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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Das hier beschriebene Protokoll skizziert eine schnelle und effektive Methode zur Messung neutralisierender Antikörper gegen das SARS-CoV-2-Spike-Protein, indem die Fähigkeit rekonvaleszenter Serumproben bewertet wird, die Infektion durch ein verbessertes grün fluoreszierendes proteinmarkiertes vesikuläres Stomatitisvirus zu hemmen, das mit Spike-Glykoprotein pseudotypisiert ist.

Zusammenfassung

Da sich die COVID-19-Pandemie, die durch das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) verursacht wird, weiter entwickelt, ist es offensichtlich geworden, dass das Vorhandensein neutralisierender Antikörper gegen das Virus Schutz vor einer zukünftigen Infektion bieten kann. Da die Entwicklung und Translation wirksamer COVID-19-Impfstoffe mit beispielloser Geschwindigkeit voranschreitet, wird die Entwicklung schneller und wirksamer Methoden zur Messung neutralisierender Antikörper gegen SARS-CoV-2 immer wichtiger, um den langfristigen Schutz vor Infektionen sowohl für zuvor infizierte als auch für immunisierte Personen zu bestimmen. Dieser Artikel beschreibt ein Hochdurchsatzprotokoll unter Verwendung des vesikulären Stomatitisvirus (VSV), das mit dem SARS-CoV-2-Spike-Protein pseudotypisiert ist, um das Vorhandensein neutralisierender Antikörper im Rekonvaleszentenserum von Patienten zu messen, die sich kürzlich von COVID-19 erholt haben. Die Verwendung eines replizierenden pseudotypisierten Virus eliminiert die Notwendigkeit einer Containment-Level-3-Einrichtung, die für die SARS-CoV-2-Handhabung erforderlich ist, wodurch dieses Protokoll für praktisch jedes Containment-Level-2-Labor zugänglich ist. Durch die Verwendung eines 96-Well-Formats können viele Proben gleichzeitig mit einer kurzen Durchlaufzeit von 24 h ausgeführt werden.

Einleitung

Im Dezember 2019 wurde ein neuartiges Coronavirus identifiziert, das wir jetzt als SARS-CoV-2, den Erreger der Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19)1,kennen. SARS-CoV-2 ist ein Betacoronavirus aus der Familie der Coronaviridae. Diese umhüllten Viren bestehen aus einem großen RNA-Genom mit positivem Sinn und sind für Atemwegs- und Darminfektionen bei Mensch und Tier verantwortlich2. Bis Mai 2021 gab es weltweit mehr als 157 Millionen gemeldete Fälle von COVID-19 und mehr als 3,2 Millionen Todesfälle3. Die Entwicklung eines wirksamen Impfstoffs ist zum Hauptziel von Forschern auf der ganzen Welt geworden, wobei mindestens 77 präklinische Impfstoffe untersucht werden und 90 sich derzeit in klinischen Studien befinden4.

Coronaviren kodieren vier Strukturproteine, darunter das Spike-Protein (S), das Nukleokapsid (N), das Hüllprotein (E) und das Membranprotein (M). Der Eintritt von SARS-CoV-2 erfordert die Interaktion der Rezeptorbindungsdomäne (RBD) von S mit dem Wirtsrezeptor, dem humanen Angiotensin-Converting-Enzym 2 (hACE2) und der anschließenden Membranfusion nach proteolytischer Spaltung durch die zelluläre Serinprotease des Wirts, Transmembranprotease Serin 2 (TMPRSS2)5,6,7,8,9,10 . Humorale Immundominanz des S-Proteins von SARS-CoV wurde bereits berichtet und nun auch für SARS-CoV-2 gezeigt11,12,13. Tatsächlich wurden neutralisierende Antikörperreaktionen gegen S in Rekonvaleszenzserum von SARS-CoV-Patienten 24 Monate nach der Infektionnachgewiesen 14,was ihre entscheidende Rolle bei der langfristigen Immunantwort unterstreicht. Das S-Protein wurde als vielversprechendes Impfstoffziel identifiziert und ist damit zu einem Schlüsselbestandteil der meisten Impfstoffe in der Entwicklung15,16geworden.

