μTongue: Eine mikrofluidikbasierte funktionelle Bildgebungsplattform für die Zunge in vivo

Zusammenfassung

Der Artikel stellt das μTongue-Gerät (Microfluidics-on-a-Tongue) für die funktionelle Geschmackszellbildgebung in vivo vor, indem die Mikrofluidik in ein intravitalen Bildgebungsfenster auf der Zunge integriert wird.

Zusammenfassung

Die intravitale Fluoreszenzmikroskopie ist ein Werkzeug, das häufig verwendet wird, um die mehrzellige Dynamik bei einem lebenden Tier zu untersuchen. Es wurde jedoch nicht erfolgreich im Geschmackssinnsorgan eingesetzt. Durch die Integration der Mikrofluidik in das intravitaale Zungenbildgebungsfenster liefert die μTongue zuverlässige funktionelle Bilder von Geschmackszellen in vivo unter kontrollierter Exposition gegenüber mehreren Tastantien. In diesem Artikel wird eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Verwendung des μTongue-Systems vorgestellt. Es gibt fünf Unterabschnitte: Vorbereitung von Lösungen, Aufbau eines mikrofluidischen Moduls, Probenmontage, Erfassung funktionaler Bilddaten und Datenanalyse. Einige Tipps und Techniken zur Lösung der praktischen Probleme, die bei der Verwendung der μTongue auftreten können, werden ebenfalls vorgestellt.

Einleitung

Das intravitale Fluoreszenzmikroskop wird häufig verwendet, um die raumzeitliche Dynamik an lebenden Geweben zu untersuchen. Forscher entwickeln schnell genetisch kodierte Sensoren, die spezifische und empfindliche Umwandlungen der biologischen Prozesse in Fluoreszenzsignale liefern - die mit fluoreszierenden Mikroskopen, die weit verbreitet sind, leicht aufgezeichnet werden können^1,2. Obwohl die meisten inneren Organe bei Nagetieren mit dem Mikroskop untersucht wurden, war seine erfolgreiche Anwendung auf der Zunge noch nicht erfolgreich³.

Frühere Studien zur Calciumbildgebung von Geschmackszellen wurden ex vivo durch Dünnschnitt eines Zungengewebes durchgeführt, um zirkumvallate Geschmacksknospen zu erhalten^4,5,⁶ oder durch Abziehen des Geschmacksepithels, um fungiforme Geschmacksknospen zu erhalten^7,8. Die Vorbereitung dieser Proben war zwangsläufig invasiv, so dass die natürlichen Mikroumgebungen wie Nerveninnervation, Permeabilitätsbarrieren und Durchblutung weitgehend gestört waren. Das erste intravitalen Zungenbildgebungsfenster wurde 2015 von Choi et al. berichtet, aber eine zuverlässige funktionelle Aufzeichnung war aufgrund der Bewegung und der optischen Artefakte, die durch fluidische Tastantreize verursacht wurden, nicht erreichbar⁹.

Vor kurzem wurde die Mikrofluidik-auf-einer-Zunge (μTongue)^{eingeführt 10}. Dieses Gerät integriert ein mikrofluidisches System mit einem Bildgebungsfenster auf der Mauszunge. Durch das Erreichen eines quasi-stationären Flusses von Tastantreizen während des gesamten Bildgebungszeitraums konnten Artefakte aus fluidischen Bewegungen minimiert werden (Abbildung 1). Der Eingangsanschluss wird von einer Reihe von Mehrkanal-Druckreglern gespeist, während der Ausgangsanschluss an eine Spritzenpumpe angeschlossen ist, die 0,3 ml / min hält. Zusätzlich wurden optische Artefakte, die durch den Unterschied in den Brechungsindizes von Tastantlösungen verursacht wurden, durch ratiometrische Analyse minimiert, die einen calcium-unempfindlichen Indikator (tdTomato) sowie den Kalziumindikator (GCaMP6)¹¹einführte. Dieses Design bot eine mikroskopische Stabilität der Geschmackszellen in vivo auch bei abruptem Umschalten zwischen fluidischen Kanälen. Folglich implementieren die μTongue ein zuverlässiges funktionelles Screening mehrerer Tastantien auf die Mausgeschmacksknospen in vivo.

