Ein einstellbares Hochauflösendes Bildgebungssystem für Verhaltensstudien von Drosophila Erwachsenen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt, wie man eine einfache Erwachsene Drosophila Verhaltensbeobachtungskammer macht und wie man hochauflösende Fotos / Videos der Morphologie oder des Verhaltens verschiedener Arten von Fruchtfliegen in der Beobachtungskammer mit relativ einfachen und erschwinglichen Methoden macht.

Zusammenfassung

Drosophila melanogaster ist ein sehr leistungsfähiges Modell in der biologischen Forschung, aber ein schlechtes Modell für Fotografie oder Videografie. Dieser Artikel beschreibt eine einfache, aber effektive Methode, um das Verhalten oder die Morphologie von Fliegen zu beobachten und zu dokumentieren. Fliegen wurden in einer durchscheinenden Beobachtungskammer c.a. platziert. Ø15 x 5mm (kein Essen innen) oder Ø15 x 12 mm (mit einem 8 mm hohen Stück Futter innen). Nach der Abdeckung mit einem ultravioletten (UV) / klaren Filter mit hoher Lichtdurchlässigkeit wurde die Kammer unter ein Stereomikroskop mit 5-50-fachem Zoom gelegt, und auf beiden Seiten des Mikroskops wurden Videoleuchten mit Mini-Leuchtdioden (LED) platziert, um die Kammer zu beleuchten, um gleichmäßiges, weiches, helles und nahezu schattenfreies Licht zu erhalten. Dann wurde eine kompakte Digitalkamera mit 3-5-fachem optischem Zoom, die 1080 P hochauflösende oder höher aufgelöste Videos (bei einer Bildrate von ≥30 fps) aufnehmen kann, über eine Halterung mit dem Okular des Mikroskops verbunden und Fotos oder Videos wurden durch das Okular aufgenommen. Durch die Einstellung des Zoom-Knopfes des Zoom-Stereomikroskops war es sehr einfach, die Fliegen zu verfolgen und nach Bedarf Panorama- oder detaillierte Nahaufnahmen aufzunehmen, während die Kamera alles unter dem Mikroskop aufzeichnete. Da die Fliegen an jeder Position in der Kammer bleiben können, können sie aus allen Richtungen beobachtet und aufgezeichnet werden. Die aufgenommenen Fotos oder Videos sind von guter Bildqualität. Diese Methode kann sowohl für die wissenschaftliche Forschung als auch für die Lehre eingesetzt werden.

Einleitung

Drosophila melanogaster ist ein herausragendes Modell in der biologischen Forschung; Es ist jedoch ein schlechtes Modell für Fotografie oder Videografie, da es zu klein für eine Kamera oder einen Camcorder und zu groß für ein zusammengesetztes^{Mikroskop 1}ist. Trotz exzellenter Forschung, die in der Literatur beschrieben wird, haben die meisten Studien nur verschwommene, unklare Bilder geliefert, anstatt klare und scharfe Fotos mit klaren Details, die das beschriebene Fliegenverhalten veranschaulichen. Obwohl das Verhalten von Fliegen ausführlich untersucht wurde (z. B. Balz und Kämpfen), haben die meisten dieser Papiere Illustrationen verwendet, um ihre Forschung den Lesern zu erklären.

Dieses Papier beschreibt einen einfachen und wirtschaftlichen Ansatz. Mit dieser Methode können nicht nur die verschiedenen Verhaltensweisen von Drosophila beobachtet werden, sondern auch alle Details, die unter einem Stereozoommikroskop beobachtet werden können, können klar und scharf aufgezeichnet werden. Natürlich kann diese Methode auch verwendet werden, um die Morphologie von Fliegen aufzuzeichnen, denn wenn sie in einen Schlaf- oder Halbschlafzustand eintreten, ermöglicht das stationäre Modell dem Benutzer, ein Foto oder einen Stapel von Fotos mit verschiedenen Fokusebenen aufzunehmen, um ein erweitertes Tiefenschärfefoto zu erhalten. Diese Methoden können ohne komplizierte Technik und teure Ausrüstung oder sogar hervorragende manuelle Fähigkeiten realisiert werden.

