Ernte und Disaggregation: Ein übersehener Schritt in der Erforschung von Biofilmmethoden

Zusammenfassung

Dieses Papier beschreibt Methoden, die drei gängige Biofilmernte- und Disaggregationstechniken auf zwei Oberflächentypen demonstrieren, Robustheitstests einer Erntemethode und Mindestinformationen, die bei der Auswahl und Optimierung von Ernte- und Disaggregationstechniken zur Erhöhung der Reproduzierbarkeit zu berücksichtigen sind.

Zusammenfassung

Biofilmmethoden bestehen aus vier verschiedenen Schritten: Züchtung des Biofilms in einem relevanten Modell, Behandlung des reifen Biofilms, Ernte des Biofilms von der Oberfläche und Disaggregation der Klumpen und Analyse der Probe. Von den vier Schritten sind Ernte und Disaggregation die am wenigsten untersuchten, aber dennoch kritisch, wenn man das Potenzial für Testverzerrungen berücksichtigt. Dieser Artikel demonstriert häufig verwendete Ernte- und Disaggregationstechniken für Biofilme, die auf drei verschiedenen Oberflächen gezüchtet werden. Die drei Biofilmernte- und Disaggregationstechniken, die aus einer umfangreichen Literaturrecherche stammen, umfassen Vortexing und Beschallung, Scraping und Homogenisierung sowie Scraping, Vortexing und Beschallung. Es werden zwei Oberflächentypen berücksichtigt: hartes, nicht poröses (Polycarbonat und Borosilikatglas) und poröses (Silikon). Darüber hinaus geben wir Empfehlungen für die Mindestinformationen, die bei der Berichterstattung über die befolgte Erntetechnik enthalten sein sollten, sowie eine begleitende Methode zur Überprüfung auf Verzerrungen.

Einleitung

Die Definition von Biofilm hat sich in den letzten Jahrzehnten weiterentwickelt und umfasst die mikrobielle Assoziation mit einer Vielzahl von biologischen und/oder nicht-biologischen Oberflächen, einschließlich nichtzellulärer ^{Komponenten1,} die ein unterschiedliches Wachstum und eine unterschiedliche genetische ^Expression2 innerhalb einer Matrix aufweisen. Biofilm bietet Schutz vor Umweltbelastungen wie Trocknung und kann die Wirkung chemischer Desinfektionsmittel weniger wirksam machen, was zum Überleben von Mikroben führt. Die Überlebenden in einem Biofilm können möglicherweise eine Quelle für pathogene Mikroorganismen darstellen, die ein Problem für die öffentliche Gesundheit ^darstellen3.

Biofilmmethoden bestehen aus vier Schritten: Wachstum, Behandlung, Probenahme (Ernte und Disaggregation) und Analyse. Das Wachstum, der erste Schritt, bei dem der Benutzer die Wachstumsbedingungen, die Temperatur, die Medien usw. des Organismus bestimmt, wird in der Biofilmliteratur am meisten berücksichtigt und berichtet4,5,6,7. Der Behandlungsschritt bewertet antimikrobielle Mittel (z. B. Desinfektionsmittel), um ihre Wirksamkeit entweder gegen einen reifen Biofilm3,8,9 zu bestimmen, oder das antimikrobielle Mittel kann in die Oberfläche eingearbeitet werden^, um die Fähigkeit des Produkts zu bestimmen, das Wachstum von Biofilmen zu verhindern oder zu ^{reduzieren10.} Der dritte Schritt, die Probenahme, umfasst Schritte zur Ernte des Biofilms von der Oberfläche, auf der er wuchs, und zur Disaggregation der entfernten ^{Klumpen3,8,11}. Der vierte Schritt, die Analyse, kann lebensfähige Zellzahlen, Mikroskopie, Fluoreszenzmessungen, molekulare Ergebnisse und/oder eine Matrixkomponentenbewertung ^umfassen8,9. Die Auswertung der Daten gibt Aufschluss über das Ergebnis eines Experiments. Von den vier ist die Probenahme oft der am meisten übersehene Schritt, da davon ausgegangen wird, dass die gewählte Biofilmernte- und / oder Disaggregationstechnik zu 100% wirksam ist, oft ohne ^{Überprüfung11.}