In diesem Protokoll werden die experimentellen Verfahren zur Calciumbildgebung der Mauspilzformen Geschmacksknospen in vivo unter Verwendung von μTongue ausführlich erläutert. Zunächst wird die Herstellung von künstlichem Speichel und Geschmackslösungen beschrieben. Zweitens wird der Aufbau des mikrofluidischen Systems eingeführt, um den quasi-stationären Fluss zu erreichen. Drittens werden die Verfahren zur Montage der Mauszunge auf der μTongue zur Bildaufnahme umrennt. Schließlich wird jeder Schritt für die Bildanalyse, einschließlich der Korrektur von lateralen Bewegungsartefakten und der Ratiometrie, spezifiziert. Dieses Protokoll kann leicht an jedes Forschungslabor mit einer Mauseinrichtung und einem Zwei-Photonen-Mikroskop oder gleichwertigen Geräten angepasst werden.

Protokoll

Alle chirurgischen Eingriffe wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Sungkyunkwan University und der Seoul National University genehmigt.

1. Herstellung von Lösungen: künstlicher Speichel und Geschmacksstoffe

1. Künstlichen Speichel durch Auflösen von 2 mM NaCl, 5 mM KCl, 3 mM NaHCO₃, 3 mM KHCO₃, 0,25 mM CaCl₂, 0,25 mM MgCl₂, 0,12 mM_K2HPO₄, 0,12 mM KH₂PO₄und 1,8 mM HCl in destilliertem Wasser (>1 L) vorbereiten und den pH-Wert der Lösung auf 7 einstellen (siehe Materialtabelle)¹².
2. Bereiten Sie Tastantien wie sauer vor: 10 mM Zitronensäure; salzig: 400 mM NaCl, optional mit 50 μM Amilorid; süß: 40 mM Acesulfam K; bitter: eine Mischung aus 5 mM Chinin, 5 mM Denatonium und 20 μM Cycloheximid, indem die Geschmackschemikalie im künstlichen Speichel, der in Schritt 1.1 hergestellt wird, gelöst wird.

2. Herstellung des mikrofluidischen Systems

HINWEIS: Tastants wurden mit einem unter Druck stehenden mehrkanaligen fluidischen Verabreichungssystem an die Mauszunge abgegeben (siehe Abbildung 1 und Materialtabelle).

1. Füllen Sie die Reservoirs des unter Druck stehenden Durchflussperfusionssystems mit dem künstlichen Speichel und den Geschmacksstoffen.
2. Schließen Sie die Druckluftleitung an den Reglereingang an und stellen Sie den Luftdruck im fluidischen Fördersystem zwischen 30 und 50 psi ein.
3. Stellen Sie den Ausgangsdruck des Reglers auf 0,4 psi ein und prüfen Sie, ob unter diesem Druck Flüssigkeit aus dem Rohr kommt.
4. Schließen Sie den Verteiler von den Reservoirs an den Eingangsport von μTongue an.
5. Schließen Sie den Ausgangsanschluss von μTongue an eine Spritzenpumpe an und entnehmen Sie Flüssigkeit mit ~300 μL∙min^-1, um den stationären Zustand herzustellen. Beobachten Sie das konstante Volumen eines hängenden Tröpfchens unter der μTongue. Passen Sie den Wert des Einstellparameters in Abhängigkeit von der Probenhöhe an.
6. Trennen Sie die Druckluftleitung und stoppen Sie die Spritzenpumpe, bis Protokollschritt 3 abgeschlossen ist.

