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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Es wird ein Protokoll vorgestellt, um den Gesamtlipidgehalt der Zellwand einer Vielzahl von Mykobakterien zu extrahieren. Darüber hinaus werden Extraktions- und Analyseprotokolle der verschiedenen Arten von Mykolsäuren gezeigt. Ein dünnschichtchromatographisches Protokoll zur Überwachung dieser mykobakteriellen Verbindungen wird ebenfalls bereitgestellt.

Zusammenfassung

Mykobakterienarten können sich in der Wachstumsrate, dem Vorhandensein von Pigmentierung, der koloniemorphologischen Auf festen Medien sowie anderen phänotypischen Merkmalen voneinander unterscheiden. Sie alle haben jedoch den relevantesten Charakter von Mykobakterien gemeinsam: ihre einzigartige und hochhydrophobe Zellwand. Mykobakterien-Arten enthalten einen membrankovalenten Komplex, der Arabinogalactan, Peptidoglycan und lange Ketten von Mykolsäuren mit Typen umfasst, die sich zwischen mykobakterienarten unterscheiden. Darüber hinaus können Mykobakterien auch Lipide produzieren, die sich nicht kovalent auf ihren Zelloberflächen befinden, wie Phthiocerol-Dimycocerosate (PDIM), phenolische Glykolipide (PGL), Glykopeptidolipide (GPL), Acyltrehalose (AT) oder Phosphatidil-Inositol-Mannosiside (PIM). Einige von ihnen gelten als Virulenzfaktoren in pathogenen Mykobakterien oder kritische antigene Lipide in der Wirt-Mykobakterien-Interaktion. Aus diesen Gründen besteht ein erhebliches Interesse an der Untersuchung von mykobakteriellen Lipiden aufgrund ihrer Anwendung in verschiedenen Bereichen, vom Verständnis ihrer Rolle bei der Pathogenität von Mykobakterieninfektionen bis hin zu einer möglichen Implikation als immunmodulatorische Mittel für die Behandlung von Infektionskrankheiten und anderen Pathologien wie Krebs. Hier wird ein einfacher Ansatz zur Extraktion und Analyse des Gesamtlipidgehalts und der Mykolsäurezusammensetzung von Mykobakterienzellen vorgestellt, die in einem festen Medium unter Verwendung von Mischungen organischer Lösungsmittel gezüchtet wurden. Sobald die Lipidextrakte erhalten sind, wird eine Dünnschichtchromatographie (TLC) durchgeführt, um die extrahierten Verbindungen zu überwachen. Das Beispielexperiment wird mit vier verschiedenen Mykobakterien durchgeführt: dem schnell wachsenden Mycolicibacterium brumae und Mycolicibacterium fortuitum, dem abgeschwächten langsam wachsenden Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG) und dem opportunistischen Erreger Mycobacterium abscessus, was zeigt, dass die im vorliegenden Protokoll gezeigten Methoden bei einer Vielzahl von Mykobakterien eingesetzt werden können.

