Funktionelle Beurteilung der intestinalen Tight-Junction-Barriere und der Ionenpermeabilität im heimischen Gewebe durch Ussing-Chamber-Technik

Zusammenfassung

Das Darmepithel verleiht nicht nur Nährstoffaufnahme, sondern auch Schutz vor schädlichen Substanzen. Die apikal-epithelste interzelluläre Verbindung, d. h. die Tight Junction, reguliert die parazelluläre Durchlässigkeit von gelösten Stoffen und Ionen. Hier wird ein Protokoll zur Herstellung von Schleimhautblättern und zur Beurteilung der Ionenselektivität von Tight Junctions mittels Ussing-Kammertechnik beschrieben.

Zusammenfassung

Die Ussing-Kammertechnik wurde erstmals 1951 vom dänischen Wissenschaftler Hans Ussing erfunden, um den transzellulären Transport von Natrium über die Froschhaut zu untersuchen. Seitdem wurde diese Technik auf viele verschiedene Gewebe angewendet, um die physiologischen Parameter des Transports über Membranen hinweg zu untersuchen. Die Ussing-Kammermethode ist anderen Methoden vorzuziehen, da natives Gewebe verwendet werden kann, wodurch es besser auf das anwendbar ist, was in vivo geschieht. Da jedoch natives Gewebe verwendet wird, ist der Durchsatz gering, die Zeit ist begrenzt und die Gewebevorbereitung erfordert Geschick und Training. Diese Kammern wurden verwendet, um spezifische Transporterproteine in verschiedenen Geweben zu untersuchen, Krankheitspathophysiologie wie bei Mukoviszidose zu verstehen, den Transport und die Aufnahme von Medikamenten zu untersuchen und insbesondere zum Verständnis des Nährstofftransports im Darm beizutragen. Angesichts des gesamten epithelialen Transportprozesses eines Gewebes sind nicht nur transepitheliale Bahnen, sondern auch parazelluläre Wege wichtig. Tight Junctions sind eine Schlüsseldeterminante der gewebespezifischen parazellulären Permeabilität im Darm. In diesem Artikel wird die Ussing-Kammertechnik verwendet, um die parazelluläre Permselektivität von Ionen durch Messung der transepithelialen Leitfähigkeit und der Verdünnungspotentiale zu bewerten.

Einleitung

Die Ussing-Kammermethode wurde erstmals von dem dänischen Wissenschaftler Hans Ussing entwickelt. Ussing verwendete es zunächst, um den Kurzschlussstrom des Natriumtransports über die Froschhaut zu messen, nachdem beobachtet wurde, dass NaCl gegen einen steilen Konzentrationsgradienten über die Haut transportiert werden ^konnte1. Sein System bestand aus der Froschhaut, die zwischen zwei Kammern mit Zugang zu beiden Seiten der Haut montiert war. Jede Kammer enthielt Ringer-Lösung, die zirkuliert und belüftet wurde. Zwei schmale Agar-Ringer-Brücken, die sich in der Nähe der Haut befinden und mit gesättigten KCl-Kalomel-Elektroden verbunden sind, messen die Potentialdifferenz, wie sie von einem Potentiator abgelesen wird. Ein zweites Paar Agarringerbrücken befand sich am gegenüberliegenden Ende jeder Kammer, die mit Bechergläsern mit gesättigtem KCl verbunden waren, das mit AgCl gesättigt war, um eine elektromotorische Kraft auszuüben, die von einer Batterie bereitgestellt wurde. Ein Potentialteiler wurde verwendet, um die Spannung so einzustellen, dass die Potentialdifferenz über die Haut Null blieb, wodurch Kurzschlussbedingungen erzeugt wurden. Ein Mikroamperemeter wurde ebenfalls angeschlossen, um den Strom abzulesen, der durch die Haut fließt (siehe die Abbildung in ^Ref.1 für das ursprüngliche Kammerdesign).

In den letzten 70 Jahren wurde diese Technik auf viele verschiedene Gewebe, insbesondere auf Darmgewebe, angewendet, um den Nährstoff- und Ionentransport zu untersuchen. Zum Beispiel wurde der Mechanismus des Cholera-induzierten Durchfalls untersucht, indem Kaninchenileum in diesen Kammern montiert wurde, und es wurde festgestellt, dass Choleratoxin-induzierter Durchfall durch ^cAMP2 vermittelt wird. Darüber hinaus wurden diese Kammern auch verwendet, um den Mechanismus zu untersuchen, der dem Glukosetransport über Na⁺-Glukose-Cotransporter 1 (SGLT1)³ zugrunde liegt. Unser Labor konzentriert sich auf den transzellulären und parazellulären Transport in Darmepithelzellen. Mit der Ussing-Kammermethode wurde der Peptidtransport in Claudin-15-Knockout-Mäusen untersucht, die den parazellulären Natriumtransport beeinträchtigt haben, wobei Ussing-Kammern verwendet wurden, um die Absorption des nicht hydrolysierbaren Dipeptids Glycylsarcosin zu messen. Es wurde festgestellt, dass die luminale Na⁺ -Homöostase für den Protonen-gekoppelten Peptidtransport wichtig ^ist4. Darüber hinaus wurden diese Kammern auch verwendet, um die Anionensekretion im murinen Blinddarm als Reaktion auf die submuköse Aktivierung des Proteinase-aktivierten Rezeptors 1 durch die Serinprotease ^Trypsin5 zu untersuchen.