3. Vorbereitung der Maus auf die In-vivo-Bildgebung (Abbildung 2).

HINWEIS: Alle tierexperimentellen Vorbereitungen wurden tagsüber unter aseptischen Bedingungen auf einer Laborwerkbank durchgeführt.

1. Mausanästhesie
   1. Bereiten Sie eine 7 Wochen alte oder ältere Maus beiderlei Geschlechts vor. Verwenden Sie eine genetisch veränderte Mauslinie, die kalziumempfindliche Fluoreszenzproteine in den Geschmackszellen exprimieren.
   2. Die Maus wird zur Anästhesie zurückgehalten. Eine Mischung aus 100 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin wird intraperitoneal in die Maus injiziert¹³.
2. TRITC-Dextran (500 kDa) in 2,5% W/V Phosphatpuffersalzlösung wird intravenös über einen retroorbitalen Weg in die Maus eingelassen, um die Blutzirkulation während einer Bildgebungssitzung zu beobachten.
3. Befestigen Sie einen Kopffixierer am Mausschädel, um Bewegungsartefakte zu minimieren.
   1. Der Mauskopf wird mit 70% ETOH besprüht, während die Maus in Rückenlage gebracht wird. Heben Sie die Kopfhaut leicht mit einer Zette an und schneiden Sie ca. 7 mm² mit einer Schere ab.
   2. Reinigen Sie die Haare um die Kopfhaut, entfernen Sie das Periost unter der Haut, tragen Sie einen sofortigen Klebstoff auf den Schädel auf und befestigen Sie einen maßgeschneiderten Kopffixierer.
   3. Nachdem der Sofortkleber ausgehärtet ist, tragen Sie Zahnkleber um den Kopffixierer auf und beleuchten Sie mit einem blauen Licht, um den Zahnkleber zu verfestigen.
4. Legen Sie die Mauszunge auf die untere Einheit von μTongue.
   1. Befestigen Sie die Unterlippe der Maus mit einem Sofortkleber an der Unteren Einheit von μTongue.
   2. Setzen Sie die Maus auf die Platine (Mausvorbereitungsplatine in Abbildung 1B)und setzen Sie die untere Einheit der μTongue an die Pfosten (μTongue Hold-Pfosten in Abbildung 1B). Stellen Sie sicher, dass die Löcher am Rand der Bodeneinheit am Pfosten ausgerichtet sind.
   3. Ziehen Sie den Mauskopffixierer an der Kopffixiererhalterung am Board fest. Passen Sie dann den Abstand zwischen dem Mauskopf und dem Gerät an. Drehen Sie den Mauskopf mit dem Kopffixiererhalter sanft um ca. 45°. Dieser Prozess verhindert den physischen Kontakt der Mausnase mit Mikroskopobjektiv.
   4. Ziehen Sie die Mauszunge vorsichtig mit einer Kunststoffpinzette und befestigen Sie die bauchige Seite der Zunge an der Oberseite der unteren Einheit der μTongue. Wischen Sie dann die Oberfläche der Mauszunge mit einem nassen Wattestäbchen ab.
   5. Tränken Sie ein Stück Papier in den künstlichen Speichel und legen Sie es auf die freiliegende Oberfläche der Mauszunge, um einen nassen Zustand zu erhalten.
   6. Legen Sie die gekrümmten Unterlegscheiben auf die Pfosten, die beide Enden des unteren Teils von μTongue halten.
5. Legen Sie das Mauspräparat auf den Mikroskopstand. Positionieren Sie die freiliegende Mauszunge unter der ungefähren Mitte des Objektivbereichs des Mikroskops. Achten Sie darauf, nicht vom Dynamikumfang der Bühne abzuweichen. Dann ziehen Sie das Mausbrett auf der Bühne mit Schrauben fest.
6. Legen Sie das Heizkissen unter den Mauskörper und halten Sie die Temperatur bei 36,5 °C-37,5 °C. Überwachen Sie die Körpertemperatur der Maus mit einem Temperatursensor und steuern Sie die Temperatur des Heizkissens über ein Feedback-Signal des Temperatursensors.
7. Drehen Sie ein dünnes Stück Papier und legen Sie es in den Mund der Maus, um zu verhindern, dass Flüssigkeit in die Luftröhre der Maus gelangt.
8. Entfernen Sie das nasse Gewebe von der Mauszunge und legen Sie die vorbereitete μTongue auf die Mauszunge. Legen Sie einen mikrofluidischen Kanal auf die Zunge und passen Sie ihre Position an, um die Oberfläche der Zunge durch das Bildfenster zu beobachten.
9. Befestigen Sie die μTongue, indem Sie beide Enden mit minimalem Druck vorsichtig anschrauben.