Einleitung

Mycobacterium ist eine Gattung, die pathogene und nicht-pathogene Arten umfasst, die sich durch eine hochhydrophobe und undurchlässige Zellwand auszeichnen, die durch ihre eigenartigen Lipide gebildet wird. Insbesondere enthält die mykobakterielle Zellwand Mykolsäuren, α-Alkyl- und β-Hydroxyfettsäuren sind, bei denen der α-Zweig in allen Mykolsäuren (mit Ausnahme der Länge) konstant ist und die β-Kette, die Meromykolatkette genannt, eine lange aliphatische Kette ist, die verschiedene funktionelle chemische Gruppen enthalten kann, die zusammen mit der Literatur beschrieben werden (α-, α'-, Methoxy-, κ-, Epoxid-, Carboxy- und ω-1-Methoxy-Mykolaten), die daher sieben Arten von Mykolsäuren (I-VII) produzieren1. Darüber hinaus sind auch andere Lipide von unbestreitbarer Bedeutung in der Zellwand von Mykobakterienarten vorhanden. Pathogene Arten wie Mycobacterium tuberculosis, der Erreger der Tuberkulose2 produzieren spezifische lipidbasierte Virulenzfaktoren wie Phthiocerol-Dimycocerosate (PDIMs), phenolisches Glykolipid (PGL), Di-, Tri- und Penta-Acyltrehalose (DAT, TAT und PAT) oder Sulfolipide, unter anderem3. Ihre Anwesenheit auf der mykobakteriellen Oberfläche wurde mit der Fähigkeit in Verbindung gebracht, die Immunantwort des Wirts und damit die Evolution und Persistenz des Mykobakteriums im Wirt zu modifizieren4. Zum Beispiel wurde das Vorhandensein von Triacylglycerinen (TAG) mit dem hypervirulenten Phänotyp der Lineage 2-Beijing-Unterlinie von M. tuberculosis, möglicherweise aufgrund seiner Fähigkeit, die Immunantwort des Wirts abzuschwächen5,6. Andere relevante Lipide sind Lipooligosaccharide (LOS), die in tuberkulösen und nichttuberkulösen Mykobakterien vorkommen. Im Falle von Mycobacterium marinumhängt das Vorhandensein von LOSs in seiner Zellwand mit der gleitenden Motilität und der Fähigkeit, Biofilme zu bilden, zusammen und stört die Erkennung durch Makrophagenmustererkennungsrezeptoren, was die Aufnahme und Ausscheidung der Bakterien durch Wirtspagoozyten beeinflusst7,8. Darüber hinaus ermöglicht das Fehlen oder Vorhandensein einiger Lipide die Klassifizierung von Mitgliedern derselben Spezies in verschiedene Morphotypen mit virulenten oder dämpfenden Profilen, wenn sie mit Wirtszellen interagieren. Zum Beispiel das Fehlen von Glykopeptidolipiden (GPL) im groben Morphotyp von Mycobacterium abscessus wurde mit der Fähigkeit in Verbindung gebracht, eine intraphagosomale Übersäuerung und folglich Zellapoptose zu induzieren9, im Gegensatz zum glatten Morphotyp, der GPLs in seiner Oberfläche besitzt. Darüber hinaus hängt der Lipidgehalt der mykobakteriellen Zellwand mit der Fähigkeit zusammen, die Immunantwort im Wirt zu modifizieren. Dies ist relevant im Zusammenhang mit der Verwendung einiger Mykobakterien, um ein schützendes Immunprofil gegen verschiedene Pathologien auszulösen10,11,12,13. Es wurde beispielsweise nachgewiesen, dass Mycolicibacterium vaccae, ein saprophytisches Mykobakterium, das sich derzeit in klinischen Phase-III-Studien als immuntherapeutischer Impfstoff gegen Tuberkulose befindet, weisen zwei koloniale Morphotypen auf. Während der glatte Phänotyp, der ein Polyester in seiner Oberfläche enthält, eine Th2-Reaktion auslöst, kann der raue Phänotyp ohne Polyester ein Th1-Profil induzieren, wenn er mit Immunzellen des Wirts interagiert.14. Das Repertoire der in der mykobakteriellen Zelle vorhandenen Lipide hängt nicht nur von mykobakterienarten ab, sondern auch von den Bedingungen der mykobakteriellen Kulturen: Zeitpunkt der Inkubation15,16 oder Zusammensetzung des Kulturmediums17,18. Tatsächlich beeinflussen Veränderungen in der Zusammensetzung des Kulturmediums die Antitumor- und immunstimulierende Aktivität von M. bovis BCG und Mycolicibacterium brumae in vitro17. Darüber hinaus wird das schützende Immunprofil ausgelöst durch M. bovis BCG gegen M. tuberculosis Die Herausforderung in Mäusemodellen hängt auch von den Nährmedien ab, in denen M. bovis BCG wächst17. Diese könnten dann mit der Lipidzusammensetzung der Mykobakterien in jedem Kulturzustand zusammenhängen. Aus all diesen Gründen ist die Untersuchung des Lipidgehalts von Mykobakterien relevant. Ein visuelles Verfahren zur Extraktion und Analyse der Lipidzusammensetzung der mykobakteriellen Zellwand wird vorgestellt.

