Stabilisierte longitudinale In Vivo Visualisierung der Bauchspeicheldrüse auf zellulärer Ebene in einem Murinenmodell mit einem Pankreas-Intravital-Bildgebungsfenster

Zusammenfassung

In vivo wurde die hochauflösende Bildgebung der Bauchspeicheldrüse mit dem pankreasinen intravitalen Bildgebungsfenster erleichtert.

Zusammenfassung

Die direkte in vivo zelluläre Bildgebung der Bauchspeicheldrüse in einem lebenden Kleintiermodell war technisch anspruchsvoll. Eine kürzlich durchgeführte intravitale Bildgebungsstudie mit einem abdominalen Bildgebungsfenster ermöglichte die Visualisierung der zellulären Dynamik in Bauchorganen in vivo. Aufgrund der weichen blattartigen Architektur der Bauchspeicheldrüse der Maus, die leicht durch physiologische Bewegungen (z. B. Peristaltik und Atmung) beeinflusst werden kann, war es jedoch schwierig, eine stabilisierte longitudinale In-vivo-Bildgebung über mehrere Wochen auf zellulärer Ebene durchzuführen, um Inselchen oder Krebszellen in der Bauchspeicheldrüse der Maus zu identifizieren, zu verfolgen und zu quantifizieren. Hierin beschreiben wir eine Methode zur Implantation einer neuartigen Stützbasis, einem integrierten pankreatischen intravitalen Bildgebungsfenster, das die Bauchspeicheldrüse räumlich vom Darm trennen kann, um die intravitalen Bildgebung der Bauchspeicheldrüse in Längsschnitt zu drehen. Die longitudinale In-vivo-Bildgebung mit dem Bildgebungsfenster ermöglicht eine stabile Visualisierung, die die Verfolgung von Inseln über einen Zeitraum von 3 Wochen und eine hochauflösende dreidimensionale Abbildung der Mikrostruktur ermöglicht, wie hier in einem orthotopen Bauchspeicheldrüsenkrebsmodell gezeigt. Mit unserer Methode können weitere intravitalen bildgebenden Untersuchungen die Pathophysiologie verschiedener Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse auf zellulärer Ebene aufklären.

Einleitung

Die Bauchspeicheldrüse ist ein Bauchorgan mit einer exokrinen Funktion im Verdauungstrakt und einer endokrinen Funktion, Hormone in den Blutkreislauf zu sezernieren. Hochauflösende zelluläre Bildgebung der Bauchspeicheldrüse könnte die Pathophysiologie verschiedener Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse aufdecken, darunter Pankreatitis, Bauchspeicheldrüsenkrebs und Diabetes mellitus¹. Herkömmliche diagnostische Bildgebungswerkzeuge wie Computertomographie, Bildgebung mit magnetischer Auflösung und Ultraschall sind im klinischen Bereich weit verbreitet^1,2. Diese Bildgebungsmodalitäten beschränken sich jedoch darauf, nur strukturelle oder anatomische Veränderungen zu visualisieren, während Veränderungen auf zellulärer oder molekularer Ebene nicht bestimmt werden können. Da molekulare Veränderungen bei Diabetes mellitus oder Bauchspeicheldrüsenkrebs beim Menschen mehr als 10 Jahre vor der Diagnose³,⁴beginnen^können,hat die Erkennung von Pankreaserkrankungen aus ihrem molekularen Übergang während der Latenzzeit das Potenzial, eine frühzeitige Diagnose und eine rechtzeitige Intervention zu ermöglichen. So wird eine Bildgebung, die die Einschränkungen der Auflösung überwindet und wertvolle Einblicke in die Funktion liefert, bemerkenswert aufmerksamkeitserregen, indem sie eine frühzeitige Diagnose von Bauchspeicheldrüsenkrebs oder eine fortgeschrittene Identifizierung der Veränderung der Inseln während des Fortschreitens von Diabetes mellitus⁵ermöglicht.

