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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein optimiertes retinale Organoid-Induktionssystem, das für verschiedene humane pluripotente Stammzelllinien geeignet ist, netzhautähnliche Gewebe mit hoher Reproduzierbarkeit und Effizienz zu erzeugen.

Zusammenfassung

Degenerative Erkrankungen der Netzhaut sind die Hauptursachen für irreversible Erblindung ohne wirksame Behandlung. Pluripotente Stammzellen, die das Potenzial haben, sich in alle Arten von Netzhautzellen zu differenzieren, sogar in Mini-Netzhautgewebe, sind für Patienten mit diesen Krankheiten vielversprechend und bieten viele Möglichkeiten bei der Krankheitsmodellierung und dem Arzneimittelscreening. Der Induktionsprozess von hPSCs zu Netzhautzellen ist jedoch kompliziert und zeitaufwendig. Hier beschreiben wir ein optimiertes retinales Induktionsprotokoll zur Erzeugung von Netzhautgewebe mit hoher Reproduzierbarkeit und Effizienz, das für verschiedene humane pluripotente Stammzellen geeignet ist. Dieses Protokoll wird ohne Zusatz von Retinsäure durchgeführt, was der Anreicherung von Zapfenphotorezeptoren zugute kommt. Der Vorteil dieses Protokolls ist die Quantifizierung der EB-Größe und der Beschichtungsdichte, um die Effizienz und Wiederholbarkeit der Netzhautinduktion signifikant zu verbessern. Mit dieser Methode erscheinen alle wichtigen Netzhautzellen nacheinander und rekapitulieren die Hauptschritte der Netzhautentwicklung. Es wird nachgelagerte Anwendungen wie Krankheitsmodellierung und Zelltherapie erleichtern.

Einleitung

Retinale degenerative Erkrankungen (RDs), wie altersbedingte Makuladegeneration (AMD) und Retinitis pigmentosa (RP), sind durch die Dysfunktion und den Tod von Photorezeptorzellen gekennzeichnet und führen typischerweise zu irreversiblem Sehverlust ohne wirksame Heilungsmöglichkeiten1. Der Mechanismus, der diesen Krankheiten zugrunde liegt, ist weitgehend unbekannt, teilweise aufgrund fehlender menschlicher Krankheitsmodelle2. In den letzten Jahrzehnten wurden in der regenerativen Medizin durch die Stammzelltechnologie bedeutende Fortschritte erzielt. Viele Forscher, einschließlich uns, haben gezeigt, dass menschliche pluripotente Stammzellen (hPSCs), einschließlich menschlicher embryonaler Stammzellen (hESCs) und humaner induzierter pluripotenter Stammzellen (hiPSCs), sich durch verschiedene Differenzierungsansätze in alle Arten von Netzhautzellen, sogar in Mini-Netzhautgewebe, differenzieren können3,4,5,6,7,8,9,10, 11, bietet ein enormes Potenzial in der Krankheitsmodellierung und Zelltherapie12,13,14.

Der Induktionsprozess von hPSCs zu Netzhautzellen ist jedoch sehr kompliziert und zeitaufwendig mit geringer Wiederholbarkeit, was Forscher mit reicher Erfahrung und hohen Fähigkeiten erfordert. Während des komplexen und dynamischen Induktionsprozesses beeinflussen eine Reihe von Faktoren die Ausbeute an Netzhautgeweben15,16,17. Außerdem unterscheiden sich verschiedene Induktionsmethoden oft erheblich im Timing und in der robusten Expression von Netzhautmarkern, was die Probenentnahme und Dateninterpretation verwirren könnte3. Daher wäre ein einfaches Protokoll der netztinalen Differenzierung von hPSCs mit Schritt-für-Schritt-Anleitung gefragt.

