Megakaryozytenkultur in 3D-Methylcellulose-basiertem Hydrogel zur Verbesserung der Zellreifung und Untersuchung der Auswirkungen von Steifigkeit und Einschluss

Zusammenfassung

Es ist jetzt anerkannt, dass die dreidimensionale Umgebung von Zellen eine wichtige Rolle bei ihrem Verhalten, ihrer Reifung und / oder Differenzierung spielen kann. Dieses Protokoll beschreibt ein dreidimensionales Zellkulturmodell, das entwickelt wurde, um die Auswirkungen von physikalischer Eindämmung und mechanischen Einschränkungen auf Megakaryozyten zu untersuchen.

Zusammenfassung

Die 3D-Umgebung, die sowohl zu Einschluss als auch zu mechanischen Einschränkungen führt, wird zunehmend als wichtige Determinante des Zellverhaltens erkannt. Die 3D-Kultur wurde daher entwickelt, um sich der In-vivo-Situation besser zu nähern. Megakaryozyten unterscheiden sich von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) im Knochenmark (BM). Der BM ist eines der weichsten Gewebe des Körpers, das im Knochen eingeschlossen ist. Da der Knochen auf der Zellskala schlecht dehnbar ist, werden Megakaryozyten gleichzeitig einer schwachen Steifigkeit und einer hohen Einschließung ausgesetzt. Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Rückgewinnung von mouse lineage negative (Lin-) HSPCs durch immunmagnetische Sortierung und deren Differenzierung in reife Megakaryozyten in einem 3D-Medium aus Methylcellulose dar. Methylcellulose ist gegenüber Megakaryozyten nicht reaktiv und ihre Steifigkeit kann an die eines normalen Knochenmarks angepasst oder erhöht werden, um ein pathologisches fibrotisches Knochenmark nachzuahmen. Der Prozess zur Gewinnung der Megakaryozyten für weitere Zellanalysen ist ebenfalls im Protokoll detailliert beschrieben. Obwohl die Proplatelet-Erweiterung innerhalb des 3D-Milieus verhindert wird, wird im Folgenden beschrieben, wie die Megakaryozyten in flüssigem Medium resuspendiert und ihre Fähigkeit, Proplatelets zu verlängern, quantifiziert werden können. Megakaryozyten, die in 3D-Hydrogel gezüchtet werden, haben eine höhere Fähigkeit, Proplatelette zu bilden, verglichen mit denen, die in einem flüssigen Milieu gezüchtet werden. Diese 3D-Kultur ermöglicht es, i) Vorläufer in Richtung Megakaryozyten zu differenzieren, die einen höheren Reifezustand erreichen, ii) Phänotypen zu rekapitulieren, die in vivo beobachtet werden können, aber in klassischen flüssigen Kulturen unbemerkt bleiben, und iii) Transduktionswege zu untersuchen, die durch die mechanischen Hinweise einer 3D-Umgebung induziert werden.

Einleitung

Zellen im Körper erleben eine komplexe 3D-Mikroumgebung und sind dem Zusammenspiel zwischen chemischen und mechanophysikalischen Hinweisen ausgesetzt, einschließlich Steifigkeit aus dem Gewebe und Einschluss aufgrund benachbarter Zellen und der umgebenden Matrix ^1,2,3. Die Bedeutung von Steifheit und Einschluss für das Zellverhalten wurde erst in den letzten Jahrzehnten erkannt. Im Jahr 2006 hob die bahnbrechende Arbeit von Engler et al. ⁴ die Bedeutung der mechanischen Umgebung für die Zelldifferenzierung hervor. Die Autoren zeigten, dass die Variation der Zellsubstratsteifigkeit zur Orientierung von Stammzellen auf verschiedene Differenzierungslinien führte. Seitdem wird der Einfluss mechanischer Hinweise auf das Schicksal und Verhalten von Zellen zunehmend erkannt unduntersucht. Obwohl es eines der weichsten Gewebe des Organismus ist, hat das Knochenmark eine 3D-Strukturorganisation, die im Knochen eingeschlossen ist. Die Marksteifigkeit, obwohl technisch schwierig, genau zu messen, wird auf 15 bis 300 Pa ^{geschätzt 5,6}. Innerhalb des Stromas sind die Zellen eng aufeinander beschränkt. Darüber hinaus wandern die meisten von ihnen in Richtung der Sinusoidgefäße, um in den Blutkreislauf einzudringen. Diese Bedingungen erzeugen zusätzliche mechanische Einschränkungen für benachbarte Zellen, die sich an diese Kräfte anpassen müssen. Mechanische Hinweise stellen einen wichtigen Parameter dar, dessen Konsequenzen für die Megakaryozytendifferenzierung und Proplatletbildung erst kürzlich erforscht wurden. Obwohl Megakaryozyten in vitro in traditioneller Flüssigkultur differenzieren können, erreichen sie nicht den in vivobeobachteten Reifegrad, was zum Teil auf das Fehlen der mechanischen Hinweise aus der 3D-Umgebung zurückzuführen ist ⁷. Wachsende Vorläufer, die in Hydrogel eingebettet sind, bringen mechanische 3D-Hinweise, die im flüssigen Milieu fehlen.