Planktonische Suspensionen von Bakterien, die oft als homogen angesehen werden, erfordern vor der Analyse eine einfache Wirbelung. Biofilme sind jedoch komplexe Gemeinschaften, die aus Mikroorganismen (prokaryotisch und/oder eukaryotisch), Exopolysacchariden, Proteinen, Lipiden, extrazellulärer DNA und Wirtszellen ^bestehen12. Schritte über traditionelle planktonische mikrobiologische Kulturmethoden hinaus sind erforderlich, um Biofilm von einer Oberfläche adäquat zu ernten und dann in eine homogene Einzelzellsuspension zu disaggregieren. Eine umfangreiche Literaturrecherche (Informationen, die nicht in dieser Veröffentlichung enthalten sind) zeigte, dass die Wahl der Entfernungs- und Disaggregationstechnik von einer Reihe von Faktoren abhängt, einschließlich der im Biofilm vorhandenen Arten, der Oberfläche, an der der Biofilm befestigt ist (nicht porös oder porös), der Zugänglichkeit zu Wachstumsoberflächen (leicht entfernbarer Gutschein oder physische Zerstörung der Vorrichtung, in der der Biofilm wächst), Oberflächengeometrie (Fläche und Form), Dichte des Biofilms auf Wachstumsflächen und verfügbare Laborgeräte.

Wenn Biofilm von einer Oberfläche geerntet wird, ist die resultierende Zellsuspension heterogen. Soll diese ungleichmäßige Suspension genau aufgezählt werden, muss sie in einzelne Zellen disaggregiert werden. Lebensfähige Plattenzählungen gehen davon aus, dass eine koloniebildende Einheit aus einem Bakterium stammt. Wenn Aggregate von Biofilm auf dem Wachstumsmedium platziert werden, ist es unmöglich, einzelne Zellen zu unterscheiden, was zu ungenauen Schätzungen führen könnte. Wenn beispielsweise während der desinfizierenden Wirksamkeitsprüfung der Behandlung der Biofilm im Vergleich zur Kontrolle sehr effektiv von einer Oberfläche entfernt wird, könnte die logarithmische Reduktion im Vergleich zur Kontrolle künstlich groß erscheinen. Auf der anderen Seite scheint ein chemisches Desinfektionsmittel, das Biofilm auf einer Oberfläche fixiert, im Vergleich zur Kontrolle eine geringere Log-Reduktion zu ^haben11. Diese Art von Szenario könnte zu einer verzerrten Interpretation experimenteller Daten führen.

In Vorbereitung auf die Veröffentlichung wurde in einer Literaturübersicht festgestellt, dass gängige Ansätze zur Ernte und Disaggregation von Biofilmen Scraping, Swabbing, Beschallung, Vortexing oder eine Kombination davon umfassen. Scraping ist definiert als die physikalische Entfernung von Biofilm von Oberflächen mit einem sterilen Stab, Spatel oder einem anderen Werkzeug. Tupfen bezieht sich auf das Entfernen von Biofilm von Oberflächen mit einem Baumwollstab oder einem anderen festen saugfähigen Material. Beschallung bezieht sich auf die Störung des Biofilms von Oberflächen durch Ultraschallwellen, die durch Wasser verteilt werden. Vortexing bezieht sich auf die Verwendung eines Mischers, um einen flüssigen Wirbel der Probe in einem Rohr zu erreichen. Bei der Homogenisierung werden rotierende Schaufeln verwendet, um geerntete Biofilmklumpen in eine Einzelzellsuspension zu scheren. In diesem Artikel stellen wir drei Ernte- und Disaggregationsmethoden für zwei verschiedene Oberflächentypen vor, hart/porös und porös.

Eine Liste der empfohlenen Mindestinformationen, die Forscher in die Methodenabschnitte von Publikationen aufnehmen sollten, wird bereitgestellt. Wir hoffen, dass die Einbeziehung dieser Informationen es anderen Forschern ermöglicht, ihre Arbeit zu reproduzieren. Es gibt keine perfekte Ernte- und Disaggregationsmethode, daher werden auch Empfehlungen zur Überprüfung der Technik gegeben.

Drei gängige Methoden zur Ernte und Disaggregation von Biofilmen von gemeinsamen Wachstumsoberflächen werden in diesem Artikel demonstriert. Diese Informationen werden es den Forschern ermöglichen, die Gesamtpräzision und -verzerrung einer Biofilmtestmethode besser zu verstehen. Die beschriebenen Methoden sind wie folgt: (1) Ein Pseudomonas aeruginosa-Biofilm , der auf Polycarbonat-Kupons (harte, nicht poröse Oberfläche) unter hoher Flüssigkeitsscherung im CDC-Biofilmreaktor gezüchtet wird, wird nach einer fünfstufigen Kombination von Vortexing und Beschallung geerntet und disaggregiert, um Biofilmernte und -disaggregation zu erreichen (2) A P. aeruginosa Biofilm, der auf Borosilikatglas-Coupons (harte, nicht poröse Oberfläche) im Tropfstromreaktor unter geringer Flüssigkeitsscherung gezüchtet wird, wird durch Schaben und Homogenisierung geerntet und disaggregiert (3) Ein Escherichia coli-Biofilm , der in Silikonschläuchen (poröse Oberfläche) gezüchtet wird, wird geerntet und durch Schaben disaggregiert, gefolgt von Beschallung und Vortexing.