Insbesondere bei den Inseln wurden die nukleare Bildgebung, die Biolumineszenzbildgebung und die optische Kohärenztomographie als nicht-invasive Inselbildgebungsverfahren vorgeschlagen⁶. Die Auflösung dieser Methoden ist jedoch im Wesentlichen niedrig, mit typischen Werten von mehreren zehn bis hunderten Mikrometern, die eine begrenzte Fähigkeit bieten, Veränderungen auf zellulärer Ebene in den Inseln zu erkennen. Auf der anderen Seite wurden frühere hochauflösende Studien von Inseln unter ex vivo^7,8 (z. B. Schneiden oder Verdauung der Bauchspeicheldrüse), nicht-physiologischen⁹ (z. B. Exteriorisierung der Bauchspeicheldrüse) und heterotopen^{Zuständen 10},^11,12 (z. B. Implantation unter der Nierenkapsel, in der Leber und in der vorderen Augenkammer) durchgeführt, was ihre Interpretation und klinischen Auswirkungen einschränkt. Wenn in vivoein physiologisches und orthotopisches Modell der hochauflösenden Bildgebung etabliert werden kann, wird es eine kritische Plattform für die Untersuchung von Pankreasinseln sein.

Die intravitale Bildgebung, die die Pathophysiologie bei einer mikroskopischen Auflösung bei einem lebenden Tier aufzeigen, hat kürzlich große Aufmerksamkeit erhalten¹³. Von den in vivo bildgebenden Verfahren hat die Entwicklung eines abdominalen Bildgebungsfensters¹⁴, das ein Fenster in den Bauch einer Maus implantiert, die Entdeckung neuer Erkenntnisse ermöglicht (d.h. ein Prä-Mikrometastasierungsstadium der frühen Lebermetastasierung¹⁵ und Mechanismus der Stammzellerhaltung im Darmepithel¹⁶). Obwohl das abdominale Bildgebungsfenster wertvolle Ergebnisse liefert, wurden die Anwendungen dieses Fensters für die Bauchspeicheldrüse und die daraus resultierende intravitale Bildgebungsforschung auf der Grundlage von Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse nicht umfassend untersucht.

Im Gegensatz zu den gut definierten festen Organeigenschaften der menschlichen Bauchspeicheldrüse ist die Bauchspeicheldrüse einer Maus eine diffus verteilte weichteilartige Struktur¹⁷. Daher wird es unaufhörlich durch physiologische Bewegungen einschließlich Peristaltik und Atmung beeinflusst. Eine frühere Studie über die Anwendung eines abdominalen Bildgebungsfensters für die Bauchspeicheldrüse zeigte, dass das Wandern aufgrund von Bewegungsartefakten auftrat, die durch Stuhlgang induziert wurden¹⁸. Im resultierenden gemittelten Bild wurden starke Unschärfen beobachtet, die die Visualisierung und Identifizierung der mikroskaligen Strukturen behinderten.

Hierin beschreiben wir die Verwendung eines neuartigen unterstützenden basenintegrierten pankreasintevitalen intravitalen Bildgebungsfensters in Kombination mit der intravitalen^{Mikroskopie 19,20,} um die longitudinalen zellulären Ereignisse bei Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse zu untersuchen. Neben einer detaillierten Beschreibung der Methodik in der vorangegangenen Studie¹⁸wird in diesem Beitrag die erweiterte Anwendung des Pankreas-Bildgebungsfensters für verschiedene Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse behandelt. In diesem Protokoll wurde ein speziell angefertigtes videorates Laser-Scanning-konfokale Mikroskopiesystem als intravitale Mikroskopiesystem verwendet. Vier Lasermodule (Wellenlängen bei 405, 488, 561 und 640 nm) wurden als Anregungsquelle verwendet, und vier Kanäle von Emissionssignalen wurden durch Photomultiplierröhren (PMT) durch Bandpassfilter (BPF1: FF01-442/46; BPF2: FF02-525/50; BPF3: FF01-600/37; BPF4: FF01-685/40). Laserscanning bestand aus einem rotierenden polygonalen Spiegel (X-Achse) und einem Galvanometer-Scanning-Spiegel (Y-Achse), der das Scannen der Videorate (30 Bilder pro Sekunde) ermöglichte. Detaillierte Informationen über die intravitalen Mikroskopie wurden in den vorherigen Studien^{10,18,19,20,21},^22,23beschrieben.