Protokoll

1. Extraktion der gesamten nicht-kovalenten Lipide aus Mykobakterien (Abbildung 1)

  1. 0,2 g Mykobakterien aus einem festen Medium zerkratzen und mit einem Polytetrafluorethlen (PTFE)-Liner-Schraubverschluss in ein Glasrohr geben. Fügen Sie eine Lösung hinzu, die aus 5 ml Chloroform und 10 ml Methanol (Chloroform: Methanol, 1: 2) besteht.
    HINWEIS: Wenn organische Lösungsmittel verwendet werden, sollte nur Glasempfänger verwendet werden. Kunststoffbehälter sind nicht erlaubt. Darüber hinaus werden PTFE-Liner-Schraubverschlüsse für Flaschen benötigt.
    ACHTUNG: Chloroform ist eine potenziell giftige und extrem gefährliche Substanz. Es muss in einer Laminar-Flow-Kapuze mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden.
    ACHTUNG: Methanol ist eine potenziell giftige und extrem gefährliche Substanz. Es muss in einer Laminar-Flow-Kapuze mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden.
  2. Lassen Sie das Röhrchen über Nacht unter ständigem Rühren, um nicht-kovalente Lipide aus der mykobakteriellen Zelloberfläche zu extrahieren.
    HINWEIS: Wenn keine orbitale Schüttelplattform verfügbar ist, kann das ständige Rühren so oft wie möglich durch regelmäßiges manuelles Rühren ersetzt werden.
  3. Decken Sie einen Glastrichter mit einem Filterpapier ab, filtern Sie die organischen Lösungsmittel und sammeln Sie sie in einem Glasrohr.
  4. Verwenden Sie einen Stickstoffgasfluss, um die flüssige Phase im Rohr zu verdampfen. Füllen Sie das Rohr mit Stickstoffgas, decken Sie es ab und lagern Sie es bei 4 °C.
    HINWEIS: Schließen Sie eine Pasteur-Pipette aus Glas an den Stickstoffgasstrom an, um das gewünschte Rohr gezielt zu verdampfen. Halten Sie das Rohr zusätzlich in einer Trockenblockheizung für Rohre bei 37 ° C. Wenn das Lösungsmittel verdampft, füllen Sie das Rohr mit Stickstoffgas, bevor Sie es schließen.
  5. 15 ml einer Lösung von Chloroform:Methanol (2:1) zu den Zelltrümmern hinzufügen. Lassen Sie das Röhrchen über Nacht unter ständigem Rühren, um nicht-kovalente Lipide aus der mykobakteriellen Zelloberfläche zu extrahieren.
    HINWEIS: Wenn keine orbitale Schüttelplattform verfügbar ist, kann das ständige Rühren so oft wie möglich durch regelmäßiges manuelles Rühren ersetzt werden.
  6. Lassen Sie die Mischung für 1 h ruhen. Mit einer Pasteur-Pipette die organischen Lösungsmittel zurückgewinnen. Decken Sie einen Glastrichter mit einem Filterpapier ab, filtern Sie die organischen Lösungsmittel und sammeln Sie sie in demselben Glasröhrchen, das zuvor in Schritt 1.3 verwendet wurde. Verwenden Sie einen Stickstoffgasfluss, um die flüssige Phase im Rohr zu verdampfen. Füllen Sie das Rohr mit Stickstoffgas, schließen Sie es und lagern Sie es wieder bei 4 °C.