4. Bilderfassung

1. Schalten Sie den 920 nm Zwei-Photonen-Laser und das Mikroskop vor dem Gebrauch ein.
2. Montieren Sie das Wasserimmersionsobjektiv (16x, NA 0,80 oder 25x, NA 1.1) am Mikroskop. Lassen Sie das destillierte Wasser auf das Bildfenster der μTongue fallen und tauchen Sie das Objektiv ein.
3. Schalten Sie im Kameramodus das Licht mit quecksilberfarbener Lampe ein und beleuchten Sie die Oberfläche der Zunge.
4. Durch Einstellen der Z-Achse durchsuchen Sie das autofluoreszierende Signal der filiformen Papillen, um die ungefähre Fokusebene zu finden. Suchen Sie dann mit dem X- und Y-Einstellknopf eine Geschmacksknospen.
5. Wechseln Sie in den Multiphotonen-Modus. Stellen Sie die Bildaufnahmebedingungen wie folgt ein: Anregungswellenlänge: 920 nm; Emissionsfiltersatz: 447/60 nm, 525/50 nm und 607/70 nm; bidirektionaler Raster-Scan-Modus, Rahmengröße: 512 x 512.
6. Passen Sie die X- und Y-Positionen an, um die Geschmacksknospen in der Mitte des Bildfensters zu platzieren.
7. Durchsuchen Sie die Blutgefäße, die die Geschmacksknospen umgeben, in etwa zwei Dritteln Höhe der Geschmacksknospen. Visualisieren Sie die Durchblutung durch TRITC-Dextran (500 kDa) Injektion aus Protokollschritt 3.2. Wenn der Blutfluss verstopft, lösen Sie die Befestigungsschrauben leicht, um den Blutfluss zu ermöglichen.
8. Stellen Sie die Z-Achse ein und finden Sie die Z-Ebene der Geschmacksknospen, die eine ausreichende Anzahl von Geschmackszellen enthält.
9. Fahren Sie mit der Calcium-Bildgebung mit 2-6 Hz für 80 s fort. Bieten Sie eine Geschmackslösung von 20 s, indem Sie das Reservoir des fluidischen Systems nach Beginn der Bildgebung einschalten. Nach 20 s Geschmacksstimulation schalten Sie das Reservoir wieder auf künstlichen Speichel um.
10. Nachdem die sequenzielle Bildgebung abgeschlossen ist, warten Sie ca. 3-4 Minuten bis zur nächsten Bildgebungssitzung. Lassen Sie den künstlichen Speichel zur Mauszunge fließen, um das Tastant-Remanent aus der vorherigen Bildgebungssitzung wegzuwaschen. Je nach Design des Experiments wiederholen Sie die Sitzung nach Bedarf.
11. Wenn die In-vivo-Kalziumbildgebung abgeschlossen ist, euthanasieren Sie die Maus nach dem IACUC-Verfahren. Die Maus unter Betäubung wird in der CO_2-Kammer geopfert.
    HINWEIS: Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie mit einem Zehenquetschreflex. Während einer bildgebungsgebenden Sitzung sollte konsequent künstlicher Speichel aus den Reservoirs bereitgestellt werden. Wenn Blasen am Abbildungsfenster der μTongue auftreten, entfernen Sie die Blasen, indem Sie sie mit starkem Flüssigkeitsdruck durch den Eingang oder den Ausgang der μTongue drücken.