Hydrogele werden seit mehreren Jahrzehnten im hämatologischen Bereich häufig eingesetzt, insbesondere um Zellen in koloniebildenden Assays zur Quantifizierung hämatopoetischer Vorläufer zu züchten. Solche Hydrogele wurden jedoch selten verwendet, um den biologischen Einfluss der mechanischen 3D-Umgebung auf die Reifung und Differenzierung hämatopoetischer Zellen zu untersuchen. In den letzten Jahren hat unser Labor ein 3D-Kulturmodell mit einem Hydrogel ⁸auf Methylcellulosebasis entwickelt. Dieses nicht reaktive physikalische Gel ist ein nützliches Werkzeug, um die physikalischen Einschränkungen der nativen Megakaryozytenumgebung nachzuahmen. Es wird aus Cellulose durch Ersatz von Hydroxylresten (-OH) durchMethoxidgruppen (-OCH3) gewonnen. Sowohl der Grad der Methylsubstitution als auch die Methylcellulosekonzentration bestimmen die Hydrogelsteifigkeit nach der Jellifikation. Während der Entwicklungsphase dieser Technik wurde gezeigt, dass ein Elastizitätsmodul im Bereich von 30 bis 60 Pa die optimale Gelsteifigkeit für das Megakaryozytenwachstum ^{ist 9}.

Das folgende Protokoll beschreibt eine Methode zur Züchtung von megakaryozytären Vorläuferzellen der Maus in einem 3D-Methylcellulose-Hydrogel. Es wurde bereits gezeigt, dass diese Hydrogelkultur im Vergleich zur Standardflüssigkeitskultur den Grad der Megakaryozytenpolyploidisierung erhöht, die Reifung und intrazelluläre Organisation verbessert und die Fähigkeit von Megakaryozyten erhöht, Proplatele zu verlängern, sobald sie in einem flüssigen Medium resuspendiert ^{sind 9}. Dieses Manuskript beschreibt detailliert das Protokoll für die Isolierung von Lin−-Zellen aus dem Knochenmark der Maus und deren Einbettung in ein Methylcellulose-Hydrogel für die 3D-Kultur sowie die Quantifizierung ihrer Fähigkeit, Proplatelets herzustellen und die Rückgewinnung der Zellen für weitere Analysen.

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Protokoll

Alle Versuche sollten in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren durchgeführt werden. Alle im Video gezeigten Protokolle wurden in strikter Übereinstimmung mit dem europäischen Recht und den Empfehlungen des Prüfungsausschusses des Etablissement Français du Sang (EFS) durchgeführt. Eine erste Version dieses Protokolls wurde ursprünglich 2018 in Methods in Molecular Biology ⁸veröffentlicht.

HINWEIS: Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung des gesamten Prozesses. Dieser Prozess umfasst 1) Knochendissektion, Knochenmarkentnahme und mechanische Isolierung von Knochenmarkzellen, 2) magnetische Sortierung von Lineage-negativen (Lin-) Zellen, 3) Aussaat in flüssigem oder Methylcellulose-Hydrogel und 4) Resuspension von Megakaryozyten, die in 3D-Gel gezüchtet wurden, um die Propanletbildung in flüssigem Medium zu untersuchen.

1. Knochenentnahme an erwachsenen Mäusen

HINWEIS: In diesem Abschnitt ist es wichtig, die mikrobielle Kontamination zu minimieren.