Während der schnelle Nachweis neutralisierender Antikörper ein kritischer Aspekt der Impfstoffentwicklung ist, kann er auch Aufschluss über die Infektionsrate und die seroepidemiologische Überwachung in betroffenen Gebieten geben17. Ein replikationskompetentes VSV, das mit dem SARS-CoV-2 S-Glykoprotein anstelle des Wildtyp-VSV-Glykoproteins pseudotypisiert wurde, um die SARS-CoV-2-Infektion in Biosicherheitsstufe 2-Einstellungen zu untersuchen, wurde freundlicherweise von Whelan und Mitarbeitern18gespendet. VSV-exprimierender Spike (VSV-S) wird verwendet, um die neutralisierende Antikörperantwort gegen das SARS-CoV-2-Spike-Protein zu bestimmen. Da das hier verwendete VSV-S auch ein verbessertes grün fluoreszierendes Protein (eGFP) exprimiert, können eGFP-Herde innerhalb von 24 h nachgewiesen werden, um die Infektion zu quantifizieren, während die Plaquebildung 48 bis 72 h dauern kann. Hier ist ein einfaches und effektives Protokoll zusammengefasst, um die Fähigkeit von rekonvaleszentem Patientenserum zur Neutralisierung der VSV-S-eGFP-Infektion zu bestimmen. Diese Methode kann auch leicht angepasst werden, um andere potenzielle Therapeutika zu untersuchen, die darauf abzielen, die Wirt-Virus-Interaktion des SARS-CoV-2-S-Proteins zu stören.

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Protokoll

1. Plattierung von Zellen (Tag 1) zur Herstellung und Quantifizierung des SARS-CoV-2-Pseudovirus

  1. Vorbereitung für die Gewebekultur
    1. Warme 1x Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS); Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin/Streptomycin (optional); und 0,25% Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) bis 37 °C in einem Wasserbad für ca. 15 min.
    2. Desinfizieren Sie eine Gewebekulturhaube mit 70% Ethanol und legen Sie bei Bedarf Gewebekulturschalen, Pasteurpipetten und serologische Pipetten in die Gewebekulturhaube. Entfernen Sie PBS, DMEM und Trypsin aus dem Wasserbad und desinfizieren Sie es mit 70% Ethanol, bevor Sie es in die Gewebekulturhaube geben.
  2. Beschichtung und Wartung von Zellen
    1. Züchten Sie Vero E6-Zellen in DMEM (mit 10% FBS) in T75-Gewebekulturflaschen oder 15 cm Gewebekulturschalen in einem 37 °C-Inkubator mit 5%CO2. Passieren Sie die Zellen nach Bedarf, wenn die Zellen zu 80-90% konfluent sind.
    2. Waschen Sie die Zellen, indem Sie 10 ml 1x PBS zu jeder Schüssel geben und 4-5 Mal sanft schaukeln; Aspirieren Sie das PBS. Fügen Sie 3 ml Trypsin-EDTA zu jeder Schüssel hinzu, rocken Sie den Teller, um sicherzustellen, dass die gesamte Oberfläche bedeckt ist. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5%CO2 für ca. 5 min oder bis sich die Zellen abgelöst haben.
    3. Fügen Sie 7 ml DMEM (mit 10% FBS) hinzu, um das Trypsin zu deaktivieren, und resuspendieren Sie die Zellen, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren. Drehen Sie die Zellen herunter, um das Trypsin mit einer Tischzentrifuge bei 500 × g für 5 min zu entfernen, saugen Sie das Medium ab, ohne das Zellpellet zu stören, und resuspen sie die Zellen in 10 ml DMEM (mit 10% FBS). Wenn Zellen für zukünftige Experimente benötigt werden, geben Sie 1 ml in eine neue Schale mit 15 ml frischem DMEM (mit 10% FBS).
    4. Zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten Zellzähler oder Hämozytometer und geben Sie etwa 1 × 107 Zellen zu jeder 15 cm großen Platte und inkubieren Sie bei 37 ° C mit 5%CO2, bis sie zu 100% konfluent sind (1-2 Tage).