5. Bildanalyse (Abbildung 3)

1. Bildkonvertierung
   1. Öffnen Sie die Rohbilddateien mit Fiji¹⁴ oder einer ähnlichen Bildanalysesoftware.
   2. Konvertieren Sie die Bilddatei in eine RGB-Stack-Datei, um den NPL Bud Analyzer-Code zu verwenden.
      1. Bild > Farb- > Geteilte Kanäle
      2. Bild > Farb- > Kanäle zusammenführen und wählen Sie das Bild aus Schritt 5.2.1 aus.
      3. Bild > Farb->-Stack zu RGB
2. Bildregistrierung
   HINWEIS: Verwenden Sie den benutzerdefinierten Code für die Datenanalyse. Bitte beachten Sie https://github.com/neurophotonic/Tastebud-analyzer.
   1. Führen Sie den Codenamen Taste_GUI.maus. Ein GUI-Fenster mit dem Namen NPL Bud Analyzer wird angezeigt. Klicken Sie auf die Schaltfläche Neue Analyse in der oberen rechten Ecke und laden Sie dann das konvertierte Bild aus Schritt 5.1. Stellen Sie die Bildrate über dem geladenen Bild ein.
   2. Zeichnen Sie den Interessenbereich (ROI) über das geladene Bild zur Registrierung. Doppelklicken Sie auf den ausgewählten ROI und eine automatisch berechnete Registrierung beginnt.
3. Erhalten Sie die relativen Änderungen der Fluoreszenzintensität (ΔF/F)
   1. Gehen Sie zurück zum NPL Bud Analyzer-Fenster, um das registrierte Bild aus Schritt 5.2 automatisch anzuzeigen. Wenn der Benutzer bereits über eine Reg-Datei verfügt, klicken Sie auf die Schaltfläche Daten laden und wählen Sie die _reg.tif Datei aus.
   2. Klicken Sie auf die Schaltfläche CIRCLE oder POLYGON und positionieren Sie den ROI der Geschmackszelle über dem Geschmacksknospenbild.
   3. Diese stellt die rohe Fluoreszenzintensität unddie Calciumspur (ΔF/F)der ausgewählten Geschmackszelle automatisch unter dem Geschmacksknospenbild dar.
   4. Klicken Sie auf Save Trace, um die Calciumspur (ΔF/F) auf der rechten Seite der GUI anzuzeigen, während der ROI über dem Geschmacksknospenbild angezeigt wird. Wiederholen Sie die Schritte 5.3.2-5.3.4, bis die ROI-Auswahl abgeschlossen ist.
      HINWEIS: Klicken Sie auf die Schaltfläche Trace löschen, wenn der ROI falsch ausgewählt ist, um den zuletzt ausgewählten ROI und Den Calcium-Trace zu eliminieren.
   5. Nachdem die ROI-Auswahl abgeschlossen ist, schreiben Sie den Dateinamen in die rechte untere Ecke und klicken Sie auf die Schaltfläche Fertig stellen, um die ΔF/F Calcium-Spur als .xls Format und das Tase-Bud-Bild mit ROIs in einem .bmp Format zu exportieren.
4. Analyse der Calciumspur
   1. Analysieren Sie die aus Schritt 5.3 erhaltene Kalziumspur. Bedenken Sie, dass Geschmackszellen auf Tastant reagiert haben, wenn die Fluoreszenzintensität um mehr als zwei Standardabweichungen der Baseline ansteigt, nachdem das Tastant⁴abgegeben wurde, und p-Wertekleiner als 0,01 sind, wobei gepaarte oder ungepaarte t-Tests¹⁰verwendet werden.
   2. Betrachten Sie die Geschmackszelle als Responderzelle, wenn sie mehr als zweimal von drei Versuchen (~ 60%) auf ein bestimmtes Tastant reagiert¹⁵.
   3. Erhalten Sie die repräsentativen Calciumspuren durch Mittelung einzelner Calciumspuren, die aus Schritt 5.4.1 gewonnen wurden.

