Verwendung von Organkulturen vom Trowell-Typ zur Untersuchung der Regulation von dentalen Stammzellen

Zusammenfassung

Die Trowell-Typ-Organkulturmethode wurde verwendet, um komplexe Signalnetzwerke zu entschlüsseln, die die Zahnentwicklung steuern, und in jüngerer Zeit zur Untersuchung der Regulation von Stammzellen des kontinuierlich wachsenden Mausschneidezahns. Fluoreszenzreporter-Tiermodelle und Live-Imaging-Verfahren ermöglichen eingehende Analysen von dentalen Stammzellen und ihrer spezifischen Nischenmikroumgebung.

Zusammenfassung

Organentwicklung, -funktion und -regeneration hängen von Stammzellen ab, die sich in diskreten anatomischen Räumen befinden, die als Stammzellnischen bezeichnet werden. Der kontinuierlich wachsende Mausschneidezahn bietet ein hervorragendes Modell, um gewebespezifische Stammzellen zu untersuchen. Die epithelgewebespezifischen Stammzellen des Schneidezahns befinden sich am proximalen Ende des Zahnes in einer Nische, der sogenannten Zervixschleife. Sie sorgen für einen kontinuierlichen Zellzustrom, um den ständigen Abrieb der selbstschärfenden Zahnspitze auszugleichen. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Isolierung und Kultur des proximalen Endes des Mausschneidezahns vorgestellt, in dem sich Stammzellen und ihre Nische befinden. Dies ist ein modifiziertes Organkulturprotokoll vom Typ Trowell, das die In-vitro-Kultur von Gewebestücken (Explantaten) sowie der dicken Gewebescheiben an der Flüssig-Luft-Grenzfläche auf einem Filter ermöglicht, der von einem Metallgitter unterstützt wird. Das hier beschriebene Organkulturprotokoll ermöglicht Gewebemanipulationen, die in vivo nicht durchführbar sind, und in Kombination mit der Verwendung eines fluoreszierenden Reporters bietet es eine Plattform für die Identifizierung und Verfolgung diskreter Zellpopulationen in lebenden Geweben im Laufe der Zeit , einschließlich Stammzellen. Verschiedene regulatorische Moleküle und pharmakologische Verbindungen können in diesem System auf ihre Wirkung auf Stammzellen und deren Nischen getestet werden. Dies ist letztendlich ein wertvolles Werkzeug, um die Regulation und Aufrechterhaltung von Stammzellen zu untersuchen.

Einleitung

Mausschneidezähne wachsen kontinuierlich aufgrund der lebenslangen Erhaltung der Stammzellen (SC), die die unaufhörliche Produktion von Zahnkomponenten unterstützen. Dazu gehören epitheliale SCs, die unter anderem schmelzproduzierende Ameloblasten erzeugen, und mesenchymale Stammzellen (MSCs), die Dentin produzierende Odontoblasten erzeugen¹. Die epithelialen SCs in den kontinuierlich wachsenden Schneidezähnen wurden zunächst als markierungserhaltende Zellen^2,3 identifiziert und es wurde seitdem gezeigt, dass sie eine Reihe bekannter Stammnessgene^, einschließlich Sox2⁴, exprimieren. Diese Zellen teilen gemeinsame Merkmale mit epithelialen SCs in anderen Organen und befinden sich in der SC-Nische, die als zervikale Schleife auf der labialen Seite des Schneidezahns bezeichnet wird. Die Nische ist eine dynamische Einheit, die aus Zellen und extrazellulärer Matrix besteht, die die SC-Aktivität^{steuern 5}. Studien zur Linienverfolgung haben gezeigt, dass Sox2+ epitheliale SCs das gesamte Epithelkompartiment des Zahnes regenerieren können und dass sie für die Sukzessionszahnbildung entscheidend sind ^6,7. MSCs mit reparativem oder regenerativem Dentinpotenzial werden größtenteils von außerhalb des Organs über Blutgefäße und Nerven 8,9,10,11 rekrutiert und bieten daher ein geeignetes Modell zur Untersuchung der Rekrutierung, Migration und Unterbringung der MSC-Population.