Ussing-Kammern wurden kürzlich auch verwendet, um die parazellulären Bahnen im Epithelgewebe zu beurteilen. Parazelluläre Signalwege werden durch Tight Junctions reguliert, bei denen es sich um Proteinkomplexe handelt, die sich an dem Punkt bilden, an dem sich zwei oder mehr Zellen ^treffen6. Die Barrierefunktion und die Ionenselektivität (ob Anionen oder Kationen selektiv in der Lage sind, die Tight Junction zu passieren) wird durch das Vorhandensein von Proteinen der Claudin-Familie bestimmt; Einige davon wirken als Barrieren (Claudin 3 und 7), Anionenporen (Claudin 10A) oder Kationenporen (Claudin 2, 10B und 15)⁷. Andere Methoden wurden verwendet, um den parazellulären Signalweg zu beurteilen, wie z. B. die orale Gavage von FITC, begleitet von einer FITC-Konzentration im ^Blutplasma8 oder EDTA-Cr9; Diese Techniken sind jedoch von geringerer Auflösung und können die Ionenselektivität oder einen bestimmten Abschnitt der Abschnitte des Darmtraktes nicht beurteilen. Ussingkammern können jedoch verwendet werden, um das Verdünnungspotential von Zielionen zu bewerten und somit die Ionenselektivität der Dichtstellen zu bestimmen. Zum Beispiel kann mit NaCl die Selektivität der Engstellen für Na⁺ und Cl^- berechnet werden, indem eine Seite der Membran (normalerweise die Schleimhautseite) verdünnt und die Änderung der transepithelialen Potentialdifferenz gemessen wird. Die relativen Permeabilitäten von Na⁺ und Cl- können durch die Goldman-Hodgkin-Katz-Gleichung10 und die Selektivität der Tight Junction mit der Kimizuka-Koketsu-Gleichung11 geschätzt werden. Diese Kammern haben daher den Vorteil, die elektrophysiologischen Parameter des Gewebes zu messen und liefern dadurch mehr Informationen über den Durchgang von Ionen durch die Engstellen als andere Methoden mit niedrigerer Auflösung.

Die Ussing-Kammer-Methode ist nicht nur auf den Darmtrakt beschränkt, obwohl sie in Studien über den Darm weit verbreitet ist, hat sie auch viele andere Anwendungen. Zum Beispiel wurden diese Kammern verwendet, um Mukoviszidose und insbesondere den Chloridkanal-Mukoviszidose-Transmembran-Leitwertregulator (CFTR) zu ^{untersuchen12}. Mukoviszidose wird durch eine Mutation in CFTR13 verursacht, die zu einer gestörten Chloridsekretion und einem gestörten Flüssigkeitstransport durch respiratorische Epithelzellen und einer daraus resultierenden dickeren, trockeneren Schleimschicht ^führt14. Die Untersuchung der epithelischen CFTR der Atemwege wurde mit diesen Kammern durchgeführt, um nicht nur die Krankheit zu verstehen, sondern auch Wege zur Behandlung der Krankheit zu finden. Zum Beispiel wurde bei Patienten mit seltenen Mutationen, die Mukoviszidose verursachen, die Analyse von respiratorischen Epithelzellen von Patienten verwendet, um Therapien wie Orkambi und eine Verstärker-Kotherapie zu ^testen15.

Ussing-Kammern wurden auch verwendet, um die Wege der Arzneimittelabgabe zu untersuchen, z. B. mit menschlichem Biopsiegewebe, um die Arzneimittelaufnahme und Pharmakokinetik zu ^{untersuchen16.} Die Darmaufnahme ist nicht der einzige Weg der Medikamentenabgabe. Diese Kammern wurden auch verwendet, um nasale Arzneimittelabgabesysteme zu ^{untersuchen17.} Studien zur Arzneimittelabgabe mit Ussing-Kammern wurden auch für das Auge durchgeführt. In der Hornhaut des Kaninchens wurden Permeabilitäts- und Aufnahmestudien mit Labrasol durchgeführt, einem Medikament, das die Absorption von Medikamenten über Gewebe hinweg erhöhen ^soll18. Eine weitere Studie untersuchte die Wirkung von Benzylalkoniumchlorid auf die transsklerale Arzneimittelabgabe im Kaninchen ^Sklera19.

Die Ussing-Kammermethode ist nützlich, da natives Gewebe verwendet werden kann. Als solches ist es gegenüber In-vitro-Modellen wie Caco-2-Zelllinien vorzuziehen. Die Technik erfordert jedoch Geschick und Zeit, um Proben vorzubereiten, so dass sie nicht für Anwendungen mit hohem Durchsatz geeignet ist. Die elektrophysiologischen Eigenschaften von Zellmonoschichten können mit Hilfe von Zellkultureinsätzen in diesen Kammern untersucht werden. Jüngste Entdeckungen haben die Kultur von Organoiden ermöglicht, bei denen es sich um Mini-Organe handelt, die in Kultur aus der Ernte epithelialer oder endothelialer Stammzellen gezüchtet ^wurden20. Organoidkulturen können manipuliert werden, um in einer Monoschicht gezüchtet zu werden, wodurch es möglich wird, Organoide in einer Ussing-Kammer zu ^montieren21. Organoide verschiedener Epithel- und Endothelgewebe können untersucht werden, wodurch die Anzahl der benötigten Tiere verringert wird, da die Organoidkultur langfristig aufrechterhalten werden kann. Dies erhöht auch den Durchsatz, da zeitaufwendige und mühsame Gewebedissektions- und Präparationsschritte nicht erforderlich sind. Auch in Zukunft werden die Ussing-Kammerstudien für die Untersuchung des Gewebetransports sehr nützlich sein und im Bereich der personalisierten Medizin besonders wichtig sein.

