Eine robuste Methode zum Verpacken von hochauflösenden C18 RP-Nano-HPLC-Säulen

Zusammenfassung

Hier präsentieren und evaluieren wir ein Protokoll zur Herstellung kostengünstiger Umkehrphasen-Nanofluss-Flüssigkeitschromatographiesäulen für die Peptidcharakterisierung unter Verwendung von LC-MS/MS-Proteom-Workflows.

Zusammenfassung

Die hohe Komplexität, die in biologischen Proben vorherrscht, erfordert chromatographische Trennungen mit hoher Empfindlichkeit und Auflösung, um effektiv analysiert werden zu können. Hier stellen wir ein robustes, reproduzierbares und kostengünstiges Protokoll für die Herstellung von Nanofluss-Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Säulen (RP-HPLC) für die Online-Trennung von analytischen Peptiden vor, bevor sie in traditionelle Bottom-up-Proteomik-Arbeitsabläufe eingeführt und mit einem Massenspektrometer detektiert werden. Abhängig vom Ziel des Experiments und den chemischen Eigenschaften der zu trennenden Analyten können sich die optimalen Säulenparameter in ihren Innen- oder Außendurchmessern, ihrer Länge, der Partikelgröße, der Porengröße, der Chemie der Partikel der stationären Phase und dem Vorhandensein oder Fehlen eines integrierten Elektrospray-Emitters an der Spitze unterscheiden. Ein hauseigenes Säulenpacksystem ermöglicht nicht nur die schnelle Herstellung von Säulen mit den gewünschten Eigenschaften, sondern reduziert auch die Kosten des Prozesses drastisch. Das hier besprochene optimierte Protokoll für die Packung einer C18 AQ (wässrigen) Quarzglassäule ist mit einer Vielzahl von flüssigchromatographischen Instrumenten kompatibel, um eine effektive Trennung von Analyten zu erreichen.

Einleitung

HPLC-Säulen haben immens zur Produktivität in den Bereichen Pharmazie, Medizin und Umweltforschung beigetragen 1,2,3,4. Der Zugang zu hochwertigen Chromatographiesäulen ist ein entscheidender Schritt bei der Fraktionierung komplexer Analyten. In der Schrotflintenproteomik wird eine hohe analytische Empfindlichkeit routinemäßig durch die Kopplung der Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (ESI) mit der Nanoflow-Chromatographie erreicht 5,6,7,8. Die effiziente Trennung von Tausenden von Peptiden ist in dieser Anwendung von größter Bedeutung, da sie es dem Massenspektrometer ermöglicht, Analyten mit hoher Empfindlichkeit und Auflösung zu identifizieren und zu quantifizieren.

Das Gebiet der Säulenpackung für massenspektrometrische Anwendungen hat in den letzten Jahren ein enormes Wachstum erlebt, mit Fortschritten im Verständnis der grundlegenden Prinzipien der Säulenpackung in Bezug auf die Morphologie der stationären Phase, die Lösungsmittel-Partikel-Wechselwirkungen und das Hardware-Design, was die detaillierte Charakterisierung einer Vielzahl von Biomolekülen in komplexen biologischen Umgebungen ermöglicht 9,10,11,12,13,14 . Die Bemühungen, praktische Überlegungen zum Verpacken von analytischen Säulen für LC-MS-Zwecke hervorzuheben, haben den Weg für Proteom-Laboratorien geebnet, hauseigene Packungssysteme zu entwickeln, die ihren spezifischen Interessen entsprechen und maximale Leistung versprechen 15,16,17,18.

Nanospray-Säulen mit Innendurchmessern im Bereich von 50-150 μm und konischen Enden eignen sich gut für die Elektrospray-Ionisation. Auf dem Gebiet der Shotgun-Proteomik werden Trennungen typischerweise unter Verwendung eines Lösungsmittelgradienten durchgeführt, der durch eine gepackte unpolare stationäre Phase fließt, am häufigsten hydrophobe kohlenstoffkettengebundene Kieselsäure (C8-C30) mit Partikelgrößen zwischen 1,7 und 3,5 μm 19,20,21,22. Die eluierenden Analyten werden über einen in die Säule integrierten ESI-Emitter emittiert, der eine sanfte Ionisation von Lösungsphasenanalyten zu gasförmigen Ionen gewährleistet. Die Kopplung von LC-Säulen mit ESI-MS hat die Anwendung der Tandem-Massenspektrometrie auf proteomische Strategien in den biomedizinischen Wissenschaften erheblich vorangetrieben.