2. VSV-S-EGFP Pseudovirus-Präparation

  1. Infektion
    1. Infizieren Sie Zellen bei Vielzahl von Infektionen (MOI) 0,01 mit vsV-S-eGFP-Stammvirus in 12 ml serumfreiem DMEM für 1 h bei 37 °C mit 5%CO2 und schaukeln Gelegentlich die Platten. Ersetzen Sie das Inokulum durch frisches DMEM (mit 2% FBS und 20 mM HEPES, pH 7,7) und wechseln Sie zu einem Inkubator, der auf 34 °C mit 5%CO2eingestellt ist.
      HINWEIS: Für die Ausbreitung von VSV-S-eGFP in Zellkultur ist eine Temperatur von 34 °C erforderlich.
    2. Sammeln Sie Zellüberstände bei Beobachtung einer ausgedehnten zytopathischen Wirkung (CPE) und Zellablösung, etwa 48 h nach der Infektion. Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop, um die umfangreiche Expression von eGFP durch infizierte Zellen ab 24 Stunden nach der Infektion sichtbar zu machen.
  2. Sammlung
    1. Zentrifugieren Sie die Überstände mit einer Tischzentrifuge für 5 min bei 1.000 × g bei 4 °C, um die Zelltrümmer zu entfernen. Aliquotieren Sie den Überstand, um mehrere Gefrier-Tau-Zyklen zu vermeiden, und lagern Sie ihn bei -80 °C.

3. Titering des VSV-S-eGFP Pseudovirus

  1. Serielle Verdünnung zur Bestimmung des Virustiters
    1. Vero E6-Zellen auf 6-Well-Platten mit einer Aussaatdichte von 6 × 105 Zellen pro Bohrung in DMEM (mit 10% FBS) und inkubieren über Nacht bei 37 °C mit 5%CO2.
      HINWEIS: Vero-Zellen, die TMPRSS2 und hACE2 überexprimieren, können ebenfalls verwendet werden.
    2. Richten Sie eine 10-fache serielle Verdünnungsserie des VSV-S-eGFP-Virus in kaltem serumfreiem DMEM ein, indem Sie 900 μL Medien in sieben Mikrozentrifugenröhrchen geben. Etikettenröhrchen von 1 bis 7. 100 μL des Virusmaterials in das erste Röhrchen geben und kurz wirbeln. 100 μL verdünntes Virus von Röhrchen 1 nach Röhre 2 übertragen und kurz wirbeln; weiter bis zur Röhre 7.
    3. Aspirieren Sie das Medium aus allen Vertiefungen der 6-Well-Platte, die Vero E6-Zellen enthält, und ersetzen Sie durch 500 μL Verdünnungen 10-2 bis 10-7. Die Platten für 45 min bei 37 °C mit 5%CO2inkubieren, alle 15 min vorsichtig schaukeln.
    4. Das Inokulum aspiratieren und durch Overlay ersetzen, das eine 1:1-Mischung aus 2x DMEM und 6% Carboxymethylcellulose (CMC) enthält, Endkonzentration von 3% CMC, ergänzt mit 10% FBS; Bei 34 °C mit 5%CO2 für 48 h inkubieren.
      HINWEIS: Erwärmen Sie die Overlay-Mischung in einem 37 °C warmen Wasserbad für 15 min während des Infektionsschritts. Anstelle von CMC kann eine 1:1 Mischung aus 1% Agarose mit 2x DMEM, ergänzt mit 10% FBS, verwendet werden. Um mit Agarose zu überziehen, 1% Agarose (indH2O)kochen und mit kaltem 2x DMEM mischen. Stellen Sie sicher, dass die Mischung eine geeignete Temperatur aufweist, bevor Sie der Zellmonoschicht (ca. 37-40 °C) hinzufügen. Wenn Agarose für das Overlay verwendet wird, müssen die Zellen durch Inkubation in 2 ml Methanol: Essigsäure für mindestens eine Stunde vor der Färbung fixiert werden.
  2. Färben und Berechnen des Virustiters
    1. Visualisieren Sie Plaques durch Färbung mit Kristallviolett oder direkte Visualisierung von eGFP unter einem Fluoreszenzmikroskop.
    2. Um die Platten zu färben, aspirieren Sie das Overlay, waschen Sie es einmal mit PBS und geben Sie dann 2 ml 0,1% Kristallviolett (in 80% Methanol und dH2O) zu jeder Vertiefung hinzu. Vor dem Entfärben ca. 20 min bei Raumtemperatur auf eine Plattenwippe legen. Entfernen Sie das Kristallviolett und waschen Sie sie zweimal vorsichtig mit dH2O oder PBS.
      HINWEIS: Wasch- und Färbeschritte sollten sanft durchgeführt werden, indem langsam zur Seite jedes Bohrlochs pipettiert wird, um sicherzustellen, dass die Zellmonoschicht während des gesamten Vorgangs intakt bleibt.
    3. Lassen Sie die Platten mindestens 1 h trocknen, bevor Sie die Plaques zählen. Stellen Sie sicher, dass Plaque-Zählungen aus Brunnen mit 20 bis 200 Plaques erhalten werden. Um den Titer des Virus in plaquebildenden Einheiten (PFU) pro ml zu berechnen, multiplizieren Sie den Verdünnungsfaktor des gezählten Brunnens mit dem Infektionsvolumen und dividieren Sie diese Zahl von den in der jeweiligen Vertiefung vorhandenen Plaques.
      figure-protocol-6643