Die Videokomponente dieses Artikels zeigt Videos von mehreren typischen Verhaltensweisen von Fliegen. Der Zweck der Präsentation dieser Videos ist zweifach: Einer besteht darin, das Publikum wissen zu lassen, was erfasst werden kann, und die mit dieser Methode erzielte Bildqualität zu präsentieren; die andere besteht darin, neuen Schülern, die sich für Drosophila interessieren, aber bisher nicht die Möglichkeit hatten, das Verhalten von Fliegen tatsächlich zu beobachten, das Verhalten von Fliegen (wie Balz, Kämpfen) durch diese klaren Videos und nicht durch Illustrationen oder verschwommene Bilder verstehen zu lassen.

Ergänzendes Video: Fruchtfliegenverhalten: Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Protokoll

1. Aufbau des Beobachtungs-/Dokumentationssystems

HINWEIS: Die Materialien, die zum Aufbau des Flugverhaltensbeobachtungs-/Dokumentationssystems benötigt werden, sind in Abbildung 1und das fertige System in Abbildung 2 dargestellt. Das Protokoll zum Aufbau des Systems und seine Verwendung werden im Folgenden beschrieben.

1. Machen Sie einen fly behavior observation chamber (FBOC).
   1. Erhalten Sie einen kleinen, durchscheinenden (nicht transparenten) Behälter, um einen FBOC mit einem Durchmesser (Ø) von 15 mm x 20 mm herzustellen. Verwenden Sie einen transluzenten Plastikflaschenverschluss der Größe ~ Ø17 mm x 22 mm, um einen FBOC herzustellen, oder schneiden Sie einen Abschnitt von ~ 17 mm vom dicken Ende einer 5 mL Pipettenspitze, um einen FBOC herzustellen.
   2. Gießen Sie 1% Agar in das FBOC, um seine Tiefe einzustellen. Wenn das Essen in das FBOC gegeben werden muss (siehe für die Zubereitungsmethode des Essens), gießen Sie das Agar, um eine Tiefe von 12 mm zu erhalten. Wenn das Futter nicht in das FBOC gegeben werden muss, gießen Sie das Agar in eine Tiefe von 5 mm, um den Verbleib von Fruchtfliegen leichter zu verfolgen.
   3. Wenn Sie eine Pipettenspitze zur Herstellung eines FBOC verwenden, legen Sie den abgeschnittenen Pipettenspitzenabschnitt in eine Ø35 mm oder eine Ø60 mm Petrischale. Gießen Sie das 1% ige Agargel in die Petrischale mit einer Dicke von ~ 5 mm, warten Sie, bis das Agar erstarrt ist, und versiegeln Sie den Boden des FBOC. Dann gießen Sie das Agargel in das FBOC auf die gewünschte Dicke.
2. Machen Sie eine FBOC-Basis, indem Sie ein ~ 10 mm tiefes Loch in der Mitte eines Stücks einer 60 mm x 60 mm x 15 mm Ethylaminschaumplatte mit dem gleichen Durchmesser wie der FBOC bohren. Setzen Sie das FBOC in das Loch ein.
   HINWEIS: Die FBOC-Basis hält das FBOC stabil und verhindert, dass es umkippt und erleichtert die Bewegung des FBOC, um die Fliegen während der Beobachtung und Videografie zu verfolgen.
3. Machen Sie Fliegenfutter, falls erforderlich, mit Hefemedium^2,künstlicher Diät³oder reiner Saccharose / Glukose (verwenden Sie 1% Agar als Geliermittel), abhängig vom Zweck der Beobachtung.
   1. Um visuell festzustellen, ob Fliegen fressen und den Kontrast zwischen Fliegen und ihrer Umgebung zu erhöhen, fügen Sie dem Futter Lebensmittelfarbstoffe (siehe Materialtabelle)bis zu einer Endkonzentration von 12,5 mg / 100 ml hinzu.