Hier wird basierend auf unseren veröffentlichten Studien18,19,20,21, ein optimiertes retinales Induktionsprotokoll zur Erzeugung von Netzhautorganoiden (ROs) mit reichen Zapfenphotorezeptoren aus hPSCs beschrieben, die keine Ergänzung von Retinsäure (RA) erfordern. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Beschreibung der mehrstufigen Methode zur Erzeugung neuronaler Netzhaut und RPE. Die EB-Bildung ist der wesentliche Teil der frühen Induktionsphase. Sowohl Größe als auch Beschichtungsdichte von EBs sind quantitativ optimiert, was die Ausbeute von Netzhautgewebe wissenschaftlich erhöht und die Wiederholbarkeit fördert. Im zweiten Teil der Induktion organisieren sich optische Vesikel (OVs) in der Adhärenzkultur selbst und ROs bilden sich in der Suspensionskultur; Die Zeit- und Effizienzgewinne dieses Teils variieren in den verschiedenen hPSC-Linien erheblich. Die Reifung und Spezifizierung von Netzhautzellen in ROs erfolgt hauptsächlich im mittleren und späten Stadium der Induktion. Ohne die Zugabe von RA können reife Photorezeptoren mit sowohl reichen Zapfen als auch Stäbchen hergestellt werden.

Der Zweck dieses Protokolls besteht darin, jeden Schritt quantitativ zu beschreiben und zu beschreiben, damit unerfahrene Forscher ihn wiederholen können. Verschiedene hPSC-Linien wurden durch dieses Protokoll erfolgreich in ROs induziert, mit einer robusten Ausbeute an kegelreichem Netzhautgewebe und hoher Wiederholbarkeit. HPSCs-abgeleitete ROs mit diesem Protokoll können die wichtigsten Schritte der Netzhautentwicklung in vivorekapitulieren und langfristig überleben, was nachgelagerte Anwendungen wie Krankheitsmodellierung, Arzneimittelscreening und Zelltherapie erleichtert.