Protokoll

1. Vortexing und Beschallung

1. Züchten Sie einen reifen P. aeruginosa ATCC 15442 Biofilm, der gemäß ASTM-Standard E25622 angebaut wird.
2. Bereiten Sie am Ende der 48-stündigen Wachstumsperiode die Behandlung des Biofilms und der Probencoupons gemäß ASTM-Standard E28718 vor
3. Aseptisch führen Sie autoklavierte Spritzschutzvorrichtungen mit flammensterilisierten Pinzetten in sterile konische 50-ml-Schläuche ein. Wiederholen Sie dies für alle Tuben, die behandelt werden. Rohre für Steuercoupons benötigen keinen Spritzschutz.
4. Entfernen Sie aseptisch einen zufällig ausgewählten Stab aus dem CDC Biofilm Reactor. Spülen Sie Coupons, um lose gebundene Zellen zu entfernen, indem Sie den Stab vorsichtig in 30 ml steriles gepuffertes Wasser tauchen.
5. Halten Sie die Stange parallel zur Tischplatte, über ein leeres, steriles konisches 50-ml-Rohr und lösen Sie mit einem flammensterilisierten Inbusschlüssel die Stellschraube, um einen biofilmbeschichteten Coupon in das Rohr fallen zu lassen. Wiederholen Sie den Vorgang für die gewünschte Anzahl von Gutscheinen. Entfernen Sie den Spritzschutz und legen Sie ihn zur Sterilisation in einen separaten Behälter.
6. Mit einer serologischen 5-ml-Pipette werden langsam 4 ml der Behandlung oder Kontrolle in die Röhrchen pipettiert, so dass die Flüssigkeit die Innenseite der Rohrwand hinunterfließt.
7. Klopfen Sie vorsichtig auf den Boden des Rohres, damit Luftblasen unter dem Gutschein verdrängt werden. Erlauben Sie 30 - 60 s zwischen jeder Addition.
8. Am Ende der angegebenen Kontaktzeit pipettieren Sie 36 ml Neutralisator in die Röhrchen in der gleichen Reihenfolge, in der die Behandlung (oder Kontrolle) angewendet wurde.
   HINWEIS: Das endgültige Volumen der kombinierten Behandlung und des Neutralisators ist wichtig für die genaue Bestimmung der Biofilm-Log-Dichte.
9. Wirbeln Sie jedes Rohr auf der höchsten Stufe für 30 ± 5 s ein. Stellen Sie sicher, dass ein vollständiger Wirbel erreicht wird.
   HINWEIS: Vorsicht ist geboten, wenn schwere Coupons wie Edelstahl in Glasfläschchen vorgewirbelt werden, bei denen Bruch auftreten könnte.
10. Bestimmen Sie die optimale Anzahl von Röhrchen pro Bad und Platzierung im Reagenzglasgestell, bevor Sie die eigentlichen Proben verarbeiten. Wenn Sie mehrere Proben verarbeiten, vergewissern Sie sich, dass die Wassertemperatur im Beschallungsbad 21 ± 2 ^oC beträgt.
11. Platzieren Sie die Rohre im Rohrgestell, das im entgasten Ultraschallgerät aufgehängt ist, so dass der Wasserstand im Bad dem Flüssigkeitsstand in den Rohren entspricht. Beschallung bei 45 kHz, 100% Leistung und Normalfunktion für 30 ± 5 s. Wiederholen Sie Wirbel- und Beschallungszyklen und enden Sie dann mit einem endgültigen Wirbel (insgesamt 5 Zyklen).
    HINWEIS: Diese Röhrchen mit dem geernteten und disaggregierten Biofilm sind die ¹⁰⁰ oder 0 Verdünnung.
12. Probe in gepuffertem Wasser seriell verdünnen. Platte auf R2A-Agar mit geeigneter Beschichtungsmethode. Inkubieren bei 36 ± 2 ^oC für 24 h. Zählen Sie Kolonien entsprechend der verwendeten Plattierungsmethode und zeichnen Sie Daten auf.