Die Untersuchung von SCs in vivo ist nicht immer möglich, da viele der genetischen und/oder pharmakologischen Manipulationen die Organhomöostase beeinträchtigen und/oder tödliche Folgen haben können. Daher bietet die Organkultur ein hervorragendes Werkzeug, um die Regulation von SCs und ihren Nischen in vitro zu untersuchen. Das Organkultursystem, das ein Metallgitter verwendet, wurde ursprünglich von Trowell¹² entwickelt, um die Organentwicklung zu untersuchen, und wurde von Saxen¹³ weiter modifiziert, um induktive Signale in der Nierenentwicklung zu untersuchen. Seitdem wird diese In-vitro-Methode zur Kultivierung des gesamten oder eines Teils des Organs in verschiedenen Bereichen erfolgreich angewendet. Im Bereich der Zahnentwicklung wurde diese Methode häufig verwendet, um die epithelial-mesenchymalen Wechselwirkungen zu untersuchen, die die Zahnentwicklung¹⁴ und die Sukzessionszahnbildung¹⁵ steuern. Die Arbeit des Thesleff-Labors hat den Nutzen dieses Systems für die zeitliche Analyse des Zahnwachstums und der Morphogenese, für die Analyse der Wirkung verschiedener Moleküle und Wachstumsfaktoren auf das Zahnwachstum und für die Zeitraffer-Live-Bildgebung der Zahnentwicklung gezeigt^16,17. In jüngerer Zeit wurde diese Methode verwendet, um die Regulation von Schneidezahn-SCs und ihrer Nische^18,19 zu untersuchen^, die hier ausführlich beschrieben wird.

Protokoll

Dieses Protokoll beinhaltet die Verwendung von Tieren und alle Verfahren wurden von den Ethikkommissionen für die Verwendung und Pflege von Tieren und der Tiereinrichtung der Universität Helsinki genehmigt.

1. Zubereitung der Organkulturschale

1. Führen Sie alle Verfahren in einer Laminar-Flow-Haube durch. Reinigen Sie Arbeitsflächen mit 70% Ethanol und verwenden Sie Instrumente und Lösungen aus autoklaviertem Glas. Sterilisieren Sie Scheren und andere Metallgeräte in einem Glasperlensterilisator.
2. Bereiten Sie Filter vor, die normalerweise in 70% Ethanol gelagert werden, indem Sie sie dreimal in 1x PBS waschen, um Ethanol zu entfernen (Abbildung 1). Filter in rechteckige Stücke schneiden (3 x 3-5 x 5 mm).
   HINWEIS: Gewaschene Filterstücke können mehrere Tage in 1x PBS bei 4 °C gelagert werden.
3. Das Kulturmedium wird vorbereitet (1:1 DMEM:F12 ergänzt mit 1% [v/v] 200 mM L-Alanyl-L-glutamin-Dipeptid in 0,85% NaCl, 10% [v/v] FBS, 150 μg/ml Ascorbinsäure und 0,2% [v/v] Penicillin [10.000 I.U./ml] und Streptomycin [10.000 μg/ml]). Bei 4 °C lagern.
4. Legen Sie die 30 mm Metallgitter (mit Löchern mit 1-2 mm Durchmesser, die die Gewebebildgebung ermöglichen) in eine 35 mm große Petrischale. Fügen Sie genügend Medien hinzu, um die Gitteroberfläche zu erreichen, ohne Luftblasen zu erzeugen. Die vorbereitete Kulturschale bei 37 °C vorwärmen, bis das Gewebe isoliert und kulturbereit ist (in einem Standard-Inkubator mit 5%_CO2 und 90%-95% Feuchtigkeit).