Protokoll

1. Kultur und Ausbau von hPSCs

  1. HPSC-Kultur
    1. Beschichten Sie zwei Vertiefungen einer 6-Well-Platte mit extrazellulärer Matrix (ECM, hESC-qualifizierte Matrix). Bereiten Sie 50 ml einer ECM-Lösung vor, die 8-12 μg/ml ECM in Dulbeccos Modified Eagle's Medium (DMEM) enthält. In 49 ml DMEM 1 ml der aufgetauten ECM-Stammlösung (50x) hinzufügen. Fügen Sie 1 ml der ECM-Lösung zu jeder Vertiefung einer 6-Well-Platte hinzu. Inkubieren Sie es für 1 h in einem Inkubator bei 37 °C und 5% CO2.
    2. Bereiten Sie hPSC-Wartungsmedium (MM) gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
    3. MM bei Raumtemperatur (RT) für 30 min vorwärmen.
    4. Auftauen einer kryogenen Durchstechflasche mit hPSCs (hiPSCs oder hESCs) (ca. 1 x 106)aus einem Flüssigstickstofftank durch Inkubation in einem Wasserbad bei 37 °C für 30 s.
    5. Nehmen Sie die Durchstechflasche heraus und desinfizieren Sie sie vorsichtig mit einem 75% igen Desinfektionsalkoholspray. Legen Sie es in eine Biosicherheitsschranke.
    6. Die Zellsuspension aus der Durchstechflasche in ein 15-ml-Röhrchen geben, 5 ml vorgewärmtes MM Tropfen für Tropfen mit einer 5-ml-Pipette in das Röhrchen geben. Schütteln Sie in der Zwischenzeit vorsichtig das Röhrchen, um die hPSCs zu mischen.
    7. Zentrifuge das Röhrchen bei 170 x g für 5 min. Entfernen Sie den größten Teil des Überstands vorsichtig mit einer 1-ml-Pipette und lassen Sie etwa 50 μL Überstand zurück, um den Verlust der Zellen zu vermeiden.
    8. Fügen Sie 1 ml MM in das Rohr hinzu und kehren Sie das Pellet wieder auf, indem Sie es ein- oder zweimal mit einer 1-ml-Pipette vorsichtig auf und ab pipettieren.
      HINWEIS: Das Überleben einzelner Zellen von hPSCs ist gering. Kleinzellige Klumpen mit 3-5 Zellen werden bevorzugt, um die hPSCs in Kolonien wachsen zu lassen.
    9. EcM aus den vorbeschichteten Vertiefungen entfernen (Schritt 1.1.1), 1,5 ml MM zu jeder Vertiefung hinzufügen und dann 0,5 ml Zellsuspension pro Vertiefung verteilen.
    10. Schütteln Sie die Platte vorsichtig, um die hPSCs gleichmäßig zu verteilen, und legen Sie die Platte in einen Inkubator bei 37 °C und 5% CO2. Bewegen Sie die Platte mindestens 24 Stunden lang nicht, um die Zelladhärenz zu fördern.
    11. Wechseln Sie MM jeden zweiten Tag und durchlassen Sie die hPSCs, wenn der Zusammenfluss etwa 80% erreicht hat.
  2. Weitergabe von hPSCs
    HINWEIS: Die Aufrechterhaltung des undifferenzierten Zustands in hPSCs ist für weitere Anwendungen sehr kritisch. Unter den adhärenten Bedingungen wachsen hPSCs in Kolonien mit einer klar definierten Grenze. Die Zellen sollten passagen, wenn der Zusammenfluss von hPSCs etwa 80% erreicht.
    1. Beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop. Markieren und entfernen Sie die deutlich sichtbaren differenzierten Zellen (<5%) vor dem Passieren mechanisch.