1. Bereiten Sie ein 15-ml-Röhrchen für die Knochenentnahme mit Dulbeccos Modified Eagle's Medium (DMEM) vor, das 1% des Gesamtvolumens der Penicillin-Streptomycin-Glutamin (PSG) -Antibiotikamischung (Penicillin 10000 U / ml, Streptomycin 100000 μg / ml und L-Glutamin 29,2 mg / ml) enthält.
   HINWEIS: Wenn alle verwendeten Mäuse den gleichen Genotyp haben, poolen Sie alle Knochen in derselben Röhre, die 1 ml DMEM - PSG 1% pro Anzahl von Mäusen enthält. Antibiotika sind wichtig, um eine mögliche Bakterienvermehrung während der Knochenprobe zu verhindern.
2. Füllen Sie ein 50-ml-Röhrchen mit Ethanol zu 70% zur Knochendesinfektion und zu einem weiteren zum Spülen von Instrumenten während des Eingriffs. Verwenden Sie sterilisierte Dissektionsinstrumente.
3. Betäuben Sie die Mäuse mit Isofluran-Inhalation (4%) und gehen Sie schnell zur zervikalen Luxation über, um die Mäuse einzuschläfern. Tauchen Sie den Körper schnell in 70% Ethanol ein, um mikrobielle Kontamination zu desinfizieren und zu vermeiden.
4. Sezieren Sie schnell die Tibien und Femuren.
5. Schneiden Sie mit einem Skalpell die Epiphysen des Knöchelseitenendes für die Tibia und des Hüftseitenendes für den Femur weg.
6. Tauchen Sie die Knochen für eine Sekunde in 70% Ethanol, bevor Sie sie in DMEM-Medium mit 1% PSG tauchen.

2. Knochenmarkdissoziation und Lin-Zell-Isolierung

HINWEIS: Dieser Teil des Protokolls wird unter einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt. Für eine Kultur sind alle Vertiefungen Teil desselben Experiments und können nicht als unabhängige biologische Replikate betrachtet werden. Die Zellen aller Mäuse werden gebündelt, um die Homogenität aller Vertiefungen zu gewährleisten und sie miteinander vergleichen zu können, während mögliche interindividuelle Variabilität eliminiert wird. Für unabhängige biologische Replikate muss die Kultur wiederholt werden.