LC-Säulen mit schmalen Innendurchmessern führen zu schmaleren chromatographischen Peaks und einer höheren Empfindlichkeit im Vergleich zu Mikroflow-Säulen mit höherer Bohrung und sind daher besonders vorteilhaft bei proteomischen Arbeitsabläufen. Obwohl im Handel erhältliche vorgepackte LC-Säulen aufgrund ihrer Bequemlichkeit und Benutzerfreundlichkeit attraktive Optionen sind, können sie unerschwinglich teuer und weniger flexibel sein als hauseigene Optionen. Das Ziel dieser Arbeit ist es, einen technisch einfachen und kostengünstigen Slurry-Packansatz zur Herstellung von Umkehrphasen-HPLC-Säulen mit schmalem Innendurchmesser unter Verwendung von Quarzglaskapillaren und einem eigens entwickelten Druckbombensystem für proteomische Anwendungen zu beschreiben.

Protokoll

1. Vorbereitung der Kapillarspitze

1. Schneiden Sie mit einem keramischen Spaltstein ca. 60-70 cm einer mit Polyimid beschichteten Quarzglaskapillare mit einem Innendurchmesser (ID) von 75 μm und einem Außendurchmesser (OD) von 360 μm ab.
2. Halten Sie die Kapillare mit den Händen etwa in der Mitte ihrer Länge, lassen Sie einen Abstand von 4-5 cm zwischen den Fingern und erhitzen Sie den Bereich in der Lücke, während Sie ihn über die Flamme einer Alkohollampe drehen. Polieren Sie die verbrannte Stelle mit einem mit Methanol getränkten, fusselarmen Tuch sauber, bis das Glas sichtbar ist. (Abbildung 1).
   HINWEIS: 4-5 cm der mit Polyimid beschichteten Quarzglaskapillare müssen freigelegt und poliert werden, bevor sie in den Laserabzieher geladen werden können.
3. Um einen kegelförmigen Emitter für ESI zu ziehen, verwenden Sie einen Laserspitzenabzieher mit speziellen Programmeinstellungen von einem Heizwert von 300 (entspricht 2 Watt Laserleistung), einer Geschwindigkeit von 10 (entspricht 0,25 mm/s) und einer Verzögerung von 180 Millisekunden, um eine Spitze mit einem Durchmesser von ~1-5 μm zu erhalten (Abbildung 2 und Abbildung 3A). Laden Sie den polierten Teil der Kapillare in den Laserabzieher und drücken Sie den Zug, so dass zwei leere Kapillarsäulen zum Verpacken bereit sind.
   HINWEIS: Die häufige Inspektion der Spitze bei jedem Schritt erfolgt mit einem Mikroskop. Die Einstellungen werden wahrscheinlich zwischen den Laserabziehern unterschiedlich sein und müssen empirisch bestimmt werden.