In unserer vorherigen Inselstudie¹⁸haben wir die Inseln in lebenden Mäusen mit einem transgenen Mausmodell (MIP-GFP)^24, in dem die Inseln mit GFP markiert wurden, erfolgreich und stabil abgebildet. Die Methode ermöglichte eine hochauflösende Visualisierung der Veränderungen in den Inseln über einen Zeitraum von 1 Woche. Es erleichterte auch die Bildgebung der gleichen Inseln für bis zu 3 Wochen, was auf die Machbarkeit von Langzeitstudien der Pankreasinseln für die funktionelle Verfolgung oder Überwachung während der Pathogenese von Diabetes mellitus¹⁸hindeutet. Des Weiteren entwickelten wir ein orthotopes Bauchspeicheldrüsenkrebsmodell, bei dem fluoreszierende Bauchspeicheldrüsenkrebszellen (PANC-1 NucLight Red)²⁵ direkt in die Bauchspeicheldrüse der Maus implantiert wurden. Mit der Anwendung des pankreatischen intravitalen Bildgebungsfensters könnte dieses Modell als Plattform zur Untersuchung der zellulären und molekularen Pathophysiologie in der Tumormikroumgebung von Bauchspeicheldrüsenkrebs und zur therapeutischen Überwachung neuartiger Wirkstoffkandidaten genutzt werden.

Protokoll

Alle in diesem Artikel beschriebenen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit der^8. Ausgabe des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren (2011)²⁶ durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee am Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST) und dem Seoul National University Bundang Hospital (SNUBH) genehmigt.

1. Vorbereitung des Fensters und anderer Materialien

1. Entwerfen Sie das intravitale Bildgebungsfenster der Bauchspeicheldrüse individuell, um die Bauchspeicheldrüse vom Darm in der Bauchhöhle abzuschöpfen¹⁸ (Abbildung 1A, B). Ein detaillierter Bauplan des Fensters ist in einer ergänzenden Abbildung einer früheren Studie^{beschrieben 18}.
2. Verwenden Sie C57BL / 6N-Mäuse, 8-12 Wochen alte Männchen, für die intravitale Pankreasbildgebung. Injizieren Sie Anti-CD31-Antikörper, konjugiert mit einem Alexa 647-Fluorophor, 2 h vor der Bildgebung, zum Zwecke der Gefäßmarkierung¹⁸.
3. Bereiten Sie für die Inselchenstudie ein transgenes Mausmodell vor, bei dem die Inseln mit einem fluoreszierenden Reporterprotein markiert werden. Hier verwendeten wir MIP-GFP, bei dem grün fluoreszierendes Protein unter der Kontrolle des Insulin-1-Genpromotors der Maus exprimiert wurde, der in den Betazellen aller Inseln der Maus aktiv ist²⁴.
4. Bereiten Sie für die Bauchspeicheldrüsenkrebsstudie transgene Krebszellen vor, die mit einem fluoreszierenden Reporterprotein und BALB / C-Nacktmäusen markiert sind. In dieser Studie wurden die PANC-1 NucLight Red-Zellen verwendet. PANC-1 Krebszellen²⁵ wurden mit der NucLight Red Fluoreszenzsonde markiert.
5. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Werkzeuge, Deckglas (mit PEG oder nicht) und Bildfenster mit einem Autoklaven.
6. Tragen Sie die PEG-Beschichtung auf das Deckglas auf, um Entzündungsreaktionen zu verhindern und die Biokompatibilität zu erhöhen, die für die Langzeitbildgebung geeignet ist.