1. Legen Sie die Knochen in eine Petrischale und heben Sie sie zweimal in steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) von Dulbecco auf, um potenzielle Verunreinigungen zu entfernen.
2. Bereiten Sie DMEM - 1% PSG in einem 50 ml Röhrchen vor.
   HINWEIS: Geben Sie 2 ml DMEM - 1% PSG pro Maus an, die für das Experiment verwendet werden.
3. Füllen Sie eine 5 ml Spritze, die mit einer 21-Gauge-Nadel ausgestattet ist, mit DMEM - 1% PSG.
4. Halten Sie den Knochen mit einer Pinzette fest und führen Sie nur die Abschrägung der Nadel am Ende der Knieseite ein.
   HINWEIS: Die knieseitige Epiphyse sollte von der Dissektion intakt bleiben und eine kleine Höhle in ihrer Mitte hinterlassen, durch die die Nadel eingeführt werden kann. Die verbleibende Epiphyse behält den Knochen bei, der während der Spülung an der Nadel befestigt ist. Achten Sie darauf, nicht mehr als die Fase in den Knochen einzuführen, da dies das Mark zerquetschen und beschädigen könnte.
5. Drücken Sie schnell auf den Spritzenkolben, um das Mark in ein 50-ml-Rohr zu spülen.
   HINWEIS: Um Spritzer zu vermeiden und die Knochenmarkspülung und -befreiung zu erleichtern, legen Sie das freie Ende des Knochens an die Röhrenwand, eingetaucht in DMEM - 1% PSG. In der Praxis reicht im Allgemeinen ein Volumen zwischen 500 μL und 1 ml aus, um das Mark aus dem Knochen zu entfernen. Wenn das Mark vollständig ausgestoßen wurde, ist der Knochen weiß geworden. Falls das Mark nicht vollständig aus der Diaphyse ausgestoßen wurde, wie durch eine verbleibende rote Farbe beurteilt, ist es möglich, die Spülung mit frischem Medium zu wiederholen.
6. Wiederholen Sie die Schritte 2.4. und 2.5. für alle Knochen die 5 ml Spritze bei Bedarf mit DMEM - 1% PSG nachfüllen.
7. Verwenden Sie die gleiche 5-ml-Spritze mit der 21-Gauge-Nadel, um das Gesamtvolumen des Mediums, das gespültes Mark enthält, in runde 10-ml-Röhrchen zu übertragen.
   HINWEIS: Es ist nicht unbedingt notwendig, zu einem 10-ml-Rohr mit rundem Boden zu wechseln, aber es erleichtert das Fortfahren mit den folgenden Dissoziationsschritten. Zögern Sie nicht, Spritze und/oder Nadel zu wechseln, wenn das Risiko einer Kontamination vermutet wird.
8. Fahren Sie mit der Zelldissoziation fort, indem Sie die Medium- und Markzellen nacheinander zweimal durch eine 21-Gauge-Nadel, dreimal durch eine 23-Gauge-Nadel und einmal durch eine 25-Gauge-Nadel absaugen und ausstoßen.
   HINWEIS: Vermeiden Sie Luftblasen, da dies für die Zellen schädlich sein kann.
9. Übertragen Sie die Suspension in 15 ml Rohre.
10. Messen Sie die Zellzahl und überprüfen Sie die Lebensfähigkeit mit einem automatisierten Zellzähler oder einer Zellkammer für die manuelle Zählung in Gegenwart von Trypanblau, um tote Zellen auszuschließen.
11. Zentrifugieren Sie die 15 mL Röhrchen für 7 min bei 300 x g. Mit einer 1 ml Transferpipette vorsichtig auspipetten und den Überstand entsorgen.
12. Isolieren Sie Stamm- und Vorläuferzellen durch negative immunmagnetische Sortierung mit einem hämatopoetischen Zellisolationskit der Maus.
    HINWEIS: Ziel dieser Zellsortierung ist es, die Zellen zu gewinnen, die für alle Selektionsantikörper negativ sind (CD5, CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119, 7-4) und somit die Zellen zu eliminieren, die bereits in einer anderen Differenzierungslinie als der megakaryozytären bestehen.
13. Gemäß den Anweisungen des Kits wird das Zellpellet in frisch zubereitetem M-Medium (PBS mit 2% des Endvolumens des fetalen Rinderserums (FBS), EDTA 1 mM) auf eine Konzentration von 1 × 10⁸ Zellen/ml resuspendiert und die Suspension in 5 mL Polystyrolröhrchen mit rundem Boden auf ein maximales Volumen von 2 ml verteilt.