      HINWEIS: Der Bauch der Fliegen ändert seine Farbe unmittelbar nach der Fütterung.
   2. Gießen Sie das zubereitete Essen in eine Petrischale bis zu einer Höhe von 8 mm. Verwenden Sie nach der Erstarrung eine Rasierklinge, um ein Stück Lebensmittel der Größe 8 mm x 4 mm x 8 mm auszuschneiden und auf ein Stück Kunststoff (z. B. Süßigkeitenverpackung) zu legen.
   3. Schneiden Sie das Futter in eine viereckige Pyramide oder viereckige Frustumpyramide, wie in Abbildung 3gezeigt, um die Beobachtung und Aufzeichnung des Fliegenverhaltens aus verschiedenen Winkeln zu ermöglichen, wenn die Fliegen zufällig auf dem Futter landen. Verwenden Sie den Kunststoff unter dem Lebensmittel, um zu verhindern, dass der Farbstoff in der Nahrung in das Agar im FBOC diffundieren. Verwenden Sie eine Pinzette, um das Essen in die Mitte des FBOC zu stellen.
4. Achten Sie bei einigen Verhaltensbeobachtungen darauf, dass die Fliegen im Voraus ausgehungert werden. Gießen Sie 1% Agargel (1 g Agar / 100 ml Wasser, 600 μL Propionsäure) in eine saubere leere Flasche mit einer Dicke von 1-2 cm und stellen Sie es bei Raumtemperatur für 1-2 h. Transfer fliegt in die Flasche und bei 25 °C für ≥36 h platzieren.
   HINWEIS: Fliegen können Wasser aus dem Agargel aufnehmen, so dass es nicht notwendig ist, von Zeit zu Zeit Wasser hinzuzufügen^4,5.
5. Übertragen Sie eine oder mehrere Fliegen mit einem Absauger in das FBOC. Wenn die Verwendung eines Absaugers schwierig ist, kühlen und inaktivieren Sie die Fliegen in Crushed Ice, sortieren Sie sie auf einem Eisbeutel und übertragen Sie sie auf das FBOC, wie zuvor beschrieben⁶.
   HINWEIS: Die Verwendung von Gefrieren erleichtert die Übertragung von Fliegen erheblich; die gekühlten Fliegen können innerhalb von 1 minute wieder das Bewusstsein erlangen, viel schneller als diejenigen, die mit CO₂betäubt sind. Obwohl das Abschrecken schädliche Auswirkungen auf das Verhalten von Fliegen haben könnte, z. B. eine erhöhte Kopulationslatenz von Fliegen von 5 min⁷ bis 40 min^8,ändert es das Fliegenverhalten (wie z.B. balzverhalten) nicht. Daher kann die Kühlmethode verwendet werden, um Fliegen für die allgemeine Beobachtung (z. B. Lehrexperimente) und Videografie zu übertragen. Wenn die Beobachtungen jedoch in einem wissenschaftlichen Bericht verwendet werden sollen, wird dringend empfohlen, die Fliegen keiner Betäubung auszusetzen.
6. Nachdem Sie die Fliegen auf das FBOC übertragen haben, bedecken Sie es mit einem 30-40 mm UV / Clear-Filter, damit die Kamera einen FBOC-Komplex bildet (Abbildung 4). Platzieren Sie den FBOC-Komplex zur Beobachtung unter dem Stereomikroskop.
   HINWEIS: Um klare und scharfe Bilder zu erhalten, wird dringend empfohlen, einen hochwertigen UV/Klarfilter mit hoher Lichtdurchlässigkeit (>98%) und reduziertem Flare zu verwenden. Beziehen Sie sich auf einige Vorschläge, die zuvor^9,10beschrieben wurden; Obwohl es nicht notwendig ist, teure Filter zu kaufen, vermeiden Sie es, das FBOC mit Glas wie dem Deckel einer Petrischale zu bedecken.