Das folgende Protokoll demonstriert die Anwendung der Ussing-Kammermethode zur Beurteilung der Permselektivität und Barrierefunktion der Tight-Junctions im Dünndarm von Claudin-15-Knockout-Mäusen (Cldn15-^/-) und Wildtyp-Kontrollen (WT) durch Messung des Verdünnungspotenzials von NaCl. Tight Junctions (TJ) werden an der Stelle gebildet, an der sich zwei oder mehr Zellen im Epithel- und Endothelgewebe treffen. Es wird angenommen, dass bizelluläre Tight Junctions (bTJ), insbesondere die Proteine der Claudin-Familie, die im bTJ vorkommen, die Barrierefunktion und Permselektivität von ^TJ7 bestimmen. Cldn15^-/- Mäuse haben einen Mega-Dünndarm22 und eine reduzierte Nährstoffaufnahmefähigkeit aufgrund des Verlustes des intestinalen Na ^{+ -}Recyclings, der über Claudin 154,23,24 auftritt. Cldn15-^/- Mäuse haben eine beeinträchtigte Na⁺-Homöostase, was sie zu einem interessanten Modell für die Untersuchung der Permselektivität des TJ macht. Das folgende Protokoll bewertet die Permeabilität des TJ gegenüber NaCl durch Messung des Verdünnungspotentials von NaCl (_PNa/_PCl) im mittleren Dünndarm. Kurz gesagt, die Änderung der Membranpotentialdifferenz, die durch Verdünnung einer Seite der Membran (M-Seite oder S-Seite, beide werden im folgenden Protokoll gemessen) auftritt, kann verwendet werden, um die Permeabilität von Na + (^PNa) und Cl^- (PCl) zu berechnen, und das Verdünnungspotential (_PNa / _PCl) wird zeigen, ob die Tight Junction eine kationische oder anionische Selektivität aufweist.

Die Experimente in diesem Protokoll wurden mit einer kundenspezifischen Ussing-Kammer (Abbildung 1A) durchgeführt, die aus zwei Hälften besteht, zwischen denen die Darmvorbereitung vertikal montiert ist, Spannungsklemmverstärker, elektrischer Rekorder, Elektroden, Salzbrücken, Ringer-Lösung, HEPES-Puffer (150 mM NaCl), verdünnter HEPES-Puffer (75 mM NaCl), Darmvorbereitung (für Details über die Ausrüstung siehe die Tabelle der Materialien).

Protokoll

Alle Tiere, die in diesen Experimenten verwendet wurden, wurden in der Tierpflegeeinrichtung der Universität von Shizuoka untergebracht und die Experimente wurden gemäß den Richtlinien für Tierversuche der Universität Shizuoka durchgeführt. Alle Experimente wurden mit Genehmigung des Animal Care and Use Committee an der University of Shizuoka (Genehmigungen # 205272 und # 656-2303) durchgeführt.

1. Herstellung von NaCl-Elektroden

HINWEIS: Die in diesen Experimenten verwendeten Elektroden bestehen aus konzentriertem NaCl oder KCl. Die KCl/Calomel-Elektroden werden kommerziell eingekauft. Stellen Sie vor Beginn des Experiments sicher, dass alle Elektroden bis oben mit konzentrierter NaCl- oder KCl-Lösung gefüllt sind.

1. Bereiten Sie kleine Gläser mit Kunststoffdeckeln (Volumen 20 ml) vor.
2. Bohren Sie zwei Löcher in die Kunststoffdeckel, eines für die NaCl-Salzbrücke (2,5 mm Durchmesser) und das andere für Silberdraht (1 mm Durchmesser; Abbildung 1C, NaCl-Elektrode).
3. Füllen Sie das Glas mit gesättigter NaCl-Lösung (ca. 15 ml, bis voll).
4. Führen Sie Silberdraht (0,8 mm Durchmesser, 7 cm lang) in das Glas ein, stellen Sie jedoch sicher, dass der Drahtabschnitt außerhalb des Glases über Kroktorclips (kleine Größe) mit dem Verstärkersystem verbunden werden kann.
5. Wenn Sie nicht in Gebrauch sind, wickeln Sie die Elektroden ein und stellen Sie sicher, dass die Löcher mit Parafilm bedeckt sind, um ein Austrocknen zu verhindern.

2. Vorbereitung von Salzbrücken

HINWEIS: Bereiten Sie Salzbrücken mindestens einen Tag vor dem Experiment vor, um ausreichend Zeit zum Verfestigen zu haben. Salzbrücken können wiederholt verwendet werden, aber die Verwendung nach 2 Monaten wird nicht empfohlen.