14. Zu den Polystyrolröhrchen geben: normales Rattenserum in einer Konzentration von 50 μL/ml sowie das biotinylierte Antikörper-Gemisch (CD5, CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119, 7-4) in einer Konzentration von 50 μL Mix pro ml und homogenisieren Sie durch vorsichtiges Flicken der Röhrchen.
    HINWEIS: Diese Antikörper binden an Zellen, die sich bereits in einem Differenzierungsweg befinden, mit Ausnahme des megakaryozytären Signalwegs.
15. Die Röhren 15 Min auf Eis inkubieren.
16. Mit Streptavidin beschichtete Magnetperlen in einer Konzentration von 75 μL/ml zugeben und durch vorsichtiges Streichen der Röhrchen homogenisieren.
17. 10 Min. erneut auf Eis inkubieren.
18. Stellen Sie bei Bedarf mit M-Medium auf ein Endvolumen von 2,5 ml pro Röhrchen ein.
19. Homogenisieren Sie die Suspension, indem Sie das Röhrchen vorsichtig streichen, kurz bevor Sie sie ohne ihre Kappen in einen Magneten legen und drei Minuten warten.
    HINWEIS: Die Zellen, die bereits in einen Differenzierungsweg eingebunden und mit magnetischen Kügelchen beschichtet sind, werden an der Wand der Röhre im Inneren des Magneten zurückgehalten.
20. Invertieren Sie Magnet und Rohr, um den Rohrinhalt in ein neues 5-ml-Polystyrolrohr mit rundem Boden zu übertragen.
    HINWEIS: Nehmen Sie das Rohr für die Übertragung nicht aus dem Magneten; Dies geschieht, indem der Magnet mit dem Rohr noch invertiert wird. Verwenden Sie eine gleichmäßige Bewegung und schütteln Sie den Schlauch nicht.
21. Verwerfen Sie das ursprüngliche Röhrchen, das unerwünschte magnetisch markierte Zellen enthält, und legen Sie das neue ohne Kappe für weitere drei Minuten in den Magneten.
22. In Schritt 2.20 werden die isolierten Lin−-Zellen in ein neues 15-ml-Röhrchen überführt.
    HINWEIS: Wenn für die vorherigen Schritte mehrere 5-ml-Polystyrolröhrchen verwendet wurden, poolen Sie alle Zellen in derselben 15-ml-Röhre. Die nach der Zellsortierung gewonnenen Zellen sind hämatopoetische Stammzellen und Vorläuferzellen. Das Vorhandensein von Thrombopoietin (TPO), dem wichtigsten physiologischen Regulator der Megakaryopoese ^10,wird die Zelldifferenzierung in Richtung der megakaryozytären Zelllinie lenken.
23. Messen Sie die Anzahl und Lebensfähigkeit der Lin−-Zellen wie in Schritt 2.10.
24. Berechnen Sie das erforderliche Volumen der Zellsuspension zur Zentrifuge, um 1 x 10⁶ lebensfähige Zellen x Well Number zu haben, Well Number ist die Anzahl der Wells, die pro Bedingung ausgesät werden sollen.
25. Bereiten Sie ein Röhrchen pro Bedingung mit dem entsprechenden Volumen der Zellsuspension und Zentrifuge bei 300 x g für 7 min vor.
26. Bei flüssigen Kulturen verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Zellpellet in einem vollständigen Kulturmedium (DMEM, PSG 1% des Endvolumens, FBS 10% des Endvolumens, Hirudin 100 U/mL, TPO 50 ng/ml), um die Endkonzentration von 2 × 10⁶ lebensfähigen Zellen/ml (entspricht 1 × 10⁶ Zellen pro 500 μL Well) zu erreichen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C unter 5% CO2. (= Tag 0 der Kultur)
    HINWEIS: Siehe den nächsten Absatz für Methylcellulosekulturen Verwenden Sie beispielsweise zur Herstellung eines vollständigen Kulturmediums für eine Vertiefung 435 μL DMEM, 50 μL 100% FBS für 10% Endwert, 5 μL 100% PSG für 1% Final, 5 μL 10 000 U/ml für 100 U/ml end und 5 μL 5 μg/ml TPO für 50 ng/ml end. Typischerweise werden 4-Well- oder 24-Well-Kulturplatten verwendet, da ihr Bohrlochdurchmesser gut zu den 500 μL passt, die pro Vertiefung benötigt werden.