2. Chirurgie

1. Bereiten Sie eine sterile chirurgische Plattform vor und sterilisieren Sie die Oberflächen mit 70% Ethanol.
   HINWEIS: Für longitudinale Bildgebungssitzungen ist eine aseptische Technik unerlässlich.
2. Anästhesie von Mäusen mit einer Mischung aus Tiletamin/Zolazepam (30 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg).
   HINWEIS: Die Verwendung von Tiletamin / Zolazepam wird anstelle von Ketamin wegen seiner nachteiligen Wirkung von Hyperglykämie empfohlen. Optimale Anästhesie sollte für den Zweck des Experiments^9,27ausgewählt werden.
3. Überwachen Sie die Körpertemperatur mit einer Rektalsonde mit einem homöothermisch gesteuerten Heizkissen.
4. Rasieren Sie die linke Flanke der Maus und tragen Sie drei Runden abwechselnd Alkohol und Jod-basiertes Peeling auf.
   HINWEIS: Wenn Enthaarungscreme verwendet wird, lassen Sie nicht länger als 1 Minute, um chemische Verbrennungen zu vermeiden.
5. Machen Sie einen 1,5 cm großen Schnitt an der linken Flanke der Maus und sezieren Sie Haut und Muskeln.
6. Führen Sie eine Geldbörsen-Saitennäht mit einer schwarzen oder Nylon-4-0-Naht am Schnittrand durch.
7. Verwenden Sie einen Mikroretraktor auf dem Schnitt und legen Sie die Milz vorsichtig frei.
8. Die Milz vorsichtig mit einer Ringzette zusammenlegen und die Bauchspeicheldrüse identifizieren.
9. Platzieren Sie das Fenster an der Flanke der Maus und führen Sie Milz und Bauchspeicheldrüse durch den offenen Raum des Fensters. Die Manipulation der Bauchspeicheldrüse muss sehr nichtjüdisch sein, da sie Blutungen oder Pankreatitis verursachen kann
10. Legen Sie die Bauchspeicheldrüse vorsichtig auf die Platte des Bildfensters; Die Milz wird auf den offenen Raum des Fensters gelegt.
11. Für die Krebszellstudie injizieren Sie PANC-1 NucLight Red (1,0 x^{10 6} Zellen) direkt in die Bauchspeicheldrüse.
    HINWEIS: Für die Bildgebung der orthotopen humanen Bauchspeicheldrüsenkrebs-Xenotransplantate könnte die direkte Implantation von Krebszellen wie PANC-1 oder anderen menschlichen Bauchspeicheldrüsenkrebszellen erleichtert werden²⁸. Zur Visualisierung mit intravitaler Fluoreszenzmikroskopie wurden PANC-1-Zellen mit rot fluoreszierendem Protein unter Verwendung des linsiviralen Reagenziens NucLight Red transduziert, das den Kern²⁹markiert. Obwohl das maximale Injektionsvolumen unsicher ist, verringern Sie das Volumen so gut wie möglich, um den Druckeffekt in der Bauchspeicheldrüse zu vermeiden.
12. Tragen Sie Tropfen N-Butylcyanoacrylatkleber auf den Rand des Bildfensters auf.
    1. Um die Menge des aufgetragenen Klebstoffs zu minimieren, verwenden Sie eine 31 G Katheternadel für die Anwendung. Wenn die Menge des Tropfens groß ist, haftet das Gewebe unbeabsichtigt am Fenster oder Deckglas.
13. Tragen Sie vorsichtig ein 12 mm rundes Deckglas auf den Rand des Bildfensters auf.
14. Ziehen Sie die Nahtschlaufe, um in die seitliche Nut des Fensters zu passen, und binden Sie sie dreimal.
15. Schneiden Sie die maximale proximale Stelle des Knotens ab, um die Unterbrechung enger Stiche zu verhindern, wenn diese Mäuse wach sind.
16. Lassen Sie Mäuse sich von der Anästhesie erholen (2-3 Stunden) und injizieren Sie Ketoprofen (5 mg / kg, subkutan in die lose Haut an der Basis des Halses oder der Hüfte des Tieres) zur Schmerzlinderung. Neubewertung auf Anzeichen von Schmerzen alle 12 Stunden und Ketoprofen sollte alle 24 Stunden für 1-3 Tage in Betracht gezogen werden.
    HINWEIS: Analgesie beeinflusst die Insulinsekretion als Reaktion auf Glukose⁹. Die Wahl und der Zeitpunkt der Analgesie müssen für den experimentellen Zweck individualisiert werden.
17. Unterbringung der Maus im Käfig mit ausreichender Einstreu, um den Kontakt des Fensters zum Käfig zu vermeiden. Vermeiden Sie es, das Haus mit den Mäusen ohne die Fensteroperation zu beherbergen.