2. Polymerisation/Ätzen der Spitze

1. Um die Partikel der stationären Phase im Kapillarrohr zurückzuhalten, wird eine poröse Fritte aus einem Gemisch aus zwei Kaliumsilikatlösungen und Formamid hergestellt. Stellen Sie die Lösung unmittelbar vor Gebrauch in einem 2-ml-Röhrchen her und mischen Sie sie mit einem Wirbel.
   1. Mischen Sie zwei Kaliumsilikatlösungen mit einem_SiO2/K2-O-Verhältnis von 2,50 (w/w) und 1,65 (w/w) und Formamid in einem Verhältnis von 1:3:1 (v/v/v). Mischen Sie beispielsweise 100 μl Kaliumsilikat mit einem_SiO2/K2O-Verhältnis von 2,50 (w/w), 300 μl Kaliumsilikat mit einem_{SiO2/K2O-Verhältnis}von 1,65 (w/w)) und 100 μl Formamid, gefolgt von Vortexing. Diese Lösung polymerisiert beim Erhitzen und erzeugt eine poröse Fritte.
2. Tauchen Sie die lasergezogene Kapillarspitze etwa 10-20 Sekunden lang in die klare Mutterlauge der Frittensuspension (nicht in den Niederschlag) ein, so dass sie durch Kapillarwirkung etwa 5 mm in die Spitze eindringen kann. Abhängig von der Breite der Spitze kann es erforderlich sein, die Spitze länger in der Frittenlösung zu halten. Im Allgemeinen ist die Tauchzeit kürzer, wenn die Spitze breiter ist, da die Lösung schneller in die Spitze eindringen kann.
3. Platzieren Sie einen heißen Lötkolben (eingestellt auf 350 °F) entlang der Spitze, um die Polymerisation der Frittenlösung zu initiieren, während Sie die Kapillare unter dem Mikroskop untersuchen. In Abbildung 3 sehen Sie die gezogene Spitze vor (Abbildung 3A) und nach der Polymerisation (Abbildung 3B).
4. Um eine Verstopfung des Emitters nach der Frittenpolymerisation zu verhindern, tauchen Sie die Säulenspitze 5 Minuten lang in eine 50%ige Flusssäure (HF)-Lösung (Aufbau ist in Abbildung 4 dargestellt). Das HF-Ätzen verleiht der Säule auch eine flache kegelförmige Geometrie, was ihre Langlebigkeit erhöht. Stellen Sie nach dem HF-Ätzen sicher, dass die Spitze der Säule gründlich gewaschen wird, zuerst mit HF-Neutralisator und dann großzügig mit Wasser, um den Kontakt mit der Säure zu verhindern.
   ACHTUNG: HF ist eine hochgefährliche und ätzende Chemikalie. Bei der Handhabung ist äußerste Vorsicht geboten, um eine Exposition zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass HF jederzeit mit angemessenem Schutz in einem Abzug gehandhabt wird, der mit einem Schild mit der Aufschrift "Gefahr! Akute Toxine".
   1. Verwenden Sie aus Sicherheitsgründen sowohl normale als auch entflammbare Laborkittel sowie doppelte Schichten Nitril- und Neoprenhandschuhe, wenn Sie mit HF umgehen.
      HINWEIS: Es ist optional, Kapillarspitzen zu frittieren; Es macht die Säule jedoch deutlich widerstandsfähiger gegen Verstopfungen und erhöht ihre Langlebigkeit. Leere Kapillarsäulen aus Quarzglas mit integriertem Elektrospray-Emitter sind im Handel erhältlich und können bei Bedarf als Ersatz für die Schritte 1 und 2 verwendet werden.

3. Vorbereitung der stationären Phase

1. Suspendieren Sie 25-50 mg vollporöse ReproSil-Pur 120 C18-AQ Kieselsäurepartikel mit einer Partikelgröße von 1,9 μm und einer Porengröße von 120 Å in 300 μl Methanol. Pipettieren Sie ca. 20 Mal auf und ab, um eine homogene Mischung der Güllepartikel im Methanol zu gewährleisten.
2. Legen Sie das Rohr mit der Schlammsuspension in die Druckzellenkammer eines selbst gebauten Säulenpackungsbombensystems, das wiederum auf einem Magnetrührer aufgebaut ist, damit die Schlammpartikel in der Schwebe bleiben können. Schließen Sie die Bombe an den Heliumtank (<1500 psi) an, der mit konstantem Druck arbeitet, um eine Störung der HPLC-Aufschlämmung während des Verpackens zu vermeiden. (Schematische Darstellung in Abbildung 5).
3. Sichern Sie den Deckel der Druckmesse, indem Sie ihn mit den Schrauben festziehen, wie in Abbildung 6A gezeigt.
   HINWEIS: Es ist wichtig, den Unterschied in der Funktionsweise einer HPLC-Pumpe und einer HPLC-Packungsbombe zu verstehen. Während erstere für den Betrieb mit konstanter Durchflussrate ausgelegt sind, unabhängig vom Gegendruck, der von der stationären Phase in der Säule ausgeübt wird, arbeiten HPLC-Packungsdrucksysteme mit einem konstanten Druck, um eine ununterbrochene und dichte Packung der stationären Phasenpartikel über die gesamte Länge der Kapillarsäule zu gewährleisten.