3. Zelleinbettung in Methylcellulose-Hydrogel

HINWEIS: Bitte beachten Sie, dass das folgende Protokoll die Methode beschreibt, um eine einzelne Hydrogelzellkultur zu erhalten, die sich an die Anzahl der benötigten Vertiefungen anpasst.

1. 1 mL Aliquots aus 3% iger Methylcellulose-Stammlösung bei Raumtemperatur auftauen. Bereiten Sie ein separates zusätzliches Aliquot Methylcellulose für die Spritzenbeschichtung vor.
   ANMERKUNG: Bei einer Konzentration von 3 % bleibt Methylcellulose bei Raumtemperatur (20-25 °C) flüssig.
2. Beschichten Sie eine 1 mL Luer Lock Spritze, die mit einer 18-Gauge-Nadel ausgestattet ist, mit Methylcellulose, indem Sie 1 ml Methylcellulose aus dem zusätzlichen Aliquot ziehen. Die Methylcellulose vollständig ausstoßen.
   HINWEIS: Dieser Beschichtungsschritt stellt sicher, dass das volumen der in Schritt 3.3 gesammelten Methylcellulose exakt ist.
3. Ziehen Sie mit der gleichen Spritze und Nadel, aber mit einem neuen Methylcellulose-Aliquot, das entsprechende Volumen methylcellulose (Abbildung 2A).
   HINWEIS: Um eine Endkonzentration von 2% Methylcellulose in einem Endvolumen von 500 μL pro Bohrung zu erreichen, sind 333 μL 3% Methylcellulose erforderlich.
4. Entfernen Sie vorsichtig die Nadel. Schrauben Sie mit einer sterilisierten Pinzette einen Luer-Lock-Anschluss an das Ende der Spritze (Abbildung 2B-C).
5. Befestigen Sie eine zweite, unbeschichtete 1 mL Luer Lock-Spritze am Luer Lock-Steckverbinder, um die beiden Spritzen miteinander zu verbinden (Abbildung 2D).
   HINWEIS: Es ist nicht erforderlich, diese zweite Spritze zu beschichten.
6. Verteilen Sie das Methylcellulosevolumen gleichmäßig auf die beiden Spritzen (Abbildung 2E) und legen Sie sie bis Schritt 3.11 beiseite.
7. Das konzentrierte DMEM-Kulturmedium wird so hergestellt, dass im endgültigen Methylcellulosevolumen (Schritt 3.11) für jede Verbindung eine Konzentration erhalten wird, die mit der des flüssigen Kulturmediums identisch ist (PSG 1% des Endvolumens, FBS 10% des Endvolumens, Hirudin 100 U/mL, TPO 50 ng/mL).
   1. Bereiten Sie 167 μL konzentriertes Kulturmedium pro Endvertiefung von 1 × 10⁶ Zellen vor. Dieses Mediumvolumen wird so berechnet, dass eine endgültige Methylcellulosekonzentration von 2% erreicht wird. Das Gesamtvolumen im Bohrloch wird 500 μL betragen (167 μL Zellsuspension in konzentriertem Kulturmedium + 333 μL Methylcellulose) und alle Komponenten werden eine Konzentration aufweisen, die mit der in flüssigen Vertiefungen identisch ist.
   2. Um beispielsweise ein komplettes Kulturmedium für eine Vertiefung vorzubereiten, verwenden Sie 102 μL DMEM, 50 μL 100% FBS für 10% Final, 5 μL 100% PSG für 1% Final, 5 μL 10 000 U/ml für 100 U/ml Final und 5 μL 5 μg/ml TPO für 50 ng/ml Final. Es ergibt ein Volumen von 167 μL, das zur Resuspendierung der Zellen verwendet wird, und mit der Zugabe von 333 μL Methylcellulose beträgt das Endvolumen 500 μL.
8. Nach Abschluss des Zentrifugationsschrittes 2.26 wird der Überstand verworfen und das Zellpellet im konzentrierten Kulturmedium im Verhältnis 1 × 10⁶ Zellen pro 167 μL resuspendiert.
9. Nehmen Sie die Spritzen zurück und trennen Sie eine davon vom Stecker.
10. 167 μL der Zellsuspension pipettieren.
11. Geben Sie die Zellsuspension direkt in den Spritzenanschluss (Abbildung 2F), und achten Sie darauf, dass keine Luftblasen entstehen.
    HINWEIS: Ziehen Sie beim Hinzufügen der Zellsuspension langsam gleichzeitig den Spritzenkolben, um Platz für die Zellsuspension zu schaffen.
12. Schließen Sie die beiden Spritzen vorsichtig wieder an (Abbildung 2G), ohne die Aufhängung im Schraubgewinde zu verlieren.
    HINWEIS: Ziehen Sie vor dem erneuten Anschließen den Kolben, um den Stecker halb leer zu lassen und genügend Platz für die zweite Spritze zu lassen, ohne dass die Aufhängung überläuft.
13. Das Methylcellulosemedium mit der Zellsuspension mit zehn Hin- und Her-Kolbenbewegungen zwischen den beiden Spritzen langsam homogenisieren (Abbildung 2H).
14. Ziehen Sie das Gesamtvolumen in eine Spritze und trennen Sie die beiden Spritzen, wobei der Stecker auf der leeren Spritze verbleibt.
15. Entleeren Sie den Inhalt der Spritze in eine Vertiefung einer 4-Well-Platte (Abbildung 2I).
16. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C unter 5%_CO2 (= Tag 0 der Kultur).
    HINWEIS: Es ist möglich, zwei Methylcellulose-Vertiefungen mit einem Spritzenpaar herzustellen. Erhöhen Sie um zwei das Volumen von Methylcellulose und das Volumen der Zellsuspension, um 2 x10⁶ Zellen zu haben. Nach Abschluss von Schritt 3.13. Verteilen Sie das Volumen gleichmäßig zwischen den beiden Spritzen, um jeweils 500 μL zu haben. Trennen Sie sie und leeren Sie die ohne den Verbinder in einem Kulturbrunnen. Schließen Sie die Spritzen wieder an, um das Volumen von dem Gerät, das den Stecker behalten hat, auf das andere zu übertragen. Trennen Sie die Spritzen, die mit dem 500 μL sollte den Verbinder nicht befestigt haben, und säen Sie die Zellen in einer zweiten Kultur gut aus. Die 3%ige Methylcellulose wird als Stammlösung in Iscoves Modified Dulbecco's Medium (IMDM) gekauft, während konzentrierte Zellen in DMEM suspendiert werden. Es wurden zunächst Vergleichstests durchgeführt, um sicherzustellen, dass dieses Mischmedium keinen Einfluss auf das Ergebnis des Experiments hatte, insbesondere im Vergleich zur flüssigen Kultur in 100% DMEM.