1. NaCl Salzbrücken
   1. Bereiten Sie #7 Polyethylschläuche (Außendurchmesser 2,3 mm, Innendurchmesser 1,3 mm), 19 G Nadel- und Schlossspritze, 200 ml 1 M NaCl-Lösung, 2 g Agar, verschließbarer Kunststoffbehälter für die Salzbrückenlagerung vor.
   2. Bereiten Sie eine angemessene Anzahl von Salzbrücken vor, indem Sie die Schläuche auf die für die Einrichtung der Ussing-Kammer erforderliche Größe schneiden (jede Kammer benötigt zwei Salzbrücken).
   3. Machen Sie vor dem Einspritzen von Agar eine U-Form mit den Röhrchen und legen Sie sie in ein Becherglas mit warmem Wasser (um eine einfache Form für die Einrichtung von Salzbrücken zu schaffen).
   4. Machen Sie 200 ml 1 M NaCl, indem Sie 11,688 g NaCl in 200 ml in entionisiertem Wasser auflösen.
   5. 1 M NaCl in 100 mL Portionen aufteilen: 100 ml 2% Agar in 1 M NaCl herstellen (2 g Agar in NaCl mischen, in der Mikrowelle erhitzen, um sich aufzulösen).
   6. Füllen Sie die Spritze mit einer 19 G NaCl/Agar-Lösung mit einer 19 G NaCl/Agar-Lösung. Beginnen Sie vorsichtig, die Lösung tropfenweise auszustoßen, und führen Sie dabei die Nadel in ein Ende des Röhrchens ein und füllen Sie, bis die Mischung von der anderen Seite austritt.
   7. Ziehen Sie die Nadel langsam zurück, während Sie die Lösung noch ausdrücken, und wiederholen Sie den Vorgang, bis alle erforderlichen Salzbrücken hergestellt sind. (Wenn die Lösung in der Spritze oder Nadel erstarrt, erwärmen Sie sie kurz in heißem Wasser, bis die Lösung wieder ausgedrückt werden kann.)
   8. Überprüfen Sie die Salzbrücken, um sicherzustellen, dass keine Blasen vorhanden sind, und lagern Sie sie in der verbleibenden 1 M NaCl-Lösung in einem verschließbaren Behälter.
2. KCl Salzbrücken
   HINWEIS: Für die KCl-Agarbrücken werden dünnere Schläuche verwendet, um den Anstieg der K + ^- Konzentration im Puffer zu vermeiden, da sich die Salzbrückenspitzen auflösen können und K ^{+ in} den Puffer austreten kann.
   1. Bereiten Sie #3 Polyethylschläuche (Außendurchmesser 1,0 mm, Innendurchmesser 0,5 mm), 23 G Nadel- und Schlossspritze, 200 ml 1 M KCl-Lösung, 2 g Agar, verschließbarer Kunststoffbehälter für die Salzbrückenlagerung vor.
   2. Bereiten Sie eine angemessene Anzahl von Salzbrücken vor, indem Sie den Schlauch auf die Größe schneiden, die für die Einrichtung der Ussing-Kammer erforderlich ist (jede Kammer benötigt zwei Salzbrücken).
   3. Machen Sie 200 ml von 1 M KCl, indem Sie 14,91 g KCl in 200 ml deionisiertem Wasser auflösen.
   4. In zwei 100-ml-Portionen aufteilen: Machen Sie 100 ml 2% Agar in 1 M KCl (mischen Sie 2 g Agar in KCl, erhitzen Sie in einer Mikrowelle, um sich aufzulösen).
   5. Injizieren Sie mit einer 23 G Nadel und einer Verriegelungsspritze Schlauch mit 2% Agar 1 M KCl-Mischung (stellen Sie sicher, dass die Röhrchen vollständig gefüllt sind und keine Blasen vorhanden sind) auf die gleiche Weise wie bei den NaCl-Salzbrücken.
   6. Überprüfen Sie die Salzbrücken, um sicherzustellen, dass keine Blasen vorhanden sind, und lagern Sie sie in der verbleibenden 1 M KCl-Lösung in einem verschließbaren Behälter.

3. Vorbereitung der Ringer-Lösung und des HEPES-Puffers

HINWEIS: Abhängig von dem in der Ussing-Kammer montierten Gewebe können sich die Komponenten der Ringer-Lösung unterscheiden. Die hier vorgestellten Rezepte sind spezifisch für den Dünn- und Dickdarm.

1. Machen Sie die Lösung von Ringer am Tag der Versuche frisch, wie in Tabelle 1 beschrieben.
2. Blasen Sie die Lösung mit 95% O2/5% CO2, um dem Gewebe _O2 und eine Pufferkapazität zuzuführen_.

Ringer-Lösung (Dünndarm)	Ringerlösung (Dickdarm)
NaHCO3 – 21,0 mM	NaHCO3 – 21,0 mM
K2HPO4 – 2,4 mM	K2HPO4 – 2,4 mM
KH2PO4 – 0,6 mM	KH2PO4 – 0,6 mM
NaCl – 119,0 mM	NaCl – 119,0 mM
MgCl2 – 1,2 mM	MgCl2 – 1,2 mM
CaCl2 – 1,2 mM	CaCl2 – 1,2 mM
Indomethacin – 10 μM (1 mM Vorrat in 21 mM NaHCO3 herstellen, 10 mL Stamm für 1 L Ringer-Lösung hinzufügen)	Indomethacin – 10 μM (1 mM Vorrat in 21 mM NaHCO3 herstellen, 10 mL Stamm für 1 L Ringer-Lösung hinzufügen)
1 mM Glutamin (0,146 g/L)	10 mM Glukose

Tabelle 1: Rezept für Ringer's Solution Um die Lösung von Ringer herzustellen, mischen Sie alle Komponenten zusammen mit deionisiertem Wasser. Die Lösung von Ringer wird am besten vor Experimenten frisch hergestellt. Bis zum Gebrauch im Kühlschrank oder auf Eis aufbewahren. Vor der Verwendung Gas mit 95% O2/5% _CO2.