4. Bestückung der Säule mit stationärer Phase

1. Fädeln Sie die Säulenunterseite zuerst (nicht gefrittenes offenes Ende) durch die fingerfeste Armatur an der Oberseite der Druckbombe, so dass die Spitze der Säule nach oben zeigt. Schieben Sie die Säule durch, bis sie den Boden des Fläschchens mit der Gülle berührt, und ziehen Sie sie 1-2 mm über den Boden zurück. Ziehen Sie die fingerfeste Armatur fest, um die Säule in Position zu halten.
2. Schließen Sie die Packungsbombe an einen Heliumgastank an (empfohlener Druck < 1500 psi) an und schalten Sie ihn auf einen Druck von ~ 1300 psi ein. Das Heliumgas gelangt durch ein Dreiwegeventil in die Druckzelle, in der sich das Fläschchen mit der Aufschlämmung befindet. Öffnen Sie das Ventil, indem Sie es langsam um 180° im Uhrzeigersinn drehen.
   HINWEIS: Sobald das Heliumgas in die Kammer zu fließen beginnt, drückt es die Aufschlämmung aus dem Rohr in die Kapillare. Wenn die Aufschlämmung die Säule passiert, werden die Partikel in der Kapillare zurückgehalten, während das Lösungsmittel an der Spitze der Säule ein Flüssigkeitströpfchen bildet (Abbildung 6B).
   1. Wenn sich die Bildung von Flüssigkeitströpfchen auf der Säulenspitze verzögert, flammen Sie die Spitze schnell ab, um sicherzustellen, dass sie geöffnet ist. In dieser Phase kann eine Lichtquelle, die hinter der Säule platziert ist, helfen, den Fortschritt des Verpackungsprozesses zu beobachten (Abbildung 7). Bei einer Säule mit einem Innendurchmesser von 75 μm dauert es in der Regel ~30-60 Minuten, um eine Länge von etwa 30 cm zu packen.
   2. Wenn der Fluss der Gülle durch die Säule stoppt oder sich verlangsamt, halten Sie die Kapillare fest über den fingerfesten Sitz der Packungsbombe und lockern Sie sie leicht, indem Sie sie etwa eine Vierteldrehung drehen (es kann ein zischendes Geräusch der Druckentlastung zu hören sein).
      HINWEIS: Auf diese Weise kann die Säule neu positioniert werden, ohne dass die Bombe vollständig drucklos gemacht werden muss.
   3. Positionieren Sie nun die Säule vorsichtig, indem Sie sie auf und ab bewegen, und ziehen Sie dann die fingerfeste Armatur wieder fest, wobei Sie darauf achten müssen, dass die Säule den Boden der Durchstechflasche nicht berührt. Dadurch wird jederzeit ein gleichmäßiger Durchfluss der Gülle durch die Kapillare gewährleistet.
   4. Wenn die oben genannte Maßnahme die Packung nicht wieder aufnehmen kann, schließen Sie das Ventil, entlüften Sie die Packungsbombe, schrauben Sie den Deckel ab und überprüfen Sie die Gülle, um sicherzustellen, dass keine Ausfällungen vorhanden sind. Es ist auch möglich, dass das Säulenende mit festen stationären Phasenpartikeln verstopft ist, in diesem Fall kann das Schneiden eines kleinen Streifens von der Rückseite der Kapillare helfen, den Fluss wieder aufzunehmen.
3. Packen Sie am Ende der Säule einige Zentimeter länger als die gewünschte Länge, um eine vollständige Verpackung der stationären Partikel zu gewährleisten und die Möglichkeit zu minimieren, dass Heliumblasen in die gepackte Säule gelangen.