4. Zell-Resuspension für die Proplatlet-Analyse

ANMERKUNG: Die Analyse der Fähigkeit, Proplatelette zu bilden, muss unter vergleichbaren Bedingungen zwischen flüssigen und Methylcellulose-gezüchteten Megakaryozyten durchgeführt werden. Die physikalischen Einschränkungen, die durch das Methylcellulose-Hydrogel ausgeübt werden, hemmen die Proplatlet-Erweiterung. Daher werden methylcellulosegewachsene Zellen am Tag 3 der Kultur in frischem flüssigem Medium resuspendiert, damit sie Proplatele verlängern können. Methylcellulosehydrogel ist ein physikalisches Hydrogel, das bei Zugabe von flüssigem Medium leicht verdünnt werden kann. Um Artefakte vor resuspension und zentrifugation zu vermeiden, müssen Zellen im Zustand des Kontrollflüssigkeitsmediums gleichzeitig auf die gleiche Weise behandelt werden wie Methylcellulose-gezüchtete Zellen. Beziehen Sie sich auf die schematische Darstellung des Experiments (Abbildung 1).

1. Bereiten Sie 10 ml DMEM - 1% PSG vorgewärmt bei 37 °C in einem 15 ml Röhrchen für jede Vertiefung vor, um sie zu resuspendieren.
2. Resuspendieren Sie vorsichtig die Zellen aus jeder Vertiefung in den 10 ml DMEM - 1% PSG.
   HINWEIS: Führen Sie vorsichtig mehrere Auf- und Abwärtsbewegungen durch, um die Methylcellulose vollständig zu verdünnen. Achten Sie bei den Flüssigkeitsbrunnen darauf, alle am Boden des Brunnens abgelagerten Zellen zu sammeln.
3. Zentrifugieren Sie die Röhrchen 5 min bei 300 × g.
4. Bereiten Sie in der Zwischenzeit das komplette Kulturmedium vor (DMEM, PSG 1% des Endvolumens, FBS 10% des Endvolumens, Hirudin 100 U/mL, TPO 50 ng/ml).
   HINWEIS: Bei diesem Schritt wird jede Vertiefung entnommen, um die Hälfte verdünnt zu werden, daher 1 ml vollständiges Kulturmedium pro Vertiefung herstellen.
5. Verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Zellpellet in 1 ml Kulturmedium für jedes Röhrchen.
6. 500 μL Zellsuspension pro Vertiefung in eine 4- oder 24-Well-Platte neu aussäten und bei 37 °C unter 5%_CO2inkubieren.
   HINWEIS: Erhalten Sie aus einer Anfangsbohrung 2 Vertiefungen für die Proplatletvisualisierung in zweifacher Form. Bitte beachten Sie, dass diese Duplikate, da sie aus derselben Stichprobe stammen, nicht als unabhängige Replikate betrachtet werden können.
7. 24 Stunden nach dem erneuten Aussäen, am Tag 4 der Kultur, erfassen Sie zufällig 10 Bilder pro Vertiefung mit Hellfeldmikroskopie und dem 20× Objektiv.
   HINWEIS: Die Zellen neigen dazu, sich in der Mitte des Bohrlochs zu gruppieren, stellen Sie sicher, dass sie nicht zu viele Zellen auf dem Feld haben, da dies die Visualisierung und Quantifizierung von Proplatleten erschweren kann. Stellen Sie sicher, dass Sie mindestens 5 Megakaryozyten pro Feld erfassen.
8. Zählen Sie die Gesamtzahl der Megakaryozyten und der Megakaryozyten, die Proplatelets in jedem Bild verlängern, und berechnen Sie den Anteil der Megakaryozyten, die Proplatelets verlängern.
   HINWEIS: Die Quantifizierung ist nicht automatisiert; Führen Sie die Zellenzählung manuell durch. Das Zählen kann durch die Verwendung des Zellzähler-Plugins von ImageJ erleichtert werden, um auf die Zellen zu klicken, um sie bei der Zählung zu markieren. 10 Felder, die pro Bohrloch und Bohrungen in Zweifachform erworben wurden, repräsentieren ungefähr 150-300 Megakaryozyten pro Zustand.

5. Zellfixierung und -abruf für zukünftige Analysen

VORSICHT: Dieses Protokoll verwendet Fixateure, die unter einem Abzug gehandhabt werden müssen, wobei Schutzausrüstung getragen werden muss.

HINWEIS: Ziel ist es, die auf die Zellen angewendeten Gelbeschränkungen intakt zu halten, bis sie vollständig fixiert sind. Daher und unabhängig vom verwendeten Fixiermittel muss es in der Vertiefung auf der Methylcellulose hinzugefügt werden, ohne das Gel zu stören. Das gleiche Protokoll wird auf flüssige Kulturen angewendet.

