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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Funktionelle Bildgebung und Quantifizierung von thermogenen Fettdepots in Mäusen mit einem mikro-PET/MR-bildgebenden Ansatz.

Zusammenfassung

Braune und beige Adipozyten sind heute als potenzielle therapeutische Ziele für Fettleibigkeit und metabolische Syndrome anerkannt. Nicht-invasive molekulare Bildgebungsverfahren sind unerlässlich, um kritische Einblicke in diese thermogenen Fettdepots zu liefern. Hier stellt das Protokoll eine auf PET/MR-Bildgebung basierende Methode zur Beurteilung der Aktivität von braunen und beigen Adipozyten im interskapulären braunen Fettgewebe der Maus (iBAT) und im inguinalen subkutanen weißen Fettgewebe (iWAT) vor. Die Visualisierung und Quantifizierung der thermogenen Fettdepots wurde mit [18F]FDG, dem nicht metabolisierbaren Glukoseanalogon, als Radiotracer in Kombination mit den präzisen anatomischen Informationen der MR-Bildgebung erreicht. Die PET/MR-Bildgebung wurde 7 Tage nach der Kälteakklimatisierung durchgeführt und die Quantifizierung des [18F]FDG-Signals in verschiedenen Fettdepots wurde durchgeführt, um die relative Mobilisierung von thermogenem Fettgewebe zu beurteilen. Die Entfernung von iBAT erhöhte die kältebedingte [18F]FDG-Aufnahme in iWAT der Mäuse erheblich.

Einleitung

Als Reaktion auf sich ändernde Ernährungsbedürfnisse dient Fettgewebe als Energiecache, um entweder den Lipidspeicher- oder den Mobilisierungsmodus anzunehmen, um die Bedürfnisse des Körpers zu erfüllen1. Darüber hinaus spielt Fettgewebe auch eine Schlüsselfunktion in der Thermoregulation, über einen Prozess, der als nicht-zitternde Thermogenese bezeichnet wird, auch fakultative Thermogenese genannt. Dies wird typischerweise durch das braune Fettgewebe (BAT) erreicht, das reichlich Mitochondrienmembran-Membran-Entkopplungsprotein 1 (UCP1) exprimiert. Als Protonenträger erzeugt UCP1 Wärme, indem es den Protonentransport und die ATP-Produktion entkoppelt2. Bei Kältestimulation wird die Thermogenese in BAT durch Aktivierung des sympathischen Nervensystems (SNS) in Gang gesetzt, gefolgt von der Freisetzung von Noradrenalin (NE). NE bindet an die adrenergen β3-Rezeptoren und führt zu einer Erhöhung des intrazellulären zyklischen AMP (cAMP). Infolgedessen stimuliert das cAMP/PKA-abhängige Engagement von CREB (cAMP response element-binding protein) die Ucp1-Transkription durch direkte Bindung an CREB-Response-Elemente (CRE)2. Neben BAT kommen braune Adipozyten auch im weißen Fettgewebe vor und werden daher als beige oder brite (braun-in-weiß) Zellen bezeichnet1,3. Als Reaktion auf spezifische Reize (wie Erkältung) werden diese ansonsten ruhenden beigen Zellen so umgestaltet, dass sie mehrere braunartige Merkmale aufweisen, darunter multilokuläre Lipidtröpfchen, dicht gepackte Mitochondrien und eine erhöhte UCP1-Expression3,4,5.

Tierstudien haben gezeigt, dass braune und beige Adipozyten über ihre fettreduzierende Wirkung hinaus mehrere metabolische Vorteile haben, einschließlich Insulinsensibilisierung, Lipidsenkung, entzündungshemmende und Anti-Atherosklerose6,7. Beim Menschen korreliert die Menge an beige/braunem Fett umgekehrt mit Alter, Insulinresistenzindex und kardiometabolischen Störungen8. Darüber hinaus bietet die Aktivierung von beige/braunen Adipozyten beim Menschen entweder durch Kälteakklimatisierung oder durch β3-Adrenergrezeptoragonisten Schutz vor einer Reihe von Stoffwechselstörungen4,9,10. Diese Beweise deuten zusammen darauf hin, dass die Induktion von braunem und beigem Fettgewebe eine potenzielle therapeutische Strategie für die Behandlung von Fettleibigkeit und den damit verbundenen medizinischen Komplikationen ist8.