4. Plating-Zellen (Tag 1) zur Messung der Neutralisation des SARS-CoV-2-Pseudovirus durch kommerziell erhältliche Antikörper und Rekonvaleszentenserum

  1. Vorbereitung für die Gewebekultur
    1. Bereiten Sie die Medium- und Gewebekulturhaube wie in Abschnitt 1 beschrieben vor. Bereiten Sie außerdem die erforderliche Anzahl von 96 Bohrlochplatten vor, um mindestens 2 Replikate pro Probe (d. h. 1 Platte pro 6 Proben) aufzunehmen. Fügen Sie zusätzliche Replikate hinzu, wenn das Probenvolumen dies zulässt.
  2. Beschichtung und Wartung von Zellen
    1. Züchten und pflegen Sie Vero E6-Zellen wie in Abschnitt 1 beschrieben. Bereiten Sie mindestens 10 ml Zellsuspension pro 96-Well-Platte in einer Konzentration von 2 × 105 Zellen pro ml vor (Platte 1,5 × 105 Zellen pro ml für Assays, die nach 48 h durchgeführt werden, falls erforderlich). 100 μL Zellsuspension mit einer Mehrkanalpipette in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte geben und 24 h bei 37 °C mit 5%CO2inkubieren.
      HINWEIS: Mischen Sie die Zellsuspension gut und rocken Sie jede Platte vorsichtig in alle Richtungen, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten.

5. Antikörper- oder Serumverdünnungen und Infektionen (Tag 2)

HINWEIS: Dieses Protokoll kann angewendet werden, um die Neutralisation von VSV-S-eGFP sowohl durch kommerziell erhältliche Antikörper und Patientenserum als auch durch Serum, das von Tieren für präklinische Impfstoffentwicklungsstudien gewonnen wurde, zu messen. *Beachten Sie die zusätzlichen Schritte, die bei der Handhabung von Serumproben von Patienten/Tieren aufgeführt sind.