2. Mykolsäureextraktion durch saure Methanolyse (Abbildung 2A)

  1. 2-5 ml Veresterungslösung in ein hermetisches Glasrohr mit einem PTFE-Liner-Schraubverschluss geben. Fügen Sie 0,2 g Mykobakterien-Biomasse in das Glasrohr hinzu.
    HINWEIS: Veresternde Lösung wird durch Mischen von 30 ml Methanol, 15 ml Toluol und 1 ml Schwefelsäure gebildet. Mykobakterienzellen können aus festen Kulturen oder sogar aus entgifteten Zellen entnommen werden, nachdem insgesamt nicht-kovalente Lipide aus Mykobakterien entnommen wurden (verbleibende Zellen nach Filterung in Schritt 1.6).
    ACHTUNG: Toluol ist ein brennbarer und extrem gefährlicher Stoff. Es muss in einer Laminar-Flow-Kapuze mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden.
    ACHTUNG: Schwefelsäure ist ein ätzendes und gefährliches Nährstoff. Es muss in einer Laminar-Flow-Kapuze mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden.
  2. Mischen Sie den Inhalt durch Vortexing. Lassen Sie die Mischung über Nacht in einem trockenen Bad bei 80 °C stehen.
  3. Lassen Sie das Röhrchen abkühlen, bis es die Raumtemperatur erreicht hat, und fügen Sie dann 2 mL n-Hexan in das Rohr hinzu. Mischen Sie den Inhalt durch Wirbeln für 30 s und lassen Sie das Rohr absetzen, bis zwei klare Phasen erscheinen.
    ACHTUNG: n-Hexan ist ein potenziell brennbarer, reizender, umweltschädlicher und extrem gefährlicher Stoff. Es muss in einer Laminar-Flow-Kapuze mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden.
  4. Rückgewinnung der oberen Phase, die der n-Hexanphase entspricht. Übertragen Sie es in eine neue Röhre.
  5. Wiederholen Sie Schritt 2.3. Stellen Sie die obere Phase wieder her und übertragen Sie sie auf das gleiche Rohr, das in Schritt 2.4 verwendet wurde.
  6. Verdampfen Sie den Inhalt des Rohres mit einem Stickstoffgasfluss. Füllen Sie das Rohr mit Stickstoffgas, schließen Sie es und lagern Sie es bei 4 °C.

3. Mykolsäureextraktion durch Verseifung und Methylierung (Abbildung 2B)

  1. 0,2 g Mykobakterien aus einem festen Medium zerkratzen und mit einem PTFE-Schraubverschluss in ein Glasrohr geben.
  2. Fügen Sie 2 ml Methanol-Benzol-Lösung (80:20) hinzu, die 5% ige Kaliumhydroxid enthält. Mischen Sie den Inhalt durch Vortexing. Die Mischung 3 h bei 100 °C erhitzen.
    ACHTUNG: Benzol ist ein brennbarer, krebserregender und gefährlicher Stoff. Es muss in einer Laminar-Flow-Kapuze mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden.
  3. Lassen Sie das Rohr auf Raumtemperatur abkühlen. Fügen Sie 20% Schwefelsäure hinzu, um die Proben zu säuern, um einen pH-Wert von = 1 zu erreichen.
  4. Fügen Sie 3 ml Diethylether hinzu. Mischen Sie den Inhalt vorsichtig durch Wirbeln.
  5. Lassen Sie die beiden Phasen durch Absetzen bilden. Rückgewinnung der Diethyletherphase und Übergabe an ein neues Rohr. Wiederholen Sie den Waschschritt insgesamt dreimal.
  6. Waschen Sie den Diethyletherextrakt mit 2 ml destilliertem Wasser und übertragen Sie den oberen Teil, der dem Diethylether entspricht, in ein neues Röhrchen. Wiederholen Sie den Waschschritt insgesamt dreimal.
  7. Fügen Sie 2 g wasserfreies Natriumsulfat über den Diethyletherextrakt hinzu, um es zu trocknen.
  8. Filtern Sie die Suspension. Verdampfen Sie den Inhalt mit einem Stickstoffgasfluss.
  9. Um den Methylierungsschritt durchzuführen, lösen Sie 3 g N-Nitroso-N-methylharnstoff in einer vorgekühlten Lösung, die aus 45 ml Diethylether und 9 ml 40% KOH in destilliertem Wasser gebildet wird.
    ACHTUNG: N-Nitroso-N-methylharnstoff ist ein giftiger, reizender, krebserregender und gefährlicher Stoff. Es muss in einer Laminar-Flow-Kapuze mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden.
  10. Den Überstand (Diazomethan) in einen neuen Kolben geben, der in eishaltigen Kaliumhydroxidpellets (ca. 30 g) gekühlt wird.
    HINWEIS: Wenn der Überstand nicht sofort verwendet wird, kann er bei -20 °C für maximal 1 h gelagert werden.
    VORSICHT: Kaliumhydroxidpellets sind eine reizende und ätzende Substanz. Dieses Material muss in einer Laminar-Flow-Kapuze mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden.
    ACHTUNG: Diazomethan ist hochgiftig und potenziell explosiv. Es muss in einer Laminar-Flow-Kapuze mit Sicherheitsglas verwendet werden, die mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) getragen wird.
  11. 2 ml der Diazomethan enthaltenden Etherlösung, erhalten in Schritt 3.10, werden in den getrockneten Diethyletherextrakt, der Mykolsäuren enthält, zugegeben, der in Schritt 3.8 erhalten wurde. 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  12. Verdampfen Sie die Suspension bei 40 °C. Füllen Sie das Röhrchen mit Stickstoffgas, schließen Sie es und lagern Sie die methylierten Lipide bei 4 °C.
    HINWEIS: Verdampfen Sie das Diazomethan aus der Etherlösung unter der laminaren Strömungshaube, bis der Ether die gelbe Farbe verliert.