Interessanterweise werden beige und klassische braune Adipozyten, obwohl sie eine ähnliche Funktion haben, von verschiedenen Vorläufern abgeleitet und durch überlappende, aber unterschiedliche Mechanismen aktiviert1. Daher sind die In-vivo-Bildgebung und die Quantifizierung von braunen und beigen Adipozyten unerlässlich, um ein besseres Verständnis der molekularen Kontrolle dieser Fettgewebe zu erreichen. Derzeit ist die 18F-Fluordesoxyglucose ([18F]FDG)-Positronen-Emissions-Tomographie (PET) in Kombination mit der Computertomographie (CT) in klinischen Studien nach wie vor der Goldstandard für die Charakterisierung thermogener brauner und beiger Zellen8. Die Magnetresonanztomographie (MRT) nutzt starke Magnetfelder und Hochfrequenzimpulse, um detaillierte anatomische Strukturen zu erzeugen. Im Vergleich zum CT-Scan erzeugt die MRT Bilder von Organen und Weichteilen mit einer höheren Auflösung. Hier ist ein Protokoll zur Visualisierung und Quantifizierung von funktionellen braunen und beigen Fettsäuren in Mausmodellen nach der Akklimatisierung an Kälteeinwirkung vorgesehen, eine gängige und zuverlässigste Methode, um eine Fettbräunung zu induzieren. Mit dieser Methode lassen sich die thermogenen Fettdepots in Kleintiermodellen mit hoher Präzision charakterisieren.

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Protokoll

Das unten beschriebene Protokoll folgt den Tierpflegerichtlinien der University of Hong Kong. Bei den in der Studie verwendeten Tieren handelte es sich um 8 Wochen alte C57BL/6J-Mäuse.

1. Tierchirurgische Eingriffe und Kälteherausforderung

  1. Führen Sie eine interskapuläre BAT-Dissektion (iBAT) durch.
    1. Anästhesien der Mäuse durch intraperitoneale Injektion von Ketamin / Xylazin (100 mg / kg Körpergewicht Ketamin und 10 mg / kg Körpergewicht Xylazin). Rasieren Sie nach der Narkose die Haare der Maus vom Hals bis knapp unter die Schulterblätter.
    2. Legen Sie die Mäuse nach der Desinfektion auf das Heizkissen und machen Sie einen 2 cm langen Schnitt entlang der dorsalen Mittellinie der Mäuse.
    3. Entfernen Sie die iBAT-Pads (bilateral). Machen Sie in der Scheingruppe den gleichen Einschnitt, lassen Sie jedoch die iBAT-Pads intakt.
    4. Schließen Sie den Schnitt mit 7 mm gewickelten Edelstahlclips, nachdem die Blutung aufhört.
    5. Nach der Operation Meloxicam (5 mg/kg Trinkwasser) für 6 Tage an die Mäuse geben und sie 14 Tage lang auf einer Intensivstation (ICU) unterbringen. Entfernen Sie die Clips, sobald die Wunde verheilt ist (7-10 Tage).
  2. Kalte Herausforderung der Mäuse: Halten Sie die Mäuse 14 Tage lang bei Thermoneutralität (30 °C) unter. Am 13. Tag die Tierkäfige bei Kälte (6 °C) über Nacht vorkühlen. Am 14. Tag die Mäuse 7 Tage lang bei 6 °C in die Umweltkammer legen. Platzieren Sie zwei Mäuse in jedem Käfig.

2. Micro-PET/MR-Kalibrierungen und Workflow-Einrichtung

HINWEIS: Die Mikro-PET/MR-Bildgebung wird mit einem sequentiellen PET/MR-System durchgeführt (siehe Materialverzeichnis). Jede Maus wird auf das abbildende Bett gelegt; Zuerst scannen Sie mit dem MR für eine anatomische Referenz (Scout-Ansicht), bevor Sie in die Mitte des PET-Sichtfeldes (FOV) für eine statische [18F]FDG PET-Aufnahme vordringen, gefolgt von MR-Bildgebung für anatomische Referenz. In der Scanner-Bediensoftware (siehe Materialverzeichnis) wird ein Imaging-Workflow erstellt, um automatisierte, sequentielle PET/MR-Scans vor der Imaging-Sitzung zu ermöglichen.