3. Machen Sie HEPES am Tag des Experiments frisch, wie in Tabelle 2 beschrieben, indem Sie die Zutaten in deionisiertem Wasser mischen.
4. Stellen Sie sich erst nach der pH-Einstellung auf das endgültige Puffervolumen ein.
5. Erwärmen Sie den HEPES-Puffer auf 37 °C und stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein, indem Sie unter Rühren langsam Tropfen von 1 M Tris-Lösung hinzufügen.
6. Passen Sie sich dem endgültigen Volumen an, indem Sie die entsprechende Menge an deionisiertem Wasser hinzufügen.

HEPES-Puffer	Verdünnungs-HEPES-Puffer
HEPES – 10 mM	HEPES – 10 mM
Glukose – 10 mM (Dickdarm)	Glukose – 10 mM (Dickdarm)
1 mM Glutamin (0,146 g/L) (Dünndarm)	1 mM Glutamin (0,146 g/L) (Dünndarm)
NaCl – 150 mM	NaCl – 75 mM + 150 mM Mannitol (zur Anpassung an Osmolalitätsunterschiede)
MgCl2 – 1 mM	MgCl2 – 1 mM
CaCl2 – 2 mM	CaCl2 – 2 mM
Indomethacin – 10 μM (1 mM Vorrat in 21 mM NaHCO3 herstellen, 10 mL Vorrat für 1 L Ringer's Solution hinzufügen)	Indomethacin – 10 μM (1 mM Vorrat in 21 mM NaHCO3 herstellen, 10 mL Vorrat für 1 L Ringer's Solution hinzufügen)
Stellen Sie den pH-Wert von 7,40 (37 ° C) mit 1 Mio. Tris ein

Tabelle 2: HEPES-Pufferrezept Um HEPES-Puffer und Verdünnungs-HEPES-Puffer herzustellen, lösen Sie alle Inhaltsstoffe in deionisiertem Wasser auf. Lösungen müssen mit 1 M Tris-Lösung pH-eingestellt werden, fügen Sie daher nicht das volle Volumen Wasser hinzu (z. B. lösen Sie bei der Herstellung von 1 L alle Zutaten in etwa 800 ml Wasser auf). Dann erhitzen Sie die Lösung auf 37 ° C, stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 und stellen Sie dann das endgültige Volumen ein.

4. Einrichtung der Ussing-Kammer

HINWEIS: Die in diesem Protokoll verwendeten Ussing-Kammern sind maßgeschneiderte kontinuierliche Perfusionskammern. Zur Beurteilung der Darmbarrierefunktion der Maus oder der Nährstoffaufnahme werden Kammern mit einer Öffnung von 4 oder 5 mm Durchmesser ^empfohlen25 (Abbildung 1A-C).

1. Um den ^{Kanteneffekt26} zu reduzieren und die Kammern besser abzudichten, befestigen Sie vor dem Aufstellen 4 oder 5 mm gestanzte Paraffinfolie (ca. 4 ^cm2) (Abbildung 1B).
2. Aufgestellt im offenen Kreislauf zur Verdünnungspotentialmessung. Im aktuellen Klemmmodus eingestellt. Stellen Sie den Ausgang als Strom ein und stellen Sie den Stromimpuls auf ±20 μA ein.
3. Beim Einstellen unter Kurzschlussbedingungen zur Messung von Kurzschlussstrom und Transmukosalwiderstand in den Spannungsklemmmodus eingestellt. Stellen Sie den Ausgang als Spannung ein und stellen Sie den Spannungsimpuls auf ±5 mV ein.
4. Stellen Sie sicher, dass 37 °C Wasser im Wassermantel zirkuliert.
5. Füllen Sie jede Kammer mit Ringer-Lösung oder HEPES-Puffer (Menge hängt vom verwendeten System ab, die hier verwendeten Kammern benötigen 5 ml für jede Seite) und stellen Sie sicher, dass keine Lecks vorhanden sind.
6. Verbinden Sie Salzbrücken und Elektroden.
7. Stellen Sie sicher, dass die Spannung 0 und stabil ist, Impulsstrom, um sicherzustellen, dass Salzbrücken und Elektroden ordnungsgemäß eingerichtet sind.
8. Lassen Sie die Temperatur der System- und Ringerlösung für mindestens 20 min ausgleichen.
9. Korrigieren Sie nach dem Ausgleich die asymmetrische Spannungsdifferenz zwischen den KCl-Elektroden und kompensieren Sie den Flüssigkeitswiderstand, indem Sie ihn auf Null ändern (siehe Handbuch für das Ussing-Kammersystem, das zur Bestimmung des richtigen Weges verwendet wird).

5. Dissektion von Darmgewebe

HINWEIS: Alle Tierversuche müssen innerhalb der vom Land und der Universität festgelegten Vorschriften durchgeführt werden.