4. Dünnschichtchromatographie (TLC) Analyse

  1. Sättigen Sie die Glas-TLC-Kammer. Bedecken Sie dazu eine der Wände der TLC-Kammer mit einem Stück Filterpapier und lassen Sie sie mit der mobilen Phase in Kontakt treten, die aus dem Lösungsmittelgemisch besteht. Legen Sie das verbleibende Volumen des Lösungsmittels auf den Boden der TLC-Kammer.
    HINWEIS: Der Boden der TLC-Kammer muss von mindestens 1 cm der mobilen Phase bedeckt sein. In den vorliegenden Experimenten wurden verschiedene mobile Phasen zur Entwicklung der TLCs verwendet. Sie bestanden aus 85 ml n-Hexan plus 15 ml Diethylether; 100 ml Dichlormethan; 90 ml Chloroform, 10 ml Methanol und 1 ml Wasser; 30 ml Chloroform plus 8 ml Methanol und 1 ml Wasser; 60 ml Chloroform plus 35 ml Methanol und 8 ml Wasser; 95 ml Chloroform plus 5 ml Methanol; und 90 mL Petrolether (60-80 °C) plus 10 ml Diethylether.
    HINWEIS: Verwenden Sie im zweidimensionalen TLC dreimal n-Hexan:Aceton (95:5) in der ersten Richtung und verwenden Sie eine einzige Entwicklung mit Toluol:Aceton (97:3) in der zweiten Richtung, um die Mykolsäurezusammensetzung zu analysieren. Um PIMs zu analysieren, verwenden Sie Chloroform:Methanol:Wasser (60:30:6) einmal in die erste Richtung und Chloroform:Essigsäure:Methanol:Wasser (40:25:3:6) in die zweite Richtung. Um PDIM und AG zu analysieren, verwenden Sie Petrolether (60-80 °C): Ethylacetat (98: 2) in der ersten Richtung dreimal und verwenden Sie eine einzige Entwicklung mit Petrolether (60-80 ° C): Aceton (98: 2) in der zweiten Richtung.
    ACHTUNG: Diethylether ist ein potenziell toxischer und gefährlicher Stoff. Es muss in einer Laminar-Flow-Kapuze mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden.
    ACHTUNG: Dichlormethan ist ein potenziell toxischer und gefährlicher Stoff. Es muss in einer Laminar-Flow-Kapuze mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden.
    ACHTUNG: Petrolether ist ein potenziell brennbarer, umweltschädlicher und extrem gefährlicher Stoff. Es muss in einer Laminar-Flow-Kapuze mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden.
    ACHTUNG: Essigsäure ist eine potenziell brennbare und ätzende Substanz. Es muss in einer Laminar-Flow-Kapuze mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden.
    ACHTUNG: Ethylacetat ist ein brennbarer und gefährlicher Stoff. Es muss in einer Laminar-Flow-Kapuze mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden.
    ACHTUNG: Aceton ist ein brennbarer und gefährlicher Stoff. Es muss in einer Laminar-Flow-Kapuze mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden.
  2. Schließen Sie die TLC-Kammer, um sie für mindestens 20 Minuten zu sättigen. In der Zwischenzeit lösen Sie die im Glasrohr vorhandenen Lipide in 0,2-1 ml Chloroform auf.
    HINWEIS: Das Volumen, das zum Auflösen der Lipide verwendet wird, kann in Abhängigkeit von der gewünschten oder erwarteten Konzentration der Probe modifiziert werden.
  3. Tragen Sie 10 μL jeder Suspension mit einem Kapillarglasröhrchen direkt auf die TLC-Platte auf und lassen Sie die Probe 5 min bei Raumtemperatur trocknen.