  1. Serielle Verdünnungsserie
    1. Vor dem Verdünnen der Serumproben wird jede Probe in einem 56 °C warmen Wasserbad für 30 min mit Hitze inaktiviert, um das Komplement zu inaktivieren. Sicherstellen, dass bei der Handhabung von Patientenproben die erforderlichen Sicherheitsvorkehrungen getroffen werden; Öffnen Sie nur Probenbehälter, wenn Sie sich in der Gewebekulturhaube befinden, und stellen Sie sicher, dass eine geeignete persönliche Schutzausrüstung der Einschließungsstufe 2 getragen wird.
    2. Richten Sie die Verdünnungsreihe in einer leeren 96-Well-Platte (Platte 1) ein.
    3. Beginnen Sie alle Verdünnungen in Reihe A der 96-Well-Platte in 80 μL. *Beginnen Sie bei Patientenproben die Verdünnungsserie bei 1 zu 10, indem Sie 8 μL Serum in 72 μL serumfreies DMEM (mit 1% Penicillin/Streptomycin) geben.
      HINWEIS: Die Konzentration des verwendeten neutralisierenden Antikörpers hängt von der vom Hersteller vorhergesagten Aktivität ab. Beginnen Sie für den hier verwendeten neutralisierenden Antikörper SARS-CoV-2 Spike (siehe Materialtabelle)mit 5 μg/ml, um eine Neutralisation von mindestens 50% zu beobachten.
    4. 40 μL serumfreies DMEM (mit 1% Penicillin/Streptomycin) in die Reihen B bis G und 80 μL in Reihe H geben. Fügen Sie kein Virus zur Zeile H hinzu, da es als reine Zellkontrolle dient.
    5. Mischen und übertragen Sie mit einer 12-Well-Mehrkanalpipette 40 μL verdünntes Serum oder Antikörper von Reihe A in Reihe B. Mischen und wiederholen Sie bis Zeile F, verwerfen Sie 40 μL aus Reihe F. Fügen Sie der Zeile G kein Serum hinzu, da sie die reine Viruskontrollzeile darstellt.
  2. Infektion und Überlagerung
    1. Bereiten Sie eine geeignete Menge verdünntes VSV-S-eGFP vor, um jede Vertiefung bei MOI 0,05 (oder 2000 pfu) zu behandeln. (Wenn Sie diese Berechnung durchführen, denken Sie daran, dass nur 60 μL des gesamten 80 μL-Volumens auf die Zellen übertragen werden; Stellen Sie daher sicher, dass Sie das Volumen des Virus mit 1,33 multiplizieren, um 2000 pFU aufrechtzuerhalten).
      HINWEIS: Da VSV-S-eGFP temperaturempfindlich ist, stellen Sie sicher, dass die Virusbestände bei Nichtgebrauch auf Eis bleiben, und vermeiden Sie mehrere Gefrier-Tau-Zyklen, da sich die Titer nach wiederholtem Einfrieren unterscheiden.
    2. 40 μL verdünntes Virus in jede Vertiefung in den Reihen A bis G von Platte 1 geben und durch Pipettieren 4-5 mal nach oben und unten mischen. Die Platte für 1 h bei 37 °C mit 5%CO2 inkubieren.
    3. Entfernen Sie die Platte, die Zellen enthält, aus dem Inkubator (Platte 2) und saugen Sie das Medium vorsichtig aus allen Vertiefungen ab. Übertragen Sie 60 μL Antikörper/Virus-Gemisch von Platte 1 auf Platte 2 und inkubieren Sie für 1 h bei 37 °C mit 5%CO2, wobei die Platte alle 20 min geschaukelt wird.
    4. Füllen Sie jede Vertiefung mit 140 μL Overlay, das CMC in DMEM enthält, für eine Endkonzentration von 3% CMC (mit 10% FBS und 1% Penicillin/Streptomycin). Legen Sie Platte 2 vor der Bildgebung ca. 24 h in einen auf 34 °C eingestellten Inkubator mit5% CO2.
      HINWEIS: Erwärmen Sie die Overlay-Mischung in einem 37 °C warmen Wasserbad für 15 min während des Infektionsschritts.