7. Beleuchten Sie das FBOC. Montieren Sie Mini-LED-Videoleuchten, um Blitzschuhhalterungen zu blinken, und platzieren Sie sie auf der linken und rechten Seite des FBOC (Abbildung 2). Schalten Sie die LED-Leuchten ein und stellen Sie die Helligkeit auf 100% und die Farbtemperatur auf 5000-5600 K ein.
   HINWEIS: Die Mini-LED-Videoleuchten mit dimmbarem Licht, 5600 K Farbtemperatur können eine gleichmäßige, helle, nahezu schattenfreie Beleuchtung bieten. Mit der oberen Lichtquelle, die mit dem Stereomikroskop geliefert wird, lieferte der LED-Ringlicht-Illuminator oder der faseroptische Illuminator keine zufriedenstellenden Ergebnisse. Es ist am besten, eine kontinuierliche Stromversorgung (Transformatoren) für LED-Videoleuchten zu verwenden.
8. Beobachtung und Videografie des Fliegenverhaltens
   1. Schalten Sie die LED-Videoleuchten ein und stellen Sie das Stereozoommikroskop ein, bis der Rand des FBOC mit bloßem Auge deutlich zu sehen ist. Verschieben Sie das FBOC in die Mitte des Sichtfelds.
   2. Befestigen Sie die Klemme des Universalteleskop-Digitalkameraadapters an einem Okular des Stereomikroskops und befestigen Sie dann eine kompakte Digitalkamera sicher am Adapter, indem Sie abwechselnd die Kamerabefestigungsschraube und die Kamerabefestigungsschraube drehen (Abbildung 2).
   3. Schalten Sie die Digitalkamera ein und drehen Sie die horizontalen/vertikalen Feinabstimmungsknöpfe, bis der FBOC-Rand deutlich in der Mitte des hellen kreisförmigen Sichtfelds auf dem LCD-Bildschirm der Kamera erscheint. Drehen Sie das Moduswahlrad auf den automatischen Blendenprioritätsmodus,drücken Sie den Fokus auf die Mehrfachauswahl, wählen Sie Makro-Nahaufnahme, und drücken Sie dann die Taste OK. Bewegen Sie den Zoomschalter vom Weitwinkelende zum Teleende und zoomen Sie in das kreisförmige Bild, bis sein zentraler Teil den vollständigen LCD-Bildschirm ausfüllt. Drücken Sie die Movie-record-Taste, um die Aufnahme zu starten (drücken Sie die Taste erneut, um die Aufnahme zu beenden).
      HINWEIS: Wenn das Bild zu dunkel oder zu hell ist, drücken Sie die Seite des Einstellrads in der Nähe des Belichtungskorrektursymbols (Abbildung 1), und drehen Sie das Zifferblatt, um den von der Kamera vorgeschlagenen Belichtungswert (EV) zu ändern, um den gewünschten Effekt zu erzielen. Positive EVs machen das Bild heller und negative EVs machen das Bild dunkler. Das Bild muss gleichmäßig, hell, ohne Vignettierung sein.
   4. Drehen Sie den Fokusknopf des Mikroskops, bis die Fliegen im FBOC deutlich sichtbar sind. Wählen Sie das Fliegenverhalten, das für die Beobachtung oder Videoaufzeichnung von Interesse ist. Drehen Sie den Zoomknopf zum Vergrößern und Verkleinern, um die gewünschte Vergrößerung für die Beobachtung oder Videoaufnahme zu erreichen.
      HINWEIS: Diese Methode, Bilder unter dem Mikroskop durch die Okulare aufzunehmen, ist auf jedes Mikroskop mit Okularen anwendbar. Um Fotos von experimentellen Ergebnissen zu machen, verwenden Sie eine Kamera, die im RAW-Format aufnehmen kann, da RAW-Bilddateien JPEGs vorzuziehen sind. Verwenden Sie den LCD-Bildschirm der Kamera als Display, um das Verhalten von Fruchtfliegen zu beobachten, und stellen Sie sicher, dass das Stereozoommikroskop mindestens 5-50x Zoom hat.