    HINWEIS: Die Proben müssen am unteren Teil der Platte angebracht werden, wobei auf jeder Seite 1 cm übrig bleibt. Die Proben müssen mindestens 0,5 cm voneinander getrennt werden. Nach dem Auftragen der Probe auf die Platte können die Röhrchen wieder mit Stickstoffgas verdampft und bei 4 °C für die weitere Verwendung gelagert werden.
  4. Setzen Sie die Platte in die gesättigte TLC-Kammer ein, die die mobile Phase enthält. Lassen Sie die mobile Phase durch den TLC laufen.
    HINWEIS: Jede Bewegung, die auf die TLC-Kammer angewendet wird, wirkt sich auf das laufende Lösungsmittel auf der Platte aus und beeinträchtigt die Lipidmobilität. Bei der Durchführung von zweidimensionalem TLC sind zwei TLC-Kammern erforderlich, die beide Elutionssysteme enthalten.
  5. Entfernen Sie die Platte aus der TLC-Kammer, wenn das Lösungsmittel 1 cm Vom oberen Ende der Platte entfernt ist. Lassen Sie die Platte unter laminarem Flussmittel, bis die Kieselsäure vollständig getrocknet ist.
    HINWEIS: Bei der Analyse der Mykolsäurezusammensetzung unter Verwendung von n-Hexan und Diethylether (85:15) wiederholen Sie die Schritte 4.4 und 4.5 zweimal mehr, bis die mobile Phase dreimal über die TLC-Platte läuft.
  6. Zeigen Sie die Platte mit dem erforderlichen Fleck; Erhitzen Sie die Platte bei Bedarf.
    HINWEIS: Im vorliegenden Experiment wurden 15-20 ml der folgenden Lösungen verwendet, um die TLC-Platten zu sprühen: 10% Molybdatophosphorsäurehydrat in Ethanol, bis die Platte hellgelb ist, gefolgt von erhitzen der Platte bei 120 ° C; 5% in Ethanol von 20% α-Naphthol in Schwefelsäure, gefolgt von Erhitzen der Platte bei 120 °C; Molybdänblaues Reagenz (1,3% Molybdänoxid in 4,2 M Schwefelsäure), bis Phosphatbänder oder 1% Anthron in Schwefelsäure auftraten.
    ACHTUNG: Molybdatophosphorsäurehydrat ist eine brennbare und ätzende Substanz. Es muss in einer Laminar-Flow-Kapuze mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden.
    ACHTUNG: Ethanol ist ein potenziell brennbarer und gefährlicher Stoff. Es muss in einer Laminar-Flow-Kapuze mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden.
    ACHTUNG: 1-Naphthol ist eine brennbare, ätzende und extrem gefährliche Substanz. Es muss in einer Laminar-Flow-Kapuze mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden.
    ACHTUNG: Molybdän Blue Spray Reagenz ist eine ätzende, giftige und extrem gefährliche Substanz. Es muss in einer Laminar-Flow-Kapuze mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Nitrilhandschuhe) verwendet werden.

Ergebnisse

Mit dem Ziel, eine breite Palette von Lipiden in verschiedenen Mykobakterienarten zu zeigen, wurde M. bovis BCG ausgewählt, da es sich um raue und langsam wachsende Mykobakterien handelt. Die rauen und schnell wachsenden M. fortuitum und M. brumae wurden in das Verfahren aufgenommen und schließlich wurde auch der glatte Morphotyp von M. abscessus einbezogen. Diese vier Arten ermöglichen es uns, ein breites Spektrum von mykobakterienbasierten Lipiden wie Acyltrehalose (AT), GPLs, PDI...