1. Vor der Einnahme des Darmgewebes frische, eiskalte Ringer-Lösung zubereiten und mit 95% O2 und 5_{% CO2} für 15 min blasen (Schritt 3).
2. Anästhesien von Mäusen gemäß den Richtlinien für den Einsatz von Tieren in der Forschung. Für dieses Experiment wurden Mäuse mit 2% -3% Isofluran betäubt, das von einem Anästhesisten verabreicht wurde. Überprüfen Sie die richtige Anästhesie, indem Sie die Zehen kneifen und sicherstellen, dass keine Schmerzreaktion auftritt.
3. Machen Sie einen Schnitt in den Bauch mit einer Schere vom Becken bis zum Zwerchfell; Suchen Sie den Magen und schneiden Sie das Pylorusende des Magens ab.
4. Greifen Sie den am Dünndarm befestigten Magenteil mit einer Pinzette und ziehen Sie vorsichtig den Dünndarm, während Sie die mesenterialen Anhänge abschneiden. Achten Sie darauf, das Darmgewebe in keiner Weise zu schneiden oder zu schädigen.
5. Fahren Sie fort, den Darm bis zum Anus zu sezieren. Für die vollständige Entfernung des Dickdarms schneiden Sie die Beckenknochen ab, um den distalen Teil des Dickdarms freizulegen, und entfernen Sie vorsichtig den Rest des Darms, indem Sie die Anhaftungen abschneiden.
6. Messen Sie die Länge des Darms und teilen Sie in gewünschte Segmente. Teilen Sie für dieses Experiment den Dünndarm in drei Segmente auf und verwenden Sie das mittlere Segment.
7. Legen Sie die gewünschten Segmente in eiskalte, sprudelnde Ringer-Lösung; Öffnen Sie dann jedes Segment in Längsrichtung, indem Sie entlang der mesenterialen Anhänge schneiden. Fett und Bindegewebe abschneiden.
8. Geben Sie die Segmente in die eiskalte Ringerlösung zurück und waschen Sie sie gründlich (selbst in der eiskalten Lösung ist die Sauerstoffversorgung des luminalen Epithels wichtig, um die Epithelfunktion aufrechtzuerhalten).

6. Abbau der Muskelschicht und Vorbereitung des Darmblattes

HINWEIS: Die Entfernung der Serosa (Muskelschicht) ist wichtig für Transportstudien mit dem Darm. Wenn die Serosa verbleibt, kann das Darmgewebe zufälligen Muskelkontraktionen ausgesetzt sein, die die elektrophysiologischen Daten verzerren, und der Transport kann gehemmt werden. Ungestreiftes Gewebe verschlechtert sich schnell, wenn es in Ussing-Kammern montiert wird, da die Serosa eine signifikante Diffusionsbarriere für Substrat und Sauerstoff darstellt. In einigen besonderen Fällen kann es notwendig sein, die Muskelschicht beizubehalten, so dass die Entscheidung beim Forscher und dem experimentellen Design liegt. Die Darmschichten können auf zwei Arten vorbereitet werden, je nachdem, welche Schicht entfernt wird (Abbildung 2). Für dieses Experiment werden Schleimhaut- und submuköse Präparate benötigt (Abbildung 2, 2^. Panel).

1. Bereiten Sie Dissektionsplatten (10 cm Durchmesser) vor, die mit Silikonkautschuk, Stiften (kleine Akupunkturnadeln), 5 mm gestanztem Filterpapier und Parafilmquadraten (2 cm x 2 cm; für andere Systeme möglicherweise nicht erforderlich) bedeckt sind.
2. Gießen Sie frische, eiskalte, gesprudelte Ringer-Lösung in die Dissektionsplatte (genug, um das Gewebe zu bedecken, ca. 2-3 ml).
3. Heften Sie unter einem Stereomikroskop die Enden des Darmgewebes (Schleimhautseite nach unten) ab.
4. Mit einer feinen Pinzette die Muskelschicht von der darunter liegenden Schleimhaut stumpf sezieren.
5. Achten Sie darauf, keine Löcher in das Gewebe zu reißen oder einzuführen.
6. Sobald die Muskelschicht entfernt ist, schneiden Sie ein Stück groß genug für eine Öffnung mit einem Durchmesser von 5 mm. Bei der Vorbereitung des Dünndarms sollte die Entfernung der Serosa-Muskelschicht innerhalb von 10 Minuten erfolgen, da die luminale Sauerstoffversorgung unter diesen Bedingungen schwierig ist.
7. Nasses 5 mm gestanztes Filterpapier quadratisch in Ringer-Lösung und das Darmgewebe mit Schleimhautseite nach unten darauf legen, da sich submuköse Präparate spontan mit der Schleimhautseite außen umwickeln.
8. Stellen Sie sicher, dass die Öffnung vollständig vom Darmgewebe bedeckt ist und keine Falten vorhanden sind. Verwenden Sie eine schwarze Tafel unter der Vorbereitung, um zu prüfen, ob die Öffnung vollständig bedeckt ist.
9. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die erforderliche Anzahl von Schleimhautpräparaten (in diesem Experiment sind zwei Präparate erforderlich: Ein Präparat wird verwendet, um das Verdünnungspotenzial zu messen, und das andere wird verwendet, um elektrische Basisparameter zu messen).

7. Montage von Darmpräparaten in Ussing-Kammern

HINWEIS: Die Einrichtung hängt von der Art des verwendeten Ussing-Kammersystems und des verwendeten Aufzeichnungssystems ab.