2. Schaben und Homogenisieren

1. Züchten Sie einen reifen P. aeruginosa ATCC 15442 Biofilm gemäß dem ASTM-Standard E264713.
2. Richten Sie die Probenahmestation so ein, dass sie Probenahmetafel, 95% Ethanol in einem Becherglas, Alkoholbrenner, Hämostate, Coupon-Entfernungswerkzeug, Bechergläser mit sterilem Verdünnungswasser und Verdünnungsröhrchen zum Spülen der Coupons enthält.
3. Schalten Sie die Pumpe aus. Entfernen Sie eine Kanalabdeckung und verwenden Sie ein steriles Coupon-Entfernungswerkzeug und Hämostate, um den Coupon zu entfernen, wobei Sie darauf achten, den Biofilm nicht zu stören.
4. Spülen Sie den Coupon ab, indem Sie vorsichtig mit einer flüssigen Bewegung in 45 ml steriles Verdünnungswasser (enthalten in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen) eintauchen. Kehren Sie die Bewegung sofort um, um den Gutschein zu entfernen.
5. Legen Sie den Gutschein in ein Becherglas, das 45 ml steriles Verdünnungswasser enthält. Schaben Sie die mit Biofilm überzogene Couponoberfläche mit einem sterilen Spatel oder Schaber etwa 15 s lang nach unten. Spülen Sie den Spatel oder Schaber ab, indem Sie ihn im Becherglas umrühren. Wiederholen Sie den Schaben- und Spülvorgang 3-4 Mal, um eine vollständige Abdeckung der Couponoberfläche zu gewährleisten.
6. Spülen Sie den Coupon aus, indem Sie ihn in einem Winkel von 60° über das sterile Becherglas halten und 1 ml steriles Verdünnungswasser über die Oberfläche des Coupons pipettieren. Wiederholen Sie dies für insgesamt 5 Spülungen. Das endgültige Volumen im Becherglas beträgt 50 ml.
   HINWEIS: Das endgültige Volumen der kombinierten Behandlung und des Neutralisators ist wichtig für die genaue Bestimmung der Biofilm-Log-Dichte.
7. Ersetzen Sie jede Kanalabdeckung, wenn die Coupons entfernt werden.
8. Homogenisieren Sie in der Biosicherheitskabine die geschabte Biofilmprobe. Befestigen Sie eine sterile Homogenisatorsonde am Homogenisator, legen Sie die Sondenspitze in die Flüssigkeit, schalten Sie den Homogenisator ein und fahren Sie bis zu 20.500 U / min hoch.
9. Homogenisieren Sie die Probe für 30 s. Drehen Sie die Drehzahl herunter und schalten Sie den Homogenisator aus.
10. Desinfizieren Sie die Sonde zwischen Biofilmproben, indem Sie einen 9 ml sterilen Verdünnungsrohling bei 20.500 U / min für 30 s wie oben beschrieben homogenisieren. Homogenisieren Sie ein 9 ml Rohr aus 70% Ethanol für 30 s, lösen Sie die Sonde und lassen Sie es 1 min im Ethanolrohr stehen. Homogenisieren Sie zwei zusätzliche Verdünnungsrohlinge.
    HINWEIS: Für jede Probe kann eine Einweg-Homogenisatorsonde verwendet werden.
11. Verdünnen Sie die Proben seriell in gepuffertem Wasser. Platte auf R2A-Agar mit der entsprechenden Beschichtungsmethode. Inkubieren Sie Platten bei 36 ± ^2oC für 24 h, zählen Sie Kolonien entsprechend der verwendeten Beschichtungsmethode und zeichnen Sie Daten auf.