  1. Erstellen Sie einen Bildgebungs-Workflow in der Betriebssoftware, der statische PET-Erfassung, MRT-Aufnahmen zur Dämpfungskorrektur und anatomische Referenz mit T1-gewichteter 3D-Bildgebung bzw. T2-gewichteter 2D-Bildgebung umfasst.
  2. Um PET zu erwerben, legen Sie eine Diskriminierung auf einem Niveau von 400-600 keV, ein Isotop der F-18-Studie, einen Koinzidenzmodus von 1-5 und Scans von 20 Minuten fest.
  3. Um T1-gewichtete MR (zur Dämpfungskorrektur) zu erfassen, stellen Sie Gradient Echo-3D ein (TE = 4,3 ms, TR = 16 ms, FOV = 90 x 60 mm, Anzahl der Anregungen (NEX) = 3, 28 Scheiben mit 0,9 mm Dicke, Voxelgröße = 0,375 x 0,375 x 0,9 mm).
  4. Um T2-gewichtete MR (anatomische Referenz) zu erfassen, stellen Sie Fast-spin Echo 2D (TE = 71,8 ms, TR = 3000 ms, FOV = 90 x 60 mm, NEX = 5, 32 Scheiben mit 0,9 mm Dicke, Voxelgröße = 0,265 x 0,268 x 0,9 mm3) ein.
  5. Um PET zu rekonstruieren, verwenden Sie den Tera-Tomo 3D (TT3D) -Algorithmus (8 Iterationen, 6 Teilmengen) mit 1-3-Koinzidenzmodus und mit Zerfalls-, Totzeit-, Zufalls-, Dämpfungs- und Streukorrekturen, um Bilder mit einer Gesamtgröße von 0,3 mm3 Voxel zu erstellen.
  6. Führen Sie einen Tag vor Beginn der bildgebenden Studie einen PET-Aktivitätstest des Mikro-PET/MR-Scanners durch, um die Genauigkeit der PET-Quantifizierung zu überprüfen.
    1. Bereiten Sie eine 5-ml-Spritze vor, die mit [18F]FDG gefüllt ist, wie in den Herstellerrichtlinien empfohlen (140-220 μCi/5-8 MBq in Wasser oder Kochsalzlösung).
    2. Zeichnen Sie die Aktivität der Spritze mit einem Dosiskalibrator auf (siehe Materialtabelle) und notieren Sie sich den Zeitpunkt der Messung.
    3. Wählen Sie den ROI der interpolierten Ellipse , um ein Volume-of-Interest (VOI) auf das rekonstruierte Bild zu zeichnen und die wiederhergestellte Aktivität mit dem oben gemessenen Wert zu vergleichen. Die wiederhergestellte Aktivität für einen gut kalibrierten Scanner liegt innerhalb von ±5%.

3. Injektion von [18F]FDG

  1. Bestellen Sie beim Lieferanten eine klinische Dosis von [18F]FDG (10 mCi/370 MBq) für die Ankunft im bildgebenden Labor etwa 30 Minuten vor der ersten geplanten Injektion. Achten Sie darauf, eine geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA) wie einen Laborkittel, Handschuhe, ein persönliches Strahlendosimeter z. B. Finger, den ganzen Körper zu tragen, wenn Sie die Verpackung mit radioaktiven Stoffen erhalten. Wechseln Sie die Handschuhe regelmäßig, um eine Kreuzkontamination der Radioaktivität zu verhindern und die Entfernung von der radioaktiven Quelle so weit wie möglich zu erhöhen.
  2. Verwenden Sie die Pinzette, um die [18F]FDG-Durchstechflasche vorsichtig hinter einen L-Block-Tischschild zu übertragen.
  3. Geben Sie ein Aliquot von [18F]FDG ab und verdünnen Sie es mit sterilisierter Kochsalzlösung, um eine Gesamtaktivitätskonzentration bei 200-250 μCi/7-9 MBq) in 100-150 μL zu erhalten.
  4. Ziehen Sie die [18F]FDG-Lösung in eine 1-ml-Spritze mit Nadel (siehe Materialtabelle), messen Sie die Radioaktivität mit einem auf F-18 eingestellten Dosiskalibrator und zeichnen Sie den Zeitpunkt der Messung auf.
  5. Notieren Sie das Gewicht der Maus vor der Injektion. Injizieren Sie die vorbereitete [18F]FDG-Lösung über die Heckvene. Beachten Sie die Injektionszeit und den Rückstand der Radioaktivität der Spritze, um eine Zerfallskorrektur zu ermöglichen.
  6. Setzen Sie die Maus wieder in den Käfig und erlauben Sie [18F]FDG-Aufnahme für 60 Minuten, bevor PET-Scans durchgeführt werden.
  7. Berechnen Sie die injizierte [18F]FDG-Aktivität anhand der folgenden Formel11:
    Injizierte Aktivität (μCi/MBq)
    = Aktivität in der Spritze vor der Injektion
    - Aktivität in der Spritze nach der Injektion