2. Inzistordissektion und Isolierung des proximalen Endes

1. Opfern Sie die Tiere nach einem genehmigten Tierpflegeprotokoll.
2. Enthaupte die Maus und seziere den Unterkiefer. Entfernen Sie dazu zuerst die Haut, um den Unterkiefer freizulegen, und schneiden Sie durch die Massetermuskeln, um sie vom Oberkiefer und dem Rest des Kopfes zu trennen.
3. Sobald der Unterkiefer isoliert ist, entfernen Sie die Zunge und so viel Weichgewebe wie möglich.
4. Sammeln Sie alle Unterkiefer und bewahren Sie sie in einer Petrischale auf, die PBS auf Eis enthält, da dies die Lebensfähigkeit des Gewebes verbessert.
5. Bringen Sie einen Unterkiefer in eine Glas-Petrischale und verwenden Sie Einweg-20/26 G Injektionsnadeln, um den Schneidezahn unter einem Stereomikroskop zu sezieren. Teilen Sie den Unterkiefer an der Mittellinie und schneiden Sie durch die Symphyse. Reinigen Sie das Weich- und Muskelgewebe von der Knochenoberfläche weg, um eine bessere Visualisierung zu ermöglichen.
   HINWEIS: Eine Glas-Petrischale ist unerlässlich, da dies die Nadeln nicht abstumpft.
6. Unterkiefer von Tieren, die jünger als 10 Tage sind, sind weicher und zerbrechlicher, daher verwenden Sie Einweg-20/26 G-Injektionsnadeln, um jede Hälfte des Unterkiefers längs zu öffnen, um den Schneidezahn freizulegen. Verwenden Sie bei Mäusen, die älter als 10 Tage sind, eine Pinzette, um den Unterkiefer zu greifen und den Knochen zu brechen, um den Zahn freizulegen.
7. Lösen Sie den Schneidezahn vorsichtig vom umgebenden Knochen und schneiden Sie das proximale Ende ab, das die Zervixschlinge enthält.
8. Schneiden Sie das proximale Ende ab und entfernen Sie den mineralisierten Zahnschmelz und die Dentinmatrix.
9. Bewahren Sie die gesammelten proximalen Enden in Dulbeccos PBS auf Eis, bis sie für die Kultur bereit sind.

3. Kultur

1. Platzieren Sie vorsichtig ein Filterrechteck auf der Oberseite eines Gitters in einer vorgewärmten Kulturschale.
2. Verwenden Sie ein Stereomikroskop, um die Gewebestücke richtig auszurichten.
3. In einen Standard-Inkubator bei 37 °C mit 5%_CO2 und 90%-95% Luftfeuchtigkeit geben.
4. Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag und ersetzen Sie es durch frisches Medium, wobei die Bildung von Luftblasen sorgfältig vermieden wird. Überwachen Sie das Gewebewachstum und fotografieren Sie täglich mit einer Kamera, die am Stereomikroskop befestigt ist.

4. Hinzufügen löslicher Faktoren zur Kultur

1. Ergänzen Sie das Kulturmedium mit löslichen Faktoren und Molekülen von Interesse, um ihre Wirkung auf die Regulation von SCs zu untersuchen.
   HINWEIS: Das Verabreichungsprotokoll für jedes Molekül (Wachstumsfaktoren, Signalmoleküle, blockierende Antikörper, pharmakologische Verbindungen wie Inhibitoren oder Aktivatoren, Vektoren usw.) hängt von seiner Halbwertszeit und Löslichkeit ab. Diese Parameter bestimmen auch die geeignete Steuerung.

5. Molekulare und histologische Analysen

1. Entfernen Sie das Kulturmedium.
2. Fügen Sie vorsichtig eiskaltes Methanol zu den Geweben hinzu, um ein Ablösen von den Filtern zu verhindern.
3. Methanol 5 min einwirken lassen.
4. Transferfilter, die Gewebeexplantate transportieren, in Probenahmeröhrchen.
5. Die Explantate in 4% Paraformaldehyd in PBS für 10-24 h bei 4 °C fixieren.
6. Fahren Sie mit etablierten Protokollen für die histologische Verarbeitung (Paraffin, gefroren usw.) oder Immunfärbungen fort.

6. Kultur von Gewebeschnitten

HINWEIS: Es gibt mehrere Variationen dieses Protokolls, die alle gleichermaßen erfolgreich sind und eine Frage der persönlichen Wahl sind, abhängig von der Geschwindigkeit und den Fähigkeiten des Benutzers. Diese beziehen sich auf den Puffer, der verwendet wird, um die Lebensfähigkeit des Gewebes zu sammeln und zu erhalten. Zu diesem Zweck können Krebspuffer, PBS ergänzt mit 2% Glukose und Antibiotika oder PBS verwendet werden. Wenn Krebspuffer verwendet wird, sollte er 1 Tag im Voraus hergestellt und bei 4 ° C gehalten werden.