    2. Bereiten Sie die ECM-beschichtete Platte wie in Schritt 1.1.1 beschrieben vor.
    3. Vorwarmes MM und 1x Phosphatpuffersalzlösung (PBS) ohneCa2+ undMg2+ bei RT.
    4. Die 0,5 mM EDTA -Lösung (in 1x PBS) wird in einem Wasserbad bei 37 °C vorgewärmt.
    5. Entfernen Sie das Medium mit einem Vakuum-Aspirationssystem von der Kulturplatte, fügen Sie 1 ml 1x PBS in jede Vertiefung hinzu, um die Zellen mit einer 1-ml-Pipette zu waschen und wiederholen Sie sie zweimal.
    6. Fügen Sie 1 ml EDTA-Lösung pro Vertiefung hinzu, um die hPSCs in einem Zellkulturinkubator bei 37 °C und 5% CO2 für 5 min zu dissoziieren. Überschreiten Sie nicht die empfohlene Inkubationszeit, um eine Dissoziation zu einzelnen Zellen zu vermeiden.
    7. Nehmen Sie die Platte heraus und überprüfen Sie die Ablösung der Zellen unter einem Mikroskop. Die konfluenten hPSCs lockern sich auf und jeder Zellrand ist zu sehen, aber die Zellen können sich nicht leicht durch sanftes Schütteln der Zellplatte lösen.
    8. Entfernen Sie die EDTA-Lösung mit einer 1-ml-Pipette und fügen Sie 1 ml MM hinzu, um die Dissoziation zu stoppen. Pipetten Sie die hPSCs ein- oder zweimal vorsichtig mit einer 1 mL Pipette, um die Zellen wieder aufzustellen. Es besteht keine Notwendigkeit, sich zu zentrifugieren, um die Zellen zu sammeln.
      HINWEIS: Wenn sich die meisten Zellen nach der Inkubation mit EDTA von der Platte absetzen, können die Zellen mit einer Zentrifuge gesammelt werden.
    9. Entfernen Sie ECM aus den vorbeschichteten Vertiefungen (Schritt 1.2.2) und fügen Sie 1,5 ml MM pro Vertiefung hinzu.
    10. Übertragen Sie 150-200 μL Zellklumpen in jede Vertiefung. Im Allgemeinen können hPSCs im Verhältnis 1:6 durchfahren werden. Zum Beispiel können Zellen aus einer Vertiefung einer 6-Well-Platte auf sechs neue Vertiefungen verteilt werden.
    11. Schütteln Sie die Platte vorsichtig, um die hPSCs gleichmäßig zu verteilen und kulturieren Sie die hPSCs im Inkubator bei 37 °C und 5% CO2 für mindestens 24 h, ohne die Platte zu berühren.
    12. Ändern Sie MM jeden zweiten Tag, wie in Schritt 1.1 beschrieben.

2. Netzhautdifferenzierung von hPSCs

HINWEIS: Wenn die Kolonien ~ 80% Konfluenz erreichen(Abbildung 1B),können sie geführt werden, um sich nach dem in Abbildung 1Aschematisierten Protokoll in netztinale Organoide zu differenzieren. Um sicherzustellen, dass die hPSCs eine hohe Qualität und eine gute Ausbeute aufweisen, bewerten Sie regelmäßig die Pluripotenz mit molekularen Markern wie OCT4 oder NANOG mittels IFC oder QPCR. HPSCs sollten verworfen werden, wenn differenzierte Zellen mehr als 5% der Gesamtzellen ausmachen. Überprüfen Sie die Mykoplasmenkontamination mit einem Mykoplasmen-Nachweiskit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie nur mykoplasmenfreie hPSCs, da Mykoplasmen die Differenzierungsfähigkeit von hPSCs verändern können.