Diskussion

Ein einfaches Protokoll, das als Goldstandardmethode für die Extraktion von nichtkovalent verknüpften Lipidverbindungen aus der mykobakteriellen Zellwand gilt, wird vorgestellt. Weitere Visualisierungen durch ein- und zweidimensionale TLCs aus den extrahierten Lipiden von vier verschiedenen Mykobakterien werden gezeigt.

Zwei aufeinander folgende kombinierte Mischungen von Chloroform und Methanol zur Wiederherstellung des Lipidgehalts von Mykobakterienzellen ist die am weitesten verbreitete L...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Danksagungen

Diese Forschung wurde vom spanischen Ministerium für Wissenschaft, Innovation und Universitäten (RTI2018-098777-B-I00), den FEDER Funds und der Generalitat of Catalunya (2017SGR-229) finanziert. Sandra Guallar-Garrido ist Trägerin eines PhD-Vertrags (FI) der Generalitat de Catalunya.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic AcidMerck100063CAUTION. Anhydrous for analysis EMSURE® ACS,ISO,Reag. Ph Eur
AcetoneCarlo Erba400971NCAUTION. ACETONE RPE-ACS-ISO FOR ANALYS ml 1000
AnthroneMerck8014610010Anthrone for synthesis.
BenzeneCarlo Erba426113CAUTION. Benzene RPE - For analysis - ACS 2.5 l
Capillary glass tubeMerckBR708709BRAND® disposable BLAUBRAND® micropipettes, intraMark
ChloroformCarlo Erba412653CAUTION. Chloroform RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with ethanol 2.5 L
Dry block heaterJ.P. Selecta7471200
DicloromethaneCarlo Erba412622CAUTION. Dichloromethane RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with amylene 2.5 L
Diethyl etherCarlo Erba412672CAUTION. Diethyl ether RS - For HPLC - Isocratic grade - Not stabilized 2.5 L
Ethyl AcetatePanreac1313181211CAUTION. Ethyl acetate (Reag. USP, Ph. Eur.) for analysis, ACS, ISO
Ethyl Alcohol AbsoluteCarlo Erba4146072CAUTION. Ethanol absolute anhydrous RPE - For analysis - ACS - Reag. Ph.Eur. - Reag. USP 1 L
Glass funnelVidraFOCDURA.2133148 1217/1
Glass tubeVidraFOCVFOC.45066A-16125Glass tube with PTFE recovered cap
MethanolCarlo Erba412722CAUTION. Methanol RS - For HPLC - GOLD - Ultragradient grade 2.5 L
Molybdatophosphoric acid hydrateMerck51429-74-4CAUTION.
Molybdenum Blue Spray Reagent, 1.3%SigmaM1942-100MLCAUTION.
n-hexaneCarlo Erba446903CAUTION. n-Hexane 99% RS - ATRASOL - For traces analysis 2.5 L
n-nitroso-n-methylureaSigmaN4766CAUTION
Orbital shaking platformDDBiolab995018NB-205L benchtop shaking incubator
Petroleum ether (60-80ºC)Carlo Erba427003CAUTION. Petroleum ether 60 - 80°C RPE - For analysis 2.5 L
SprayerVidraFOC712/1
Sodium sulphate anhydrousMerck238597
Sulfuric acid 95-97%Merck1007311000CAUTION. Sulfuric acid 95-97%
TLC chamberMerckZ204226-1EARectangular TLC developing tanks, complete L × H × W 22 cm × 22 cm × 10 cm
TLC plateMerck1057210001TLC SilicaGel 60- 20x20 cm x 25 u
TLC Plate HeaterCAMAG223306CAMAG TLC Plat Heater III
TolueneCarlo Erba488551CAUTION. Toluene RPE - For analysis - ISO - ACS - Reag.Ph.Eur. - Reag.USP 1 L
VortexFisher Scientific10132562IKA Agitador IKA vórtex 3
1-naphtholSigma-Aldrich102269427CAUTION.

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