3. Intravitalen Bildgebung

1. Schalten Sie das Intravitalenmikroskop einschließlich der Laserleistung ein.
2. Schalten Sie das Heizkissen ein und stellen Sie die homöotherme Regelung auf 37 °C ein.
   HINWEIS: Alternativ können Sie ein passives Heizkissen oder eine Lampe mit häufiger Steuerung verwenden, wenn keine homöotherme Regelung vorhanden ist.
3. Führen Sie eine intramuskuläre Anästhesie mit einer Mischung aus Tiletamin/Zolazepam (30 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) durch.
   HINWEIS: Die Verwendung von Tiletamin / Zolazepam wird anstelle von Ketamin wegen seiner nachteiligen Wirkung von Hyperglykämie empfohlen. Optimale Anästhesie sollte für den Zweck der Experimente^9,27ausgewählt werden.
4. Führen Sie einen Gefäßkatheter für die Injektion ein.
   1. Drücken Sie mit dem Zeigefinger und dem dritten Finger als Alternative zu einer Tourniquet-Anwendung auf die proximale Seite des Schwanzes. Erhitzen Sie den Schwanz bei Bedarf mit einer Lampe.
   2. Sterilisieren Sie die Schwanzvene mit einem 70% Ethanolspray.
   3. Führen Sie einen 30 G Katheter in die seitliche Schwanzvene ein. Das Aufstoßen des Blutes wird in der PE10-Röhre visualisiert.
   4. Tragen Sie ein Seidenband auf den Katheter auf, um ihn zu stabilisieren.
   5. Injizieren Sie FITC/TMR-Dextran oder andere fluoreszierende Sonden (25 μg Anti-CD31 konjugiert mit Alexa 647), je nach Bedarf, entsprechend der Kombination der fluoreszierenden Sonden¹⁸.
      HINWEIS: Für fluoreszierende konjugierte Antikörpersonden 2 h vor der Bildgebungssitzung injizieren.
5. Übertragen Sie die Maus von der operationsigen Plattform in die bildgebungsgebende Phase.
6. Setzen Sie eine Rektalsonde ein, um die Körpertemperatur mit dem homöothermischen Heizkissensystem automatisch zu steuern.
7. Setzen Sie das Pankreasbildfenster in den Fensterhalter ein, der während der IntravitalenMikroskopie vorbereitet wurde (Abbildung 2). Für ein invertiertes Mikroskop ist möglicherweise kein Fensterhalter erforderlich.
8. Führen Sie eine intravitalen Bildgebung durch.
   1. Für die Abbildung der Bauchspeicheldrüse beginnen Sie mit einer Objektivlinse mit niedriger Vergrößerung (z. B. 4x), um die gesamte Ansicht der Bauchspeicheldrüse im Pankreasbildfenster zu scannen (empfohlenes Sichtfeld: 2500 x 2500 μm).
   2. Nach der Bestimmung des interessierenden Bereichs wechseln Sie zu einem Objektiv mit höherer Vergrößerung (20x oder 40x), um die Bildgebung auf zellulärer Ebene durchzuführen (empfohlenes Sichtfeld: 500 x 500 μm oder 250 x 250 μm). In diesem Experiment betrug die laterale und axiale Auflösung etwa 0,5 μm bzw. 3 μm.
   3. Führen Sie Z-Stack- oder Zeitrafferbilder durch, um die 3D-Struktur oder die Dynamik auf zellulärer Ebene, wie z. B. die Zellmigration, zu beobachten.
      HINWEIS: Für die Bildgebung der fluoreszierenden Protein-exprimierenden Zellen transgener Tiere (MIP-GFP) waren 30 s intermittierende 488 nm Laserbelichtung mit einer Leistung von bis zu 0,43 mW ohne merkliche Photobleachung oder Gewebeschädigung tolerierbar. Für die Abbildung der mit Alexa 647 markierten fluoreszierenden Proteine war die 640 nm Laserleistung bis 0,17 mW ohne merkliche Photobleaching oder Gewebeschädigung tolerierbar. Eine längere Erregungslaserbelichtung mit einer Leistung oberhalb dieser Einstellung kann zu Photobleaching oder Gewebeschäden durch Phototoxizität führen. Passen Sie die angemessene Verstärkung und Leistung an, um den interessierenden Bereich angemessen abbilden zu können. Die detaillierte Einstellung der Parameter in der Intravitalmikroskopie muss für jede im Institut erstellte Intravitalenmikroskopie individualisiert werden.