  1. Medien und Reagenzien vorbereiten
    1. Bereiten Sie das neuronale Induktionsmedium (NIM) vor, indem Sie Folgendes mischen: 500 ml Dulbeccos modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12, 1:1), 5 mL 1% N2 Supplement, 0,5 mL 0,1% Heparin (2 mg/ml in 1x PBS) und 5 ml 1% MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA).
    2. Bereiten Sie ein netzhautliches Differenzierungsmedium (RDM) mit 300 ml DMEM / F-12, 200 ml DMEM-Basis, 10 ml 2% B27-Ergänzung, 5 ml 1% Antibiotikum Antimykotika und 5 ml 1% MEM NEAA vor.
      HINWEIS: Sowohl NIM als auch RDM werden nicht gefiltert, es wird jedoch ein Sterilitätstest durchgeführt. 1 ml Medium herausnehmen und in eine 35-mm-Schüssel geben und 3-7 Tage in einem Inkubator bei 37 °C und 5% CO2 ankulturieren. Das Medium kann bei 4 °C gelagert werden und sollte innerhalb von 2 Wochen verwendet werden, um die Aktivität der Komponenten zu gewährleisten.
    3. Bereiten Sie 10 mM Blebbistatin (1.000x) in DMSO vor. 1.710 μL DMSO 1.710 μL blebbistatin zulösen, um 10 mM Stammlösung (1.000x) zu erhalten, aliquot bei 10 μL/Röhrchen und bei -20 °C lagern.
      HINWEIS: Alle Medien und Reagenzien sollten vor Gebrauch 30 Minuten lang bei RT erwärmt werden, sofern nicht anders angegeben.
  2. Embryoidkörper (EB) Bildung
    1. Beginnen Sie am Tag 0 (D0) mit der Differenzierung. Nehmen Sie eine Vertiefung von hPSCs aus einer 6-Well-Platte heraus, die auf ~ 80% Konfluenz angewachsen ist. Sammeln Sie die Zellen mit EDTA-Dissoziationslösung, wie in den Schritten 1.2.1 bis 1.2.6 beschrieben.
    2. Entfernen Sie die EDTA-Lösung, fügen Sie 1 ml MM mit 10 μM Blebbistatin hinzu, um die Zelldissoziation zu stoppen, und sammeln Sie die Zellen mit einer 1 ml Pipette. Die Größe der Zellklumpen ist einer der Schlüsselfaktoren, die sich auf die Ausbeute von EBs auswirken. Ungefähr fünf Zellen pro Klumpen werden bevorzugt, um die richtige Größe von EBs auf D5 bis D7 zu erzeugen.
      HINWEIS: Dies ist ein wichtiger Schritt. Pipetetten Sie die Zellen nicht zu oft, da EB-ähnliche Aggregate aus einzelnen Zellen von hPSCs schwer zu bilden sind.
    3. Die Zellsuspension (ca. 2 x10 6 Zellen) in eine 100 mm ultra-low attachment Petrischale geben und 9 mL MM mit 10 μM Blebbistatin in die Schale geben.
    4. Schütteln Sie die Schüssel zweimal vorsichtig, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen, und stellen Sie die Schüssel bei 37 °C und 5% CO2in den Inkubator.
    5. Auf D1, nachdem die Zellen für mindestens 24 h kultiviert wurden, nehmen Sie die Schale heraus und beobachten Sie sie unter dem Mikroskop. Ein Großer Teil der kleinzelligen Aggregate wird sich zu diesem Zeitpunkt spontan bilden (Abbildung 1C).
    6. 12 ml Mischung mit MM und NIM im Verhältnis 3:1 (9 ml MM und 3 ml NIM) in einem 15 ml Röhrchen vorbereiten.
    7. Die Zellkulturen werden senkrecht in ein 15 mL Zentrifugenröhrchen mit einer 10 mL Pipette gegeben und 10 ml der vorgewärmten Mischung in die Schüssel gegeben.
    8. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 60 x g für 3 min, um die Aggregate zu sammeln, entfernen Sie den Überstand mit einer 5 mL Pipette und lassen Sie etwa 500 μL zurück, um den Verlust von Zellen zu vermeiden.
    9. 2 ml der Mischung in das Röhrchen geben und die Suspension in dieselbe Schüssel geben (Schritt 2.2.7).
    10. Schütteln Sie die Schüssel vorsichtig, um die Zellaggregate gleichmäßig zu verteilen, und legen Sie die Schüssel wieder in den Inkubator.
    11. Auf D2 werden 12 ml einer neuen Mischung mit MM und NIM im Verhältnis 1:1 (6 ml MM und 6 ml NIM) in einem 15-ml-Röhrchen vorbereitet. Wechseln Sie das Zellmedium mit der frisch zubereiteten Mischung, indem Sie die Schritte von 2.2.5 bis 2.2.10 wiederholen.
    12. Wechseln Sie auf D3 das Zellmedium mit 15 ml NIM wie oben beschrieben. Kulturieren Sie die Zellen für mindestens 5 Tage unter den Suspensionsbedingungen.
      HINWEIS: Während D1 bis D3 sollte das Medium jeden Tag gewechselt werden, um genügend Nahrung bereitzustellen. Seit D3 kann NIM jeden zweiten Tag geändert werden. EBs können auch in mehrere Gerichte unterteilt werden, um reichlich Nahrung zu bieten.
  3. Aussäen der EBs
    HINWEIS: Wählen Sie bei D5 bis D7 einen geeigneten Zeitpunkt, um die EBs auf den ECM-beschichteten Schalen entsprechend der Größe der EBs zu plattieren. EBs mit einem ungefähren Durchmesser von 200 μm sind für die netzhautliche Differenzierung geeignet. Im Allgemeinen kann eine Bohrung von hPSCs in einer 6-Well-Platte etwa 300 bis 1.000 EBs produzieren. Die Variation der EB-Ausbeute wird durch die hPSC-Linien variiert.