2. Protokolle zur Beobachtung und Videografie des Fliegenverhaltens

1. Vorbereitung der Fliegen
   1. Kulturieren Sie die Fliegen auf Maismehlmedium bei 25 °C mit 60% Luftfeuchtigkeit und einem 12 h Hell/Dunkel-Zyklus. Sammeln Sie Fliegen innerhalb von 6 Tagen nach dem Schlüpfen zur Beobachtung (außer Balz und Kampfverhalten).
      HINWEIS: Hier bestand das Medium aus 1000 ml Wasser, 105 g Maismehl, 75 g Saccharose, 15 g Agar, 40 g Hefepulver, 28 ml 10% Methylparaben (w/v in 95% Ethanol) und 6,25 ml Propionsäure.
2. Wiedererlangung des Bewusstseins aus der Anästhesie durch Kühlung
   1. Kühlen Sie die Fliegen wie zuvor beschrieben. ⁶ Die Drosophila wird mit einer Pinzette aus der Eisbox in das FBOC transferiert. Zeichnen Sie den Prozess der Fliege von der Inaktivität bis zur normalen Haltung auf Video auf.
3. Fliegenschlaf, Fütterung, Ausscheidung und Sozialverhalten
   1. Hungerfliegen für 36 h. Bringen Sie 4-6 Fruchtfliegen mit gefärbtem Futter zum FBOC. Beobachten und zeichnen Sie das Fliegenverhalten auf Video auf.
      HINWEIS: Fliegen, die mehr als 5 Minuten bewegungslos bleiben, zeigen das Schlafverhalten^{an 11}. Drosophila kann auf Nahrung oder auf einer vertikalen FBOC-Wand schlafen (der Körper steht senkrecht zur Wand der Beobachtungskammer). Obwohl sich der Körper beim Schlafen nicht bewegt, kann der Bauch als wellig angesehen werden. Das Fressverhalten manifestiert sich, wenn die Fliege ihren Rüssel ausstreckt, sich beim ständigen Saugen auf dem Futter bewegt und ihr Bauch blau wird. Während der Gruppenfütterung oder anderer Aktivitäten strecken Fruchtfliegen ihre Füße, um die Körper anderer Fruchtfliegen auf freundliche Weise zu berühren. Dies ist ein soziales Verhalten.
4. Fliegenpflegeverhalten
   1. Kühlen Sie die Fliegen wie beschrieben⁶. Werfen Sie die gefrorenen Fliegen in Agarpulver und rollen Sie sie mit Agarpulver. Übertragen Sie die Fliegen zum FBOC. Beobachten und zeichnen Sie das Pflegeverhalten auf.
      HINWEIS: Wenn die Fruchtfliege das Bewusstsein aus dem Einfrieren wiedererlangt, schüttelt sie schnell das Agarpulver von ihrem Körper ab und reinigt jeden Teil ihres Körpers mit ihren Beinen^12,13. Pflegeverhalten kann auch während der Fütterung, Balz und anderen Verhaltensweisen gesehen werden.
5. Fliegen balz und Kampfverhalten
   1. Sammeln Sie weibliche und männliche Fliegen wie zuvor beschrieben⁷. Um das Balzverhalten von Fliegen zu beobachten, legen Sie eine weibliche Fliege und eine männliche Fliege in das FBOC, um 6 Balzverhalten (erfolgreiche und gescheiterte) Verhaltensweisen zu beobachten und aufzuzeichnen.
   2. Um das Kampfverhalten von Fliegen zu beobachten, legen Sie zwei Männchen in das FBOC. Beobachten und zeichnen Sie ihr Verhalten auf, sich gegenseitig zu schieben und zu schubsen.
6. Verhalten der Fliegeneierablage
   1. Bereiten Sie weibliche Fliegen wie zuvor beschrieben^{vor 5}. Übertragen Sie 4 weibliche Fliegen mit Nahrung in FBOC.

Ergebnisse

Schießen Sie durch einen UV-Filter für klare und scharfe Bilder
Führen Sie ein einfaches Experiment durch, um den Unterschied zwischen einem UV-Filter und gewöhnlichem Glas im Labor zu beobachten. Nehmen Sie ein Durchstechflasche mit Fliegenkultur, entfernen Sie den Stopfen, legen Sie ihn unter ein Stereo-Seziermikroskop und bedecken Sie ihn (abwechselnd) mit einem UV-Filter und einem Petrischalendeckel. Die in diesen beiden Fällen aufgenommenen Fotos sind in Abbildung 5 darg...

Diskussion

Licht ist das Herzstück der Fotografie und Videografie und der entscheidende Faktor für qualitativ hochwertige Bilder¹⁶. Hier wurden zwei LED-Videoleuchten mit einstellbarer Helligkeit und Farbtemperatur als Leuchtmittel verwendet, und ein transluzentes Material wurde ausgewählt, um das FBOC herzustellen. Die LED-Lichtpaneele auf beiden Seiten sorgten für genügend Helligkeit, und das transluzente Material erweichte und streute Licht, wodurch schließlich gleichmäßiges, weiches und helles Li...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
compact camera, Nikon P310	Nikon		3-5x optical zoom, cam record 1080 P HD video
ethylamine foam			60 mm x 60 mm x 15 mm
Food Blue No 1		CAS 3844-45-9
mini LED lights and transformer	GODOX	LED-P120	have 5000-5600 K color temperature
small container (e.g. bottle cap)			about Ø 15 mm x 20 mm
UV / Clear filter			high-quality UV/Clear filter with high transmittance, 30-40 mm
zoom stereo microscope			5-50x zoom