Ergebnisse

Die Intravitalenmikroskopie in Kombination mit dem unterstützenden Basen-integrierten pankreasinen intravitalen Bildgebungsfenster ermöglicht die longitudinale zelluläre Bildgebung der Bauchspeicheldrüse in einer Maus. Dieses Protokoll mit dem intravitalen Bildgebungsfenster der Bauchspeicheldrüse bietet eine langfristige Gewebestabilität, die die Erfassung einer hochauflösenden Bildgebung ermöglicht, um einzelne Inseln für bis zu 3 Wochen zu verfolgen. Dadurch können Mosaikbilder für ein erweitertes Sichtfeld...

Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll besteht aus der intravitalen Bildgebung der Bauchspeicheldrüse unter Verwendung eines neuartigen unterstützenden integrierten pankreatischen intravitalen Bildgebungsfensters, das von einem abdominalen Bildgebungsfenster modifiziert wurde. Unter den oben beschriebenen Protokollen ist der erste kritische Schritt die Implantation des intravitalen Pankreas-Bildgebungsfensters in die Maus. Für das Auftragen des Klebstoffs im Fenster ist es wichtig, den Kleber zwischen dem Rand des Fensters u...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 647 Succinimidyl Esters (NHS esters)	Invitrogen	A20006	Fluorescent probe for conjugate with antibody
BALB/C Nude	OrientBio	BALB/C Nude	BALB/C Nude
BD Intramedic polyethylene tubing	BD Biosciences	427401	PE10 catheter for connection with needle
C57BL/6N	OrientBio	C57BL/6N	C57BL/6N
Cover glasses circular	Marienfeld	0111520	Cover glass for pancreatic imaging window
FITC Dextran 2MDa	Merck (Former Sigma Aldrich)	FD200S	For vessel identification
IMARIS 8.1	Bitplane	IMARIS	Image processing
Intravital Microscopy	IVIM tech	IVM-C	Intravital Microscopy
IRIS Scissor	JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD	S-1107-10	This product can be replaced with the product from other company
Loctite 401	Henkel	401	N-butyl cyanoacrylate glue
Micro Needle holder	JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD	H-1126-10	This product can be replaced with the product from other company
Micro rectractor	JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD	17004-03	This product can be replaced with the product from other company
Microforceps	JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD	F-1034	This product can be replaced with the product from other company
MIP-GFP	The Jackson Laboratory	006864	B6.Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J
Nylon 4-0	AILEE	NB434	Non-Absorbable Suture
Omnican N 100 30G	B BRAUN	FT9172220S	For Vascular Catheter, Use only Needle part
PANC-1 NucLightRed	Custom-made	Custom-made	Made in laboratory
Pancreatic imaging window	Geumto Engineering	Custom order	Pancreatic imaging window - custom order
Physiosuite	Kent Scientific	PS-02	Homeothermic temperature controller
Purified NA/LE Rat Anti-Mouse CD31	BD Biosciences	553708	Antibody for in vivo vessel labeling
Ring Forceps	JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD	F-1090-3	This product can be replaced with the product from other company
Rompun	Bayer	Rompun	Anesthetic agent
TMR Dextran 65-85kDa	Merck (Former Sigma Aldrich)	T1162	For vessel identification
Window holder	Geumto Engineering	Custom order	Window holder - custom order
Zoletil	Virbac	Zoletil 100	Anesthetic agent