    1. Bereiten Sie auf D4 ECM-beschichtetes Geschirr für die EBs-Haftkultur zu. Fügen Sie 5 ml ECM zu jeder 100 mm Gewebekulturschale (oberflächenbehandelt) hinzu und legen Sie sie über Nacht in den Inkubator.
    2. Entfernen Sie auf D5 ECM aus dem vorbeschichteten Geschirr und fügen Sie jedem Gericht 10 ml vorgewärmtes NIM hinzu.
    3. Nehmen Sie das Gericht mit EBs heraus. Überprüfen Sie die Qualität von EBs unter dem Mikroskop und stellen Sie sicher, dass sie recht hell und rund sind. Die Größe der EBs beträgt ungefähr 200 μm Durchmesser. Sammeln Sie alle EBs in einem 15-ml-Röhrchen. Die EBs vom Geschirr in ein 15-ml-Röhrchen mit einer 5-ml-Pipette geben. Lassen Sie die EBs für 5 Minuten beruhigen. Entfernen Sie den größten Teil des Überstands und lassen Sie etwa 2 ml Medium zurück.
    4. Verteilen Sie die EBs in die beschichteten Schalen mit 10 ml NIM Tropfen für Tropfen mit einer 1 ml Pipette. Säen Sie die EBs mit einer Dichte von ca. 2-3 EBs procm2. Fügen Sie beispielsweise etwa 120-180 EBs in eine 100-mm-Schüssel hinzu. Um die EB-Zahl grob zu beurteilen, legen Sie einen Tropfen EB-Suspension auf einen Coverlip und zählen Sie die Anzahl der EBs unter dem Mikroskop.
      HINWEIS: Die Beschichtungsdichte von EBs ist einer der Schlüsselfaktoren, die die Effizienz der Netzhautinduktion beeinflussen. Die Dichte kann auch von jeder hPSC-Linie eingestellt werden.
    5. Schütteln Sie das Geschirr vorsichtig, um die EBs gleichmäßig zu verteilen. Legen Sie sie bei 37 °C und 5% CO2in den Inkubator.
      HINWEIS: Bewegen Sie das Geschirr nicht mindestens 24 Stunden lang, um die Adhärenz von EBs zu verbessern.
  4. Induktion von optischen Vesikeln (OVs) und retinalem Pigmentepithel (RPE) unter adhärentem Zustand
    HINWEIS: Nachdem EBs auf der ECM-beschichteten Oberfläche ausgesät wurden, können hPSCs OV-ähnliche Strukturen entwickeln, die bereits nach der Differenzierung von D20 beobachtet werden können. In diesem Protokoll sind keine spezifischen Wachstumsfaktoren oder Signalmoleküle erforderlich, um die hPSCs in das Netzhautschicksal zu leiten, außer der Zugabe von N2- und B27-Ergänzungen in den Medien.
    1. Entfernen Sie auf D8-D9 das Geschirr und beobachten Sie die EBs unter dem Mikroskop. Alle EBs werden auf dem Geschirr angebracht und verteilt (Abbildung 1D). Fügen Sie 10 ml frisches NIM zu jeder 100-mm-Schüssel hinzu, die 10 ml altes Medium enthält. Legen Sie sie wieder in den Inkubator.
      HINWEIS: Entfernen Sie nicht das alte Medium.
    2. Wechseln Sie bei D12 die Hälfte des Mediums mit NIM mit einer 10-ml-Pipette. Bewahren Sie die Kultur im Inkubator auf.
    3. Entfernen Sie auf D16 das gesamte NIM mit einem Vakuum-Aspirationssystem aus dem Geschirr. Fügen Sie 20 ml RDM zu jedem Gericht hinzu. Kultivieren Sie weiter in RDM und wechseln Sie jeden zweiten Tag die Hälfte des Mediums.
    4. Beobachten Sie während D10-D30 zweimal wöchentlich die morphologischen Veränderungen der Zellen unter einem Mikroskop und bewerten Sie die Effizienz der Netzhautdifferenzierung.
      HINWEIS: Seit D10 sind Augenfelddomänen (EF) in den peripheren Zonen adhärenter EBs selbstorganisiert. Die OV-ähnlichen Strukturen treten zwischen D20 und D25 auf, ragen allmählich aus der Schale heraus und bilden selbst einen optischen Becher, der von der pigmentierten RPE umgeben ist (Abbildung 1E). Die OVs können leicht mit dem hellen, refraktiven und dicken NR-Ring erkannt werden.
  5. Lösen und kultivieren Sie OVs und RPE in Suspension, um netztinale Organoide (ROs) zu erhalten
    1. Auf D28-D35 erscheinen die meisten OVs in den Schalen. Verwenden Sie eine Wolframnadel oder eine Nadel mit 1 ml Spritze, um die morphologisch identifizierbaren OVs zusammen mit dem benachbarten RPE mechanisch zu lösen. Kultur sie in Schwebe.
      HINWEIS: Das Aussehen und die Ausbeute von OVs und RPE variieren stark in verschiedenen hPSC-Linien. Somit ist der Zeitpunkt der Trennung von OV und RPE flexibel. Offensichtliche OVs mit dem angrenzenden RPE können abgelöst und dann in eine Kulturschale mit niedrigem Aufsatz verschoben werden, die RDM enthält. Kultivieren Sie den Rest der Zellen weiter, bis alle OVs und RPEs angehoben sind.
    2. Legen Sie 50-60 OVs in jede 100 mm Kulturschale mit niedrigem Aufsatz, die 15 ml RDM für die ROs-Bildung enthält (Abbildung 1F).
    3. Wechseln Sie RDM alle 2-3 Tage bis D42, wenn die ROs gut rund geformt sind.