4. Micro-PET/MR-Erfassung

  1. Schalten Sie die Luftheizung auf das Mausbett ein, damit warme Luft hindurchströmen kann.
  2. Anästhesieren Sie die Maus mit 5% Isofluran (1 L/min medizinisches O2). Nach der Induktion die Maus auf das warme Mausbett übertragen und die Anästhesie über einen Nasenmaskenkegel bei 2%-3 % Isofluran aufrechterhalten. Positionieren Sie den Mauskopf auf der Bissstange und stellen Sie sicher, dass die Maus nicht außerhalb des Durchmessers des Bettes herausragt. Tragen Sie Augengleitmittel auf, um das Austrocknen und die Bildung von Hornhautgeschwüren zu vermeiden.
  3. Überwachen Sie die Körpertemperatur und die Atemfrequenz mit einer Wärmesonde bzw. einem Atemkissen. Halten Sie die Körpertemperatur bei 36-37 ° C und die Atemfrequenz bei 70-80 Atemzügen pro Minute (bpm), indem Sie den Isofluranspiegel anpassen.
  4. Führen Sie eine Scout-Ansicht durch, um die Mausposition zu bestimmen. Passen Sie die Mausbettposition so an, dass sie den gesamten Mauskörper einschließt und sicherstellt, dass sich das mittlere Sichtfeld der MR in der Mitte des Mauskörpers befindet.
  5. Wählen Sie unter PET-Erfassung im Fenster der Studienliste die Option Scanbereich bei vorheriger Erfassung aus, um die Position der Scout-Ansicht wie oben beschrieben zu verwenden. Klicken Sie auf Vorbereiten, um das Tierbett von MR auf PET zu verschieben. Wählen Sie OK, um den PET-Scan zu starten. Notieren Sie die Injektionsdosis und die Zeit, die vor und nach der [18F]FDG-Verabreichung im Radiopharmaceutical Editor gemessen wurden. Geben Sie im Menü "Betreffinformationen" das Gewicht der Maus ein.
  6. Sobald der PET-Scan abgeschlossen ist, wählen Sie Vorbereiten aus, um zur MR überzugehen, und schließen Sie alle MR-Akquisitionen im Studienlistenfenster ab. Wählen Sie OK, um die MR-Scans zu starten.
  7. Nachdem der gesamte Workflow abgeschlossen ist, bewerten Sie kurz die Qualität der aufgenommenen MR-Bilder mit der Nachbearbeitungssoftware (siehe Materialverzeichnis). Klicken Sie auf die Home-Taste , um das Mausbett von MR in die ursprüngliche Position zu bewegen.
  8. Entfernen Sie die Maus vorsichtig aus dem Scanner und bringen Sie sie in einen sauberen Gehäusekäfig mit einem beheizten Pad darunter, um eine Erholung in warmer Umgebung zu ermöglichen. Versorgen Sie die Maus mit Futter und Wasser. Das System ist nun bereit für die nächste Maus in der Warteschlange.
  9. Um Daten zu rekonstruieren, wählen Sie im Menü "Rohscan" die Option "PET-Erfassung", um den abgeschlossenen PET-Scan zu laden. Wählen Sie T1-gewichtete MR-Erfassung für die Materialkartenerstellung. Rekonstruieren Sie die Daten wie oben beschrieben (siehe Schritt 2.5).
  10. Befolgen Sie die lokalen und Institutsvorschriften bezüglich der Pflege und Handhabung von post-PET-bildgebenden Maus. Betrachten Sie alle gebrauchten Spritzen / Nadeln, Handschuhe, Einstreu und Fäkalien als radioaktive Abfälle, die eine besondere Handhabung / Entsorgung gemäß den lokalen Vorschriften erfordern.