1. Saugen Sie Ringer's Solution/HEPES-Puffer aus der Ussing-Kammer ab.
2. Zerlegen Sie die Ussing-Kammer und legen Sie das Filterpapier mit der Darmpräparationsschleimhautseite nach unten auf die Schleimhautseitenkammer und stellen Sie sie so ein, dass das Fenster der Kammer mit dem Loch des Filterpapiers übereinstimmt (Abbildung 1A, schwarze Markierung um das Kammerfenster ist nützlich für die Ausrichtung der Präparate).
3. Legen Sie die Serosa-Seitenkammer vorsichtig auf die Schleimhaut-Seitenkammer und schließen Sie sie fest, aber stellen Sie sicher, dass sich die Darmschicht während der Verbindung nicht bewegt hat.
4. Füllen Sie beide Kammern schnell mit Ringer-Lösung oder HEPES-Puffer auf und platzieren Sie sprudelnde Stäbe (Ringer-Lösung: 95% O2/5% _CO2; HEPES-Puffer: 100% _O2) am gegenüberliegenden Ende der Kammern, weg von der Membran (zu nahe an der Zubereitung zu sprudeln, könnte sich auf die Messungen auswirken).
5. Schließen Sie die Salzbrücken wieder an und überprüfen Sie, ob die Spannung stabil und der Impulsstrom stabil sind, um sicherzustellen, dass die Verbindungen in Ordnung sind (Abbildung 1C).
6. Wiederholen Sie dies für jede Darmvorbereitung.
7. Lassen Sie das System für ca. 15 min ausgleichen. Wenn Sie ein Aufzeichnungssystem verwenden, lassen Sie den Leitwert und die _Isc / Membran-Potentialdifferenz stabilisieren, bevor Sie mit den Experimenten beginnen.

8. Verdünnungspotentialexperiment (Öffnerbedingungen)

1. Waschen Sie beide Seiten der Kammer, indem Sie den HEPES-Puffer absaugen und jeder Seite 5 ml frischen, vorerwärmten HEPES-Puffer hinzufügen.
2. Schalten Sie das Aufnahmesystem ein. Stellen Sie den Bereich auf 250 mV ein (das hier verwendete System verstärkt die Ausgangsspannung um 10x), setzen Sie die Markerpositionen ein und stellen Sie das Aufnahmesystem auf Maß ein.
3. Schalten Sie die Ussing-Kammersysteme in den Klemmmodus und beginnen Sie mit der Messung. Sobald sich das Membranpotential stabilisiert hat (~15-20 min), kann die Bewertung beginnen.
4. Saugen Sie den HEPES-Puffer von der Schleimhautseite ab und ersetzen Sie ihn schnell durch 5 ml erwärmten Verdünnungs-HEPES-Puffer mit 75 mM NaCl.
5. Sobald das Membranpotential seinen Höhepunkt erreicht hat (5-10 min), entfernen Sie den Verdünnungspuffer von der "Mucosal" -Seite und ersetzen Sie ihn durch HEPES-Puffer.
6. Falls erforderlich, wiederholen Sie Schritt 3 für die Serosalseite und fügen Sie der Serosalseite einen Verdünnungs-HEPES-Puffer hinzu.
7. Um sicherzustellen, dass das Gewebe lebensfähig ist, fügen Sie den Adenylatcyclase-Aktivator Forskolin (Endkonzentration 10 μM) auf der Serosa-Seite hinzu.
8. Sobald die Membranpotentialdifferenz einen Höhepunkt erreicht hat und zu sinken begonnen hat, ist das Experiment vorbei.

9. Messung der transepithelialen elektrischen Leitfähigkeit und des Basis-Isc (Kurzschlussbedingungen)

1. Waschen Sie beide Seiten der Kammer, indem Sie die Lösung des Ringers absaugen und 5 ml frische geblasene Ringerlösung auf jede Seite geben.
2. Schalten Sie das Aufnahmesystem ein. Stellen Sie den Bereich auf 2,5 V ein (das hier verwendete System verstärkt die Ausgangsspannung um das 10-fache), stellen Sie die Markerpositionen ein und stellen Sie das Aufnahmesystem auf Maß ein.
3. Schalten Sie die Ussing-Kammersysteme in den Klemmmodus und beginnen Sie mit der Messung. Sobald sich _Isc und Leitwert stabilisiert haben (~15-20 min), können Baseline-Messungen erhalten werden.
4. Um sicherzustellen, dass das Gewebe lebensfähig ist, fügen Sie den Adenylatcyclase-Aktivator Forskolin (Endkonzentration 10 μM) auf der Serosaseite hinzu.
5. Sobald die Membranpotentialdifferenz einen Höhepunkt erreicht hat und zu sinken begonnen hat, ist das Experiment abgeschlossen.

10. Ergebnisse analysieren

1. Berechnen Sie unter Offenkreisbedingungen den transmukösen Leitwert aus der Spannungsänderung als Reaktion auf Stromimpulse nach dem Ohmschen Gesetz. Bestimmen Sie den äquivalenten Kurzschlussstrom (_Isc) aus transmuköser Spannung und Leitwert unter Anwendung des Ohmschen Gesetzes.
2. Verwenden Sie das Verdünnungspotential von NaCl zur Berechnung der relativen ionischen Selektivität (_PNa/_PCl) mit der Goldman-Hodgkin-Katz-Gleichung10.
3. Schätzen Sie die absolute Selektivität der Tight Junction für jedes Ion unter Verwendung der Kimizuka-Koketsu-Gleichung11.
4. Berechnen Sie PNa/PCl unter Verwendung der Goldman-Hodgkin-Katz-Gleichung aus Verdünnungspotentialen und bestimmen Sie die absoluten Permeabilitäten _PNa und _PCl aus der Kimizuka-Koketsu-Gleichung, wie von Yu et ^al.10 wie folgt beschrieben:
   