3. Entwicklung und Reifung der Netzhaut

HINWEIS: In diesem Protokoll ist Serum erforderlich, um die ROs für eine langfristige Kultur wachsen und reifen zu lassen.

  1. Netzhautkaschierung und Spezifikation in ROs
    1. Bereiten Sie 10 ml 100 mM Taurin (1.000x) in 1x PBS vor. Wiegen Sie 125 mg Taurin und lösen Sie es in 10 ml 1x PBS auf. Filtern Sie die Lösung mit einem 0,22 μm Spritzenfilter. Aliquot bei 500 μL/Röhrchen und bei -20 °C lagern.
    2. Retinakulturmedium 1 (RC1) vorbereiten. Mischen Sie die folgenden Komponenten: 250 ml DMEM / F-12, 175 ml DMEM-Basis, 50 ml fetales Rinderserum, 10 ml 2% B27-Ergänzung, 5 ml 1% Antibiotikum Antimykotika, 5 ml 1% MEM NEAA, 0,5 ml 100 μM Taurin und 5 ml 2 mM L-Alanyl-L-Glutamin.
    3. Bereiten Sie das Netzhautkulturmedium 2 (RC2) vor, das 450 ml DMEM/F-12, 50 ml fetales Rinderserum, 5 ml 1% N2-Ergänzung, 5 ml 1% Antibiotikum Antimykotika, 0,5 ml 100 μM Taurin, 5 ml 1% MEM NEAA und 5 ml 2 mM L-Alnyl-L-Glutamin enthält.
      HINWEIS: RC1 und RC2 werden nicht gefiltert, sondern einem Sterilitätstest unterzogen. 1 ml Medium herausnehmen, in eine 35-mm-Schüssel geben und 3-7 Tage im Inkubator bei 37 °C und 5% CO2ankulturieren, um die Sterilität vor dem Gebrauch zu gewährleisten. Das Medium kann bei 4 °C gelagert werden und sollte innerhalb von 2 Wochen verwendet werden, um die Aktivität der Komponenten zu gewährleisten. Alle Medien und Reagenzien sollten vor Gebrauch 30 Minuten bei RT vorgewärmt werden.
    4. Schalten Sie auf D42 das Kulturmedium von RDM auf RC1 um.
    5. Kippen Sie das Geschirr um ca. 30° und lassen Sie die ROs für 30 s absetzen. Entfernen Sie das alte RDM mit einer 10-ml-Pipette, die etwa 1 ml Medium zurücklässt, um den Verlust von ROs zu vermeiden. Fügen Sie 15 ml frisches RC1 zu jedem Gericht hinzu.
    6. Schütteln Sie das Geschirr vorsichtig, um die ROs gleichmäßig zu verteilen. Stellen Sie das Geschirr wieder in den Inkubator. Wechseln Sie danach zweimal pro Woche das gesamte Medium.
    7. Wählen Sie während der D50-D90 eine hohe Qualität der ROs für die Langzeitkultur aus, die rund mit einem dicken und hellen NR sind. Legen Sie 30-40 ROs in eine 100 mm niedrige Aufsatzschale mit 20 ml RC1 und wechseln Sie das gesamte Medium zweimal pro Woche.
    8. Für die langfristige Suspensionskultur von ROs pipetieren Sie die ROs, um ein wiederanbringen von RO-RO mit einer Pipette zu vermeiden. Übertragen Sie ROs einmal im Monat auf neue Kulturgerichte, um zu vermeiden, dass ROs an der Oberfläche des Geschirrs haften bleiben.
      HINWEIS: Unter den Bedingungen der Suspensionskultur sind ROs rund geformt, mit einem hellen und dicken NR-Ring, der mit mehr oder weniger RPE an einer Seite befestigt ist. Laminierte neuronale Netzhaut entwickeln sich und retinale Zellsubtypen erscheinen sequenziell mit retinalen Ganglienzellen, die zuerst generiert werden, gefolgt von Photorezeptorzellen, amakrinen Zellen und bipolaren Zellen.
  2. Menschliche Photorezeptorreifung mit Anreicherung von Zapfen in ROs
    1. Schalten Sie nach der D90 das Medium von RC1 auf RC2 um, das für die Photorezeptorreifung geeignet ist.
    2. Ändern Sie das Medium wie in den Schritten 3.1.7-3.1.8 beschrieben.
      HINWEIS: Unter dieser Kulturbedingung können ROs langfristig wachsen (Abbildung 1G), bis zu D300 getestet. Netzhautzellen in ROs werden reif, und alle Zellsubtypen der neuronalen Netzhaut, einschließlich Müller-Gliazellen, Stäbchen und Zapfen, werden ebenfalls erworben. Ohne Zusatz von RA sind Zapfenphotorezeptoren auch reich an ROs.

Ergebnisse

Der retinale Induktionsprozess in diesem Protokoll ahmt die Entwicklung der menschlichen fetalen Netzhaut nach. Um die netzhautale Differenzierung einzuleiten, wurden hPSCs in kleine Klumpen dissoziiert und in Suspension kultiviert, um die Bildung von EBs zu induzieren. Auf D1 bildeten sich die uniformierten Zellaggregate oder EBs (Abbildung 1C). Das Kulturmedium wurde schrittweise in NIM überführt. Auf D5 wurden EBs auf die ECM-beschichteten Kulturschalen auftätigt. Zellen wanderten allm...