Ergebnisse

Die Pirt-GCaMP6f-tdTomato Maus wurde verwendet, um ein Geschmacksknospenbild zu erhalten. Die Oberfläche der Mauszunge war mit autofluoreszierenden filiformen Papillen bedeckt. Geschmacksknospen sind spärlich über die Oberfläche der Zunge verteilt (Abbildung 4A). Die Bilder der Geschmacksknospen und ihrer Struktur wurden mit drei verschiedenen Filterdetektoren aufgenommen. Mit dem 607/70 nm Filterset wurde das tdTomato-Signal aus den Geschmackszellen für die ratiometrische Analyse erhal...

Diskussion

Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Anwendung von μTongue auf die Untersuchung funktioneller Aktivitäten von Geschmackszellen in vivo beschrieben. In diesem Protokoll wird die funktionelle Bildgebung an den Geschmackszellen mit genetisch kodierten Kalziumindikatoren durchgeführt. Neben der Verwendung transgener Mäuse kann die elektrophoretische Belastung von Calciumfarbstoffen (oder Spannungsmessfarbstoffen) auf die Geschmackszellen eine alternative Option sein.

Alle Geschma...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
acesulfame K	Sigma Aldrich	04054-25G	Artificial saliva / tastant
calcium chloride solution	Sigma Aldrich	21115-100ML	Artificial saliva / tastant
citric acid	Sigma Aldrich	C0759-100G	Artificial saliva / tastant
cycloheximide	Sigma Aldrich	01810-5G	Artificial saliva / tastant
denatonium	Sigma Aldrich	D5765-5G	Artificial saliva / tastant
Dental glue	Denkist	P0000CJT-A2	Animal preparation
Image J	NIH	ImageJ	Data analysis
IMP	Sigma Aldrich	57510-5G	Artificial saliva / tastant
Instant adhesive	Loctite	Loctite 4161, Henkel	Animal preparation
K2HPO4	Sigma Aldrich	P3786-100G	Artificial saliva / tastant
KCl	Sigma Aldrich	P9541-500G	Artificial saliva / tastant
Ketamine	Yuhan	Ketamine 50	Animal preparation
KH2PO4	Sigma Aldrich	P0662-25G	Artificial saliva / tastant
KHCO3	Sigma Aldrich	237205-500G	Artificial saliva / tastant
MATLAB	Mathwork	MATLAB	Data analysis
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266-100G	Artificial saliva / tastant
MPG	Sigma Aldrich	49601-100G	Artificial saliva / tastant
Mutiphoton microscope	Thorlab	Bergamo II	Microscope
NaCl	Sigma Aldrich	S3014-500G	Artificial saliva / tastant
NaHCO3	Sigma Aldrich	792519-500G	Artificial saliva / tastant
Objective	Nikon	N16XLWD-PF	Microscope
Octaflow	ALA Scientific Instruments	OCTAFLOW II	Fluidic control
PC	LG	Lg15N54	Fluidic control
PH meter	Thermoscientific	ORION STAR AZ11	Artificial saliva / tastant
Phosphate-buffered saline	Sigma Aldrich	806562	Artificial saliva / tastant
quinine	Sigma Aldrich	Q1125-5G	Artificial saliva / tastant
Syringe pump	Havard Apparatus	PHD ULTRA 4400	Fluidic control
TRITC-dextran	Sigma Aldrich	52194-1G	Animal preparation
Ultrafast fiber laser	Toptica	FFultra920 01042	Microscope
Xylazine	Bayer Korea	Rompun	Animal preparation