   
   
   
   wobei V: Verdünnungspotential (mV); α: Aktivitätsverhältnis. Die berechnete Aktivität von NaCl im HEPES-Puffer dividiert durch die berechnete Aktivität von NaCl im Verdünnungs-HEPES-Puffer (Für dieses Experiment wurde sie als 1,8966 berechnet); e: Mathematische Konstante, 2,71828; GM: Transmuköse Leitfähigkeit (mS/^cm2); F: Faraday-Konstante (96.485,3329 C/mol); R: Gaskonstante (8,314 J/mol K); T: Temperatur (310.15 K)

Ergebnisse

Die in diesem Papier gezeigten Ergebnisse sind Ergebnisse, die Teil eines größeren Projekts waren, das abgeschlossen wurde (siehe Referenz 4,23,24).

Die transepitheliale elektrische Leitfähigkeit des Dünndarms ist bei Cldn15-^/- Mäusen erniedrigt.
Der transmuköse Ausgangsleitwert (unter Kurzschlussbedingung...

Diskussion

In diesem Experiment wurden Ussing-Kammern verwendet, um die elektrischen Basisparameter und das Verdünnungspotential von NaCl im Dünndarm von Cldn15-/- und ^WT-Mäusen zu messen. Bei der Durchführung von Ussing-Kammerexperimenten ist es sehr wichtig, zu überprüfen, ob die in den Experimenten verwendete Membranvorbereitung praktikabel ist. Dies geschieht in der Regel durch Zugabe von Glukose oder dem Adenylatcyclase-Aktivator Forskolin und durch Sehen, ob ein ^angemessener Anstieg des

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
#3 polyethyl tubing	Hibiki		outer diameter 1.0 mm; inner diameter 0.5 mm
#7 polyethyl tubing	Hibiki		outer diameter 2.3 mm; inner diameter 1.3 mm
10 mL locking syringe	Terumo	SS-10LZ	Locking syringes are necessary to prevent the needle from dislodging during filling
19 g needle	Terumo	NN-1938R	Please use caution when working with needles and dispose of in sharps container
23 g needle	Terumo	NN-2332R	Please use caution when working with needles and dispose of in sharps container
5 mm punch	NA	NA	Use to punch holes in filter paper and parafilm
acupuncture needles	Seirin	NS	Used as dissection pins to pin tissue to dissection plate
Agar	Fujifilm Wako	010-15815
Alligator clips	NA	NA	Connects the electrode to the amplifier
CaCl2	Fujifilm Wako	038-00445
D(-)-Mannitol	Fujifilm Wako	133-00845	This is used to correct for the osmolality difference in dilution HEPES buffer
D(+)-Glucose	Fujifilm Wako	049-31165
Dissection kit			You will need, scissors and curved forceps
Dissection plates			We used 10 cm cell culture plates and covered with silicon rubber
DMSO	Sigma	472301-500ML	For making forskolin stock
Electrical recorder	TOA Electronics	PRR-5041	Other equivalent electrical recorders are available commercially
Epithelial voltage clamp amplifier	Nihon Kohden	CEZ9100	Other equivalent amplifiers are available commerically
filter paper, cut into squares	NA	NA	Punched with a 5 mm punch, used to hold intestinal preparation
fine forceps	Fast Gene	FG-B50476	For blunt dissection of the muscle layer
Forskolin	Alomone Labs	F-500	Make 10 mM stock in DMSO, final concentration will be 10 µM
HEPES	Sigma	H4034-1KG
Indomethacin	Sigma	I7338-5G	Make a 1 mM stock in 21 mM NaHCO3, final concentration is 10 µM
K2HPO4	Fujifilm Wako	164-04295
KCl	Fujifilm Wako	163-03545
KCl/calomel electrode	Asch Japan Co.	SCE-100
KH2PO4	Kanto chemical	32379-00
L(+)-Glutamine	Fujifilm Wako	074-00522
MgCl2	Fujifilm Wako	135-00165
Mixed Gas (95% O2/5% CO2)	Shizuoka Oxygen Company		Used for bubbling Ringer solution and chambers when using Ringer solution
NaCl	Fujifilm Wako	191-01665
NaCl electrode	NA	NA	Handmade electrodes which require concentrated NaCl and Silver wire
NaHCO3	Fujifilm Wako	191-01305
O2 Gas	Shizuoka Oxygen Company		Used for bubbling chambers when using HEPES buffer
parafilm	Bemis	PM-996	Used to help seal Ussing chambers
pH meter	DKK-TOA Corp	HM-305	HEPES buffer needs to be adjusted to pH 7.4 at 37 °C
pH meter electrode	DKK-TOA Corp	GST-5311C
silicone rubber	Shinetsu Chemical	KE-12	Used to fill dissection plates
silver wire			Used for making NaCl electrodes
Small jars w/ plastic lids	NA	NA	Use for NaCl electrodes
stereomicroscope	Zeiss	Stemi 305	A stereomicroscope allows you to see depth, so you can dissect the tissue more easily
Tris (Trizma base)	Sigma	T1503-1KG	Make a 1M solution to adjust pH of HEPES buffers
Ussing chambers	Sanki Kagaku Kougei		These chambers are custom made continuous perfusion Ussing chambers with a window diameter of 5 mm
Water pump and heating system	Tokyo Rikakikai Co. Ltd.	NTT-110