5. Post-Imaging-Analyse

  1. Öffnen Sie die Bildanalyse-Software (siehe Materialverzeichnis) und klicken Sie auf DICOM-Daten laden , um die entsprechenden MR- und PET-Bilder abzurufen.
  2. Führen Sie eine Co-Registrierung von MR- und PET-Bildern durch, indem Sie diese Bilder in das Anzeigefenster ziehen. Klicken Sie auf die Funktion Automatische Registrierung .
    1. Wählen Sie im Dropdown-Menü Registrierung einrichten die Option Starre Transformation aus. Aktivieren Sie im Menü "Starr/Affine" die Option "Umschalt und Drehung".
    2. Wählen Sie im Menü Globale Rollenauswahl die Option T1-gewichtete MR-Akquisition als Referenz- und PET-Akquisition als Reslice aus.
    3. Prüfen Sie die Registrierung in allen drei Dimensionen, um eine perfekte Ausrichtung zwischen MR- und PET-Bildern sicherzustellen. Um es manuell anzupassen, klicken Sie auf Manuelle Registrierung.
  3. Verwenden Sie den ROI der interpolierten Ellipse, um VOI auf das interessierende Gewebe zu zeichnen, d. h. iBAT und inguinales weißes Fettgewebe (iWAT) unter Verwendung des MR-Bildes als Referenz. Verwenden Sie das Pinsel- und das Radiergummi-Werkzeug, um den VOI-Rahmen zu definieren. Daher die Anatomie von Geweben. Stellen Sie sicher, dass es keine Überlappungsaufnahme gibt, indem Sie PET-Bild verwenden, um ein Übergreifen von den benachbarten Organen zu vermeiden. Wiederholen Sie den Vorgang Folie für Folie, bis der gesamte VOI abgegrenzt ist. Bearbeiten Sie bei Bedarf die VOIs, um konsistente VOI-Volumes zwischen den einzelnen Maus beizubehalten.
  4. Verwenden Sie Ellipsoid VOI, um ein 3 mm3 VOI auf die Lunge als Referenzorgan zu zeichnen. Vermeiden Sie Spillover aus dem benachbarten Herzen und Muskel.
  5. Klicken Sie nach Abschluss auf ROI-Tabelle anzeigen , um jeden VOI umzubenennen. Notieren Sie die mittlere Radioaktivität mit dem VOI und dem Gewebevolumen in einer Tabelle. Archivieren Sie die VOI-Zeichnungen und die Bilddaten auf einem Datenspeicher.
  6. Berechnen Sie den standardisierten Aufnahmewert (SUV) für alle VOIs mit der folgenden Gleichung11:
    SUVmean = VOI-Radioaktivität in kBq / (Zerfall - korrigierte injizierte Dosis in kBq / Körpergewicht der Maus in kg), unter Annahme einer Gewebedichte von 1 g/ml.

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Ergebnisse

Drei Gruppen von Mäusen (n = 3 pro Gruppe) wurden in dieser Studie einer Mikro-PET/MR-Bildgebung unterzogen, bei der sie entweder bei Thermoneutralität (30 °C) oder kalt (6 °C) für 7 Tage untergebracht wurden. Einer Gruppe von Mäusen (n = 3) wurde vor der Kältebehandlung die iBAT (iBATx) entfernt (Abbildung 1A). Diese Methode führte bei allen drei Mäusen zu einer Veränderung der Aktivität des weißen Fettgewebes. Insbesondere wurde ein bemerkenswerter Anstieg der [18F]F...

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Diskussion

In dieser Studie wurde eine PET/MR-basierte Bildgebung und Quantifizierung von funktionellem braunem und beigem Fettgewebe bei Kleintier beschrieben. Diese Methode verwendet das nicht metabolisierbare Glukoseanalogon [18F]FDG als bildgebenden Biomarker, um das Fettgewebe mit hohem Glukosebedarf nicht-invasiv zu identifizieren. MR bietet einen guten Weichteilkontrast und kann Fettgewebe besser von den benachbarten Weichteilen und Muskeln unterscheiden. In Kombination mit PET ermöglicht dies eine genaue Abbildu...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken der National Natural Science Foundation of China (NSFC) - Excellent Young Scientists Fund (Hong Kong and Macau) (81922079), dem Hong Kong Research Grants Council General Research Fund (GRF 17121520 und 17123419) und dem Hong Kong Research Grants Council Collaborative Research Fund (CRF C7018-14E) für kleine bildgebende Tierexperimente.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
0.9% sterile salineBBraun0.9% sodium chloride intravenous infusion, 500 mL
5 mL syringeTerumoSS05L5 mL syringe Luer Lock
Dose CalibratorBiodexAtomlab 500
Eye lubricantAlcon DuratearsSterile ocular lubricant ointment, 3.5 g
Insulin syringeTerumo10ME29131 mL insulin syringe with needle
InterView Fusion softwareMedisoVersion 3.03Post-processing and image analysis software
IsofluraneChanelle PharmaIso-Vet, inhalation anesthetic, 250 mL
KetamineAlfasan International B.V.HK-37715Ketamine 10% injection solution, 10 mL
Medical oxygenLinde HKO101-HRcompressed gas, 99.5% purity
MetacamBoehringer Ingelheim5 mg/mL Meloxicam solution for injection for dogs and cats, 10 mL
nanoScan PET/MR ScannerMediso3 Tesla MR
Nucline nanoScan softwareMedisoVersion 3.0Scanner operating software
Wound clipsReflex 7203-1007mm Stainless steel wound clips, 20 clips
XylazineAlfasan International B.V.HK-56179Xylazine 2% injection solution, 30 mL

Referenzen

  1. Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
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