Diskussion

In diesem mehrstufigen netztinalen Induktionsprotokoll wurden hPSCs Schritt für Schritt geführt, um das Retinalschicksal zu erlangen, und selbstorganisiert in retinale Organoide, die laminiertes NR und RPE enthalten. Während der Differenzierung rekapitulierten hPSCs alle wichtigen Schritte der menschlichen Netzhautentwicklung in vivo, von EF, OV und RPE bis zur netztinalen Laminierung, wobei alle Subtypen von Netzhautzellen, einschließlich retinaler Ganglienzellen, amakrinen Zellen, bipolaren Zellen, Stäbch...

Offenlegungen

Xiufeng Zhong ist der Patenterfinder im Zusammenhang mit der Erzeugung von Netzhautzellen aus humanen pluripotenten Stammzellen.

Danksagungen

Diese Studie wurde vom National Key R&D Program of China (2016YFC1101103, 2017YFA0104101), dem Guangzhou Science and Technology Project Fund (201803010078), dem Science & Technology Project der Provinz Guangdong (2017B020230003), der Natural Science Foundation (NSF) of China (81570874, 81970842), dem Hundred Talent Program der Sun Yat-sen University (PT1001010) und den Fundamental Research Funds des State Key Laboratory of Ophthalmology unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
(−)-BlebbistatinSigmaB0560-5mgROCK-inhibitor
1 ml tipsKirgenKG13131 ml
10 ml pipetteSorfa3141001Pipette
100 mm Tissue cultureBIOFILTCD000100100 mm Petri dish
100 mm Tissue cultureFalcon353003100 mm Petri dish
15 ml Centrifuge tubesBIOFILCFT011150Centrifuge tubes
35 mm Tissue culture dishesFalcon35300135 mm Petri dish
5 ml pipetteSorfa313000Pipette
50 ml Centrifuge tubesBIOFILCFT011500Centrifuge tubes
6 wells tissue culture platesCostar3516Culture plates
Anti-AP2α AntibodyDSHB3b5Primary antibody
ANTIBIOTIC ANTIMYCOTIC 100XGibco15240062Antibiotic-Antimycotic
Anti-ISL1 AntibodyBosterBM4446Primary antibody
Anti-Ki67 AntibodyAbcamab15580Primary antibody
Anti-L/M opsin Antibodygift from Dr. jeremy/Primary antibody
Anti-PAX6 AntibodyDSHBpax6Primary antibody
Anti-rabbit 555InvitrogenA31572Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)
Secondary Antibody, Alexa Fluor 555
Anti-Recoverin AntibodyMilliporeab5585Primary antibody
Anti-Rhodopsin AntibodyAbcamab5417Primary antibody
Anti-sheep 555InvitrogenA21436Donkey anti-Sheep IgG (H+L)
Secondary Antibody, Alexa Fluor 555
Anti-SOX9 AntibodyAbclonalA19710Primary antibody
Anti-VSX2 AntibodyMilliporeab9016Primary antibody
B-27 supplement W/O VIT A (50X)Gibco12587010Supplement
Cryotube vialThermo scientific-NUNC3754181.8 ml
DAPIDOJINDOD5324',6-Diamidino-2-phenylindole
dihydrochloride; multiple suppliers
Dimethyl sulphoxide(DMSO) Hybri-maxSigmaD2650-100MLMultiple suppliers
DMEMGibcoC11995500BTMedium
DMEM /F12GibcoC11330500BTMedium
EDTAInvitrogen15575-0200.5 M PH 8.0
FBSNATOCORSFBESerum
FilterMilliporeSLGP033RB0.22μm, sterile Millex filter
GlutaMax, 100XGibco35050061L-alanyl-L-glutamine
HeparinSigmaH31492 mg/ml in PBS to use
Matrigel, 100xCorning354277Extracellular matrix (ECM)
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)Gibco11140050MEM NEAA
mTeSR1STEM CELL85850hPSCs maintenance medium (MM)
N2 supplementGibco17502048Supplement
Phosphate-buffered saline (PBS) bufferGNMGNM10010Without Ca+,Mg+,PH7.2±0.1 0.1M
TaurineSigmaT0625Supplement
Ultra-low attachment culture dishes 100mm petri dish, low-attachmentCorningCLS3262-20EAPetri dish

Referenzen

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