5. Fertigstellung der Säule und Herstellung der Rückfritte

1. Sobald die gewünschte Packungslänge erreicht ist, schließen Sie das Hauptventil des Heliumgastanks und warten Sie mindestens 15 Minuten, um eine gleichmäßige Packung der Säule zu gewährleisten und das System drucklos zu machen.
   HINWEIS: Um das Eindringen von He-Blasen durch leeres Quarzglas am Ende der Säule zu vermeiden, wird eine längere Packungslänge empfohlen. Es ist von entscheidender Bedeutung, dass der Packungsprozess auch nach dem Füllen des für das Auge sichtbaren Teils der Säule fortgesetzt wird, um die Länge der Kapillare in der Druckkammer zu berücksichtigen. Darüber hinaus wird eine längere Packungslänge empfohlen, wenn eine wiederholte Neupositionierung der Säule erforderlich ist, da dies zu weniger Luftblasen und einer höheren Packungseffizienz führt.
2. Entlasten Sie die Kammer vorsichtig, indem Sie das Ventil um 180 Grad gegen den Uhrzeigersinn in seine ursprüngliche Position drehen. Halten Sie die Säule fest, schrauben Sie die fingerfeste Armatur ab und entfernen Sie die Säule nach und nach. Dieser Schritt muss sehr vorsichtig durchgeführt werden, um das Einbringen von Luftblasen zu vermeiden.
3. Schneiden Sie das Ende der Säule auf eine Länge von 25,5 cm ab. Verwenden Sie bei der Inspektion unter dem Mikroskop einen heißen Lötkolben bei 350 °F, um eine Länge von 0,5 cm der Aufschlämmung vom hinteren Ende der Säule zu entfernen.
   1. Tauchen Sie das hintere Ende der Säule für etwa 10 Sekunden in die übrig gebliebene Frittenlösung aus Schritt 2.1 und polymerisieren Sie sie, indem Sie einen heißen Lötkolben entlang der Rückseite der Säule platzieren, während Sie sie unter dem Mikroskop untersuchen. Die Rückfritte sorgt dafür, dass die ReproSil-Pur 120 C18-AQ Partikel in der Säule verbleiben und verhindert einen Rückfluss bei chromatographischen Wäschen.
      HINWEIS: Die Fritte im hinteren Teil der Säule ist ebenfalls optional, macht die Säule jedoch robuster, wie auch für die vordere Fritte in Schritt 2 festgestellt wurde.

Ergebnisse

Um die Leistung der Säulen zu bewerten, wurden 750 ng tryptische Peptidverdaue, die aus Ganzzelllysaten von HEK293-Zellen hergestellt wurden, online mit einer 25 cm langen Kapillare aus Quarzglas mit einem Innendurchmesser von 75 μm fraktioniert, die im eigenen Haus mit ReproSil-Pur 120 C18-AQ-Partikeln verpackt war, wie im Protokoll beschrieben. Vor der Probenbeladung wurde die Säule mit 6 μl einer Mischung aus Acetonitril, Isopropanol und H₂O in einem Verhältnis von 6:2...

Diskussion

Moderne proteomische Strategien sind auf qualitativ hochwertige chromatographische Trennungen angewiesen, um komplexe biologische Systeme effektiv analysieren zu können. Daher sind leistungsstarke und kostengünstige Nanoflow-LC-Säulen entscheidende Komponenten eines erfolgreichen Tandem-Massenspektrometrie-Regimes, das darauf abzielt, Tausende von Proteinen in einem einzigen Arbeitsablauf zu charakterisieren.

In dieser Studie untersuchten wir die Leistung u...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
99.99% Formamide acid	Sigma-Aldrich		for making frit
alcohol lamp	Any brand		For providing heat
Brechbuehler helium pressure cell	BioSurplus		for packing column
Ceramic column cutter	Any brand		for cutting silica capillary
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥ 99%	Sigma-Aldrich		Stored in a flammable cabinet
Formamide  ≥99.5%	Sigma-Aldrich		for making frit
Hydrofluoric acid (HF) (50%)	Fisher Scientific		for opening the emitter after polymerization
KASIL (Potassium Silicate Solution)	PQ Corporation		for making frit
Orbitrap Fusion Lumos	Thermo Fisher Scientific		for MS data acquisition
P2000 Laser Puller	Sutter		for pulling capillary
PTFE 1/16" Ferrule 0.4 mm ID (long) for Tube Fitting	Chromre	214104	For bomb setting
Reprosil-Pur 120 C18-AQ, 1.9 um, 1g	Dr. Masch GmbH	r119.aq.0001	Batch 5910
Soldering	Any brand		For initiating polimerization
Stainless Steel Pipe Fitting, Hex Coupling, 1/4 in. Female NPT	Swagelok	SS-4-HCG	for bomb setting
TSP075375 fused silica, 75 µm ID x 360 µOD	MOLEX/Polymicro	1068150019	For column tubing
Ultimate 3000 UHPLC	Dionex		HPLC type