6. Bildgebung und Quantifizierung (Tag 3)

  1. Bildplatten mit einem automatisierten Fluoreszenz-Imager (unter Verwendung eines Fluorescein-Isothiocyanat-Filters (FITC) oder eines alternativen Filters mit einer Anregungswellenlänge von 488 nm). Quantifizieren Sie die Virusinfektion, indem Sie ein Protokoll erstellen, das automatisch einzelne eGFP-Herde identifiziert und zählt. Wenn keine automatische Zählfunktion verfügbar ist, verwenden Sie die ImageJ-Software, um die Anzahl der eGFP-Brennpunkte zu quantifizieren.

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Ergebnisse

Dieses Protokoll beschreibt eine schnelle und effektive Methode zum Nachweis neutralisierender Antikörper gegen das SARS-CoV-2 S-Protein durch Hemmung der VSV-S-eGFP-Pseudovirusinfektion (quantifizierbar durch Verlust von eGFP-Herden nachgewiesen). Eine schematische Darstellung des Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt. Es wird empfohlen, bei jeder Durchführung des Assays einen kommerziell erhältlichen Antikörper als Positivkontrolle zu verwenden, um die Konsistenz des Assays sicherz...

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Diskussion

Die hier beschriebene Methode kann je nach Bedarf an unterschiedliche Laborumgebungen und Ressourcen angepasst werden. Wichtig ist, dass die Haupteinschränkung dieses Protokolls die Notwendigkeit eines Containment-Level-2-Raums und einer Gewebekulturhaube ist. Die Anwendung eines replizierenden RNA-Virus, das mit dem SARS-CoV-2-Spike pseudotypisiert ist, wie VSV-S-eGFP, ist eine beeindruckende Alternative zum SARS-CoV-2-Virus, das einen Arbeitsbereich der Eindämmungsstufe 3 erfordert, aber für einige Gruppen eine Eins...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen im Zusammenhang mit dieser Publikation.

Danksagungen

Wir möchten dem Whelan-Labor für die großzügige Bereitstellung des in diesem Protokoll verwendeten VSV-S-eGFP-Virus danken (beschrieben in Case et al. 2020). Wir danken auch Dr. Bill Cameron und Dr. Juthaporn Cowan (und seinem Team) für die Sammlung der Blutproben des Patienten (REB-Protokoll-ID 20200371-01H). Die Autoren geben bekannt, dass sie die folgende finanzielle Unterstützung für die Forschung, Autorschaft und/oder Veröffentlichung dieses Artikels erhalten haben: Diese Arbeit wurde durch die großzügige Unterstützung der Ottawa Hospital Foundation und ein Stipendium der Canadian Institutes of Health Research (#448323) und einen Fast Grant der Thistledown Foundation for COVID-19 Science für C.S.I. T.R.J. finanziert wird durch ein Ontario Graduate Scholarship und cluster Mitacs Fellowship. JP wird durch ein Cluster-Mitacs-Stipendium finanziert. T.A. wird durch ein CIHR Banting Fellowship finanziert. Wir möchten uns auch bei allen Personen bedanken, die teilgenommen und ihre Blutproben für diese Studie gespendet haben.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% trypsin-EDTA (Gibco)Fisher scientificLS25200114
ArrayScan VTI HCSThermo Fisher ScientificAutomated fluorescent imager
carboxymethyl celluloseSigmaC5678
Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco)Fisher scientific10-013-CV
Dulbecco's modified Eagle's medium (Powder) (Gibco)Thermo Fisher Scientific12-800-017
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)Fisher scientific21-031-CV
HEPESFisher scientificBP-310-500
IgG Isotype Control (mouse)Thermo Fisher Scientific31903
Penicillin/streptomycinThermo Fisher Scientific15070063
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse MabSinoBiological40592-MM57
Vero E6 cellsATCC CRL-1586

Referenzen

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