1. Fügen Sie ein Volumen fixativer Lösung, das dem ausgesäten Volumen (500 μL in diesem Protokoll) entspricht, auf die Methylcellulose auf, ohne das Gel zu stören. Warten Sie auf die entsprechende Zeit entsprechend dem verwendeten Fixiermittel (mindestens 10 min).
   HINWEIS: Die fixierende Diffusion im gesamten Gel sollte sehr schnell sein, wie eine schnelle Änderung der Gelfarbe zeigt (von rosa zu einem gelb-orangen Farbton). Paraformaldehyd (8% in DPBS, 500 μL pro Well) wird normalerweise für die Immunmarkierung verwendet, während Glutaraldhehydhyd (5% im Cacodylatpuffer, 500 μL pro Well) für die elektronenmikroskopische Analyse verwendet wird.
2. Verwenden Sie eine P1000-Pipette vorsichtig mehrere Up-and-Down-Pipettierungen mit dem Fixiermittel und dem Gel, um die Methylcellulose homogen zu verdünnen.
3. Übertragen Sie mit derselben Pipette und Spitze das gesamte Volumen aus dem Bohrloch in ein 15-ml-Röhrchen mit 10 ml DPBS und homogenisieren Sie es.
4. Zentrifugieren Sie die Mischung bei 300 × g für 7 min.
   HINWEIS: Möglicherweise ist ein zweiter Waschschritt erforderlich, um die gesamte Methylcellulose zu eliminieren
5. Verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Megakaryozytenpellet im entsprechenden Medium gemäß der gewünschten Analyse (Immunmarkierung, Durchflusszytometrie^9,Elektronenmikroskopie ...) (zur Elektronenmikroskopie siehe auch die Paper-Methode"In situ exploration of the major steps of megakaryopoiesis using transmission electron microscopy" in dieser JoVE-Ausgabe).

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Ergebnisse

Die mit diesem Protokoll erhaltenen Daten wurden ursprünglich 2016 in Blood veröffentlicht⁹.

Gemäß dem Protokoll wurden die Zellen entweder in flüssigem oder Methylcellulose-Hydrogel-Medium ausgesät. Zellen in flüssigem Medium haben sich alle am Boden des Brunnens sedimentiert, in Kontakt mit der steifen Kunststoffoberfläche und manchmal mit anderen Zellen. Im Gegensatz dazu sind zellen, die in Methylcellulosehydrogel eingebettet sind, homogen im Gel verteilt un...

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Diskussion

In den letzten zehn Jahren hat die Mechanobiologie in vielen Bereichen der Biologie immer mehr Interesse geweckt. Es ist jetzt allgemein anerkannt, dass die mechanische Umgebung, die die Zellen umgibt, eine Rolle in ihrem Verhalten spielt, was die Bedeutung der Untersuchung betont, wie Megakaryozyten extrazelluläre mechanische Hinweise wahrnehmen und darauf reagieren. Es ist schwierig, die Steifigkeit des Knochenmarkgewebes in situ¹¹genau zu messen, insbesondere wenn wir das hämatopoeti...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
18-gauge needles	Sigma-Aldrich	1001735825
21-gauge needles	BD Microlance	301155
23-gauge needles	Terumo	AN*2332R1
25-gauge neeldes	BD Microlance	300400
4-well culture dishes	Thermo Scientific	144444
5 mL syringes	Terumo	SS+05S1
Cytoclips	Microm Microtech	F/CLIPSH
Cytofunnels equiped with filter cards	Microm Microtech	F/JC304
Cytospin centrifuge	Thermo Scientific		Cytospin 4
Dakopen	Dako
DMEM 1x	Gibco, Life Technologies	41 966-029
DPBS	Life Technologies	14190-094	Sterile Dulbecco’s phosphate-buffered saline
EasySep magnets	Stem Cell Technologies	18000
EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell isolation Kit	Stem Cell Technologies	19856A	biotinylated antibodies (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7–4) and streptavidin-coated magnetic beads
EDTA	Invitrogen	15575-020
Fetal Bovine Serum	Healthcare Life Science	SH30071.01
Luer lock 1 mL syringes	Sigma-Aldrich	Z551546-100EA	or 309628 syringes from BD MEDICAL
Luer lock syringes connectors	Fisher Scientific	11891120
MC 3%	R&D systems	HSC001
Polylysin coated slides	Thermo Scientific	J2800AMNZ
PSG 100x	Gibco, Life Technologies	1037-016	10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine
Rat serum	Stem Cell Technologies	13551
Recombinant hirudin	Transgène	rHV2-Lys47
Recombinant human trombopoietin (rhTPO)	Stem Cell Technologies	2822	10,000 units/mL
Round bottomed 10 mL plastique tubes	Falcon	352054
Round bottomed 5 mL polystyrene tubes