gel-Zubereitung

1. Aktivieren Sie Thrombin, indem Sie 1 ml CaCl₂ (1% w/v in NaCl) in die Durchstechflasche geben.
2. Fügen Sie die folgenden Komponenten hinzu, um 1 ml eines Fibrinhydrogels bei einer Endgültigen Konzentration von Fibrin von 3,5 mg/ml zu erhalten: 59 μL aktiviertes Thrombin (10 NIH-Einheiten/ml), 59 μL Tranexamsäure(Materialtabelle,100 mg/ml), 764 μL Kulturmedium mit 50.000 hFBs/ml, 118 μL Fibrinogen (20 mg/ml in NaCl (0,9 % w/v)).
   HINWEIS: Fibrinogen muss im letzten Moment hinzugefügt werden.

7. Paralleles Flussprotokoll

1. Pumpe 1x PBS mit Pumpe 3 durch den LCi bei 50 μL/min während des gesamten Prozesses.
2. Pumpen Sie Opferflüssigkeit (1x PBS) mit Pumpe 2 durch die UCi2 bei 100 μL/min.
3. Laden Sie die Spritze mit dem Vorgel ein, legen Sie sie schnell in Pumpe 1 und lassen Sie sie mit 200 μL/min laufen(Abbildung 4A).
4. Stoppen Sie die Pumpen 1 und 2, sobald das Vorgel das UCo verlässt.
5. Lassen Sie den Chip, ohne den Schlauch zu entfernen, bei 37 °C für mindestens 10 min, um eine Gelierung zu ermöglichen.
6. Pumpen Sie kulturmedium bei 50 μL/h mit Pumpe 3 bis UCi2 über Nacht.
7. Blockieren Sie UCi1 mit einer Kappe.

8. hKCs Monolayer Seeding

1. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob hFBs 24 h nach der Bildung des Hautkompartiments verteilt sind.
2. Stellen Sie die hKCs mit Pumpe 2 bis UCi2 bei 5 ×·10⁶ Zellen/ml bei 40 μL/min für 1 min vor (Abbildung 4B).
3. Lassen Sie den Chip über Nacht bei 37 °C in einem feuchtigkeitsgesättigten Inkubator zur Zellbefestigung.
4. Frischkulturmedium mit Pumpe 3 nur durch LCi bei 50 μL/min pumpen (Abbildung 4C).

Abbildung 4: Mikrofluidisches Protokoll zur Erzeugung des dermo-epidermalen Konstrukts. (A) Querquerschnitt, der den parallelen Strömungsprozess zur Erzeugung des dermalen Kompartiments zeigt. (B) Keratinozyten-Monolayer-Aussaat 24 h nach der Erzeugung des hauten Kompartiments. (C) Zellkulturpflege innerhalb der mikrofluidischen Vorrichtung. (D) Querschnittsnachbildung der Haut im Inneren des Chips. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

9. Zelllebensfähigkeitstest

HINWEIS: Das Live/Dead Kit färbt Zellen mit grüner oder roter Fluoreszenz, abhängig von ihrem lebenden oder toten Zustand. Für eine ordnungsgemäße Rentabilitätsdifferenzierung müssen in diesem Schritt nicht fluoreszierende hKCs und hFBs verwendet werden. Alle Schritte im Verfahren werden durch UCi2 mit Pumpe 2 durchgeführt.

1. Waschen Sie den oberen Kanal mit 1x PBS für 5 min bei 50 μL/min, um das Kulturmedium zu entfernen.
2. Pumpen Sie Luft, um die 1x PBS bei 50 μL/min zu entfernen.
3. Bereiten Sie die Lösung Calcein AM/Ethidium homodimer-1 Kit (Live/Dead) vor, indem Sie die Anweisungen des Herstellers befolgen.
4. Pumpe Lebend/Tot Lösung bei 50 μL/min für 2 min.
5. 30 min bei 37 °C im Dunkeln inkubieren.
6. Waschen Sie den oberen Kanal, indem Sie 1x PBS bei 50 μL /min für 2 min pumpen, um das verbleibende Reagenz zu entfernen.
7. Beobachten Sie die Probe unter dem konfokalen Mikroskop. Verwenden Sie eine Anregungswellenlänge von 495/590 nm und eine Emissionswellenlänge von 519/617 nm für lebende bzw. tote Zellen.

Ergebnisse

Der entworfene Chip besteht aus zwei fluidischen Kammern, die durch eine 5 μm porengroße PC-Membran getrennt sind, die das Wachstum der Zelle ermöglicht, indem sie den Durchgang wachstumsfördernder Moleküle aus der unteren Kammer ermöglicht. Die obere Kammer hält das Gewebekonstrukt, in diesem Fall eine Monoschicht aus hKCs auf einem Fibrinhydrogel, das hFBs enthält.

Die Höhe der Kanäle wird durch die Anzahl der Klebefolien bestimmt, die jedem Kanal hinzugefügt werden. Die untere Ka...

Diskussion

Die Motivation, diese Methode zu entwickeln, war der Wunsch, Hauterkrankungen zu modellieren und die Auswirkungen neuer und innovativer Therapien in einer Hochdurchsatzplattform zu untersuchen. Bis heute produziert dieses Labor diese dermo-epidermalen Äquivalente, indem es - entweder manuell oder mit Hilfe der 3D-Bioprinting-Technologie - das Fibringel mit Fibroblasten in eine Zellkultur-Einlegeplatte gießt und die Keratinozyten darauf aussät. Sobald die Keratinozyten den Zusammenfluss erreichen, wird die 3D-Kultur de...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amchafibrin	Rottafarm		Tranexamic acid
Antibiotic/antimycotic	Thermo Scientific HyClone
Calcium chloride	Sigma Aldrich
Culture plates	Fisher
DMEM	Invitrogen Life Technologies
Double-sided tape vynil	ATP Adhesive Systems		GM 107CC, 12 µm thick
Edge plotter	Brother		Scanncut CM900
FBS	Thermo Scientific HyClone
Fibrinogen	Sigma Aldrich		Extracted from human plasma
Glass slide	Thermo Scientific
GFP-Human dermal fibroblasts	-		Primary. Gift from Dr. Marta García
H2B-GFP-HaCaT cell line	ATCC		Immortalized keratinocytes. Gift from Dr. Marta García
Live/dead kit	Invitrogen
PBS	Sigma Aldrich
Polycarbonate membrane	Merk TM		5 µm pore size
Polydimethylsiloxane	Dow Corning		Sylgard 184
Sodium chloride	Sigma Aldrich
Syringes	Terumo		5 mL
Thrombin	Sigma Aldrich		10 NIH/vial
Transparent adhesive vinyl	Mactac		JT 8500 CG-RT, 95 µm thick
Trypsin/EDTA	Sigma Aldrich
Tubing	IDEX		Teflon, 1/16” OD, 0.020” ID