1. Vor dem Versuch 4%-5% Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt vorbereiten, indem 2-2,5 g Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt in 50 ml siedender 2% Glucose/PBS gelöst werden, wonach die Lösung in ein 45 °C warmes Wasserbad gegeben werden sollte.
2. Vibratom aufstellen, mit 70% Ethanol waschen und mit eiskaltem 2% Glukose / PBS füllen, ergänzt mit Antibiotika (100 U / ml Penicillin, 100 mg / ml Streptomycin).
3. Sezieren Sie die proximalen Enden des Schneidezahns und sammeln Sie sie in der eiskalten 2% Glukose / PBS ergänzt mit Antibiotika.
4. Legen Sie ein proximales Ende des Schneidezahns in die Form, die 4% -5% Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt enthält. Richten Sie das Stück unter einem Stereomikroskop in die gewünschte Richtung aus und lassen Sie es auf Eis, damit die Agarose aushärten kann.
5. Schneiden Sie den gehärteten Agaroseblock ab und legen Sie ihn in den Vibratom. Dicke Scheiben schneiden (150-300 μm).
6. Sammeln Sie die Scheiben in einer Petrischale mit eiskalter 2% Glukose / PBS, ergänzt mit Antibiotika.
7. Die dicken Scheiben werden mit einem Spatel auf ein Filterrechteck übertragen, das auf dem gemäß Abschnitt 1.3 vorbereiteten vorgewärmten Gitter platziert ist.
8. Inkubieren Sie die dicken Scheiben im Inkubator und fahren Sie mit der Bildgebung fort (Abbildung 2).

Ergebnisse

Die epithelialen SCs befinden sich in einer Nische, die als zervikale Schleife bezeichnet wird und sich am proximalen Ende des Schneidezahns befindet (Abbildung 3A). Zervikale Schleifen sind morphologisch unterschiedliche Strukturen, die aus innerem und äußerem Schmelzepithel bestehen und das Sternretikulum, einen Kern locker angeordneter Epithelzellen, umhüllen (Abbildung 3B,C). Es gibt zwei zervikale Schleifen in jedem Schneidezahn (

Diskussion

In-vitro-Organkultur wurde ausgiebig verwendet, um induktives Potenzial und epithelial-mesenchymale Wechselwirkungen zu untersuchen, die das Organwachstum und die Morphogenese steuern. Das Thesleff-Labor hat gezeigt, wie die Saxén-Modifikation der Organkultur vom Trowell-Typ angepasst und zur Untersuchung der Zahnentwicklung verwendet werden kann¹⁴. Die reproduzierbaren Bedingungen und Fortschritte bei fluoreszierenden Reportern haben dies zu einer nützlichen Methode zur Überwachung de...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-mL plastic syringes
Disposable 20/26 gauge hypodermic needles	Terumo
DMEM	Gibco	61965-026
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Gibco	14287
Extra Fine Bonn Scissors	F.S.T.	14084-08
F-12	Gibco	31765-027
FBS South American (CE)	LifeTechn.	10270106	divide in aliquotes, store at -20°C
Glass bead sterilizer, Steri 250 Seconds-Sterilizer	Simon Keller Ltd	4AJ-6285884
GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide)	Gibco	35050-038
Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm diameter	MerckMillipore	VCTP02500	Store in 70% ethanol at room temperature.
L-Ascobic Acid	Sigma	A4544-25g	diluted 100 mg/ml in MilliQ, filter strerilized and divided in 20μl aliquotes, store at dark, -20°C
Low melting agarose	TopVision	R0801
Metal grids			Commercially available, or self-made from stainless-steel mesh (corrosion resistant, size of mesh 0.7 mm). Cut approximately 30 mm diameter disk and bend the edges to give 3 mm height. Use nails to make holes.
Micro forceps	Medicon	07.60.03
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich
Penicillin-Streptomycin (10,000U/ml) sol.	Gibco	15140-148
Petri dishes, Soda-Lime glass	DWK Life Sciences	9170442
Petridish 35 mm, with vent	Duran	237554008
Petridish 90 mm, no vent classic	Thermo Fisher	101RT/C
Small scissors