3. Scraping, Vortexing und Beschallung

1. Züchten Sie einen reifen Escherichia coli ATCC 53498 Biofilm in Silikonkatheterschläuchen10.
2. Bereiten Sie Probenahmematerialien vor: Spülröhrchen, steriles Zentrifugenröhrchen, leere sterile Petrischale, flammensterilisierte Hämostat und Schere aus Edelstahl, Timer und Lineal.
3. Wenn die Pumpe pausiert ist, verwenden Sie 70% Ethanol, um die Außenseite des Schlauches zu reinigen. Messen Sie 2 cm vom Ende aus, vermeiden Sie den am Stecker befestigten Bereich, und markieren Sie den Schlauch, um die Schnittstellen zu bestimmen.
4. Schneiden Sie mit einer flammsterilisierten Schere den Schlauch auf die 2 cm Markierung und legen Sie das Segment in eine leere sterile Petrischale. Wischen Sie den Schlauch mit 70% Ethanol ab und verbinden Sie das distale Ende wieder mit Abfallschläuchen.
5. Spülen Sie das Schlauchsegment, um Planktonzellen zu entfernen. Tauchen Sie mit einer flammensterilisierten Pinzette vorsichtig in 20 ml steriles Verdünnungswasser ein und entfernen Sie es dann sofort. Legen Sie das Segment in 10 ml Neutralisator.
6. Mit flammensterilisierten Pinzetten das Schlauchsegment halten und mit sterilem hölzernem Applikatorstab kratzen, bis alle inneren Bereiche des Schlauches abgekratzt sind. Spülen Sie den Stick gelegentlich im 10 ml Neutralisator ab und legen Sie das Segment wieder in das Probenröhrchen. Das geschabte Rohrsegment ist die 100- oder ^{0-Verdünnung} .
   HINWEIS: Das endgültige Volumen der kombinierten Behandlung und des Neutralisators ist wichtig für die genaue Bestimmung der Biofilm-Log-Dichte.
7. Wirbeln Sie jedes Rohr auf der höchsten Stufe für 30 ± 5 s ein. Legen Sie das Rohr in ein Rohrgestell, das im Ultraschallgerät aufgehängt ist, so dass der Wasserstand im Bad dem Flüssigkeitsstand in den Rohren entspricht. Beschallung bei 45 kHz, 100% Leistung und Normalfunktion für 30 ± 5 Sekunden. Wiederholen Sie den Wirbel und die Beschallungszyklen und enden Sie dann mit einem letzten Wirbel.
   HINWEIS: Dieses Rohr mit dem geernteten und disaggregierten Biofilm ist die ^{100-Verdünnung} .
8. Verdünnen Sie die Proben seriell in gepuffertem Wasser. Platte auf Tryptic Soja-Agar mit der entsprechenden Beschichtungsmethode.
9. Inkubieren Sie Platten bei 36 ± 2 ^oC für 24 h. Zählen Sie die Kolonien entsprechend der verwendeten Plattierungsmethode, zeichnen Sie Daten auf und berechnen Sie das arithmetische Mittel.

Ergebnisse

Validierung/Bestätigung einer Erntemethode
Mehrere Studien, die in unserem Labor durchgeführt wurden, untersuchten die Fähigkeit von Vortexing und Beschallung, Biofilm, der im Biofilmreaktor (ASTM E2562)2 gezüchtet wurde^, effektiv mit der Single Tube Method (ASTM E2871)⁸ zu ernten.

Ein P. aeruginosa ATCC 15442 Biofilm wurde nach ASTM E25622 auf Borosilikatglas-Coupons gezüchtet. Nach 48 St...

Diskussion

Mindestinformationen für Ernte- und Disaggregationsmethoden
Um reproduzierbare Biofilmdaten in der gesamten wissenschaftlichen Gemeinschaft zu erstellen, ist es unerlässlich, dass die Autoren so viele Details wie möglich über jeden der Wachstums-, Behandlungs-, Probenahme- und Analyseschritte einer Biofilmmethode angeben. Die Standardisierung von Biofilmmethoden hat bei diesem Bestreben geholfen, da sie es dem Forscher ermöglicht, auf eine bestimmte Methode und alle relevanten Modifikationen zu v...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL conical vials	Thermo Scientific	339652
100 mL glass beakers	Fisher Scientific	FB102100
5 mL serological pipettes	Fisher Scientific	13-678-12D	For adding treatment to vials containing coupons.
50 mL serological pipettes	Fisher Scientific	13-678-14C	For adding neutralizer to vials at the end of treatment contact time.
Applicator sticks	Puritan	807
Hemostats	Fisher Scientific	16-100-115
Metal spatula	Fisher Scientific	14-373
PTFE policemen	Saint-Gobain	06369-04
S 10 N - 10 G - ST Dispersing tool	IKA	4446700	For homogenization of biofilm samples.
Scissors	Fisher Scientific	08-951-20
Silicone Foley catheter, size 16 French	Medline Industries	DYND11502
Silicone tubing, size 16	Cole-Parmer	EW96400-16
Splash Guards	BioSurface Technologies, Inc.	CBR 2232
T 10 basic ULTRA-TURRAX Disperser	IKA	3737001	For homogenization of biofilm samples.
Tubing connectors	Cole-Parmer	EW02023-86
Ultrasonic Cleaner	Elma	TI-H15
Vortex-Genie 2	Scientific Industries	SI-0236
Vortex-Genie 2 Vertical 50 mL Tube Holder	Scientific Industries	SI-V506