Bewertung der globalen DNA-Doppelstrang-Endsektion mittels BrdU-DNA-Markierung in Verbindung mit Cell Cycle Discrimination Imaging

Zusammenfassung

Im vorliegenden Protokoll demonstrieren wir, wie die DNA-Doppelstrang-Endsektion während der S/G2-Phase des Zellzyklus mit einer immunfluoreszenzbasierten Methode visualisiert werden kann.

Zusammenfassung

Die Untersuchung der DNA-Schadensantwort (DDR) ist ein komplexes und essentielles Feld, das durch den Einsatz von DDR-targeting-Medikamenten zur Krebsbehandlung nur noch wichtiger geworden ist. Diese Ziele sind Poly(ADP-Ribose)-Polymerasen (PARPs), die verschiedene Formen der DNA-Reparatur initiieren. Die Hemmung dieser Enzyme mit PARP-Inhibitoren (PARPi) erreicht eine synthetische Letalität, indem eine therapeutische Verwundbarkeit in homologen Rekombinations- (HR)-defizienten Zellen aufgrund von Mutationen bei Brustkrebs Typ 1 (BRCA1), BRCA2 oder Partner und Lokalisierer von BRCA2 (PALB2) verliehen wird.

Zellen, die mit PARPi behandelt werden, akkumulieren DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs). Diese Brüche werden von der DNA-Endresektionsmaschinerie verarbeitet, was zur Bildung von einzelsträngiger (ss) DNA und anschließender DNA-Reparatur führt. In einem BRCA1-defizienten Kontext verursacht die Wiederbelebung der DNA-Resektion durch Mutationen in DNA-Resektionsinhibitoren wie 53BP1 und DYNLL1 eine PARPi-Resistenz. Daher ist die Möglichkeit, die DNA-Resektion in Cellulo zu überwachen, entscheidend für ein klareres Verständnis der DNA-Reparaturwege und die Entwicklung neuer Strategien zur Überwindung der PARPi-Resistenz. Immunfluoreszenz (IF)-basierte Techniken ermöglichen die Überwachung der globalen DNA-Resektion nach DNA-Schäden. Diese Strategie erfordert eine langpulsige genomische DNA-Markierung mit 5-Brom-2′-Desoxyuridin (BrdU). Nach DNA-Schäden und DNA-Endresektion wird die resultierende einzelsträngige DNA von einem Anti-BrdU-Antikörper unter nativen Bedingungen spezifisch nachgewiesen. Darüber hinaus kann die DNA-Resektion auch mit Hilfe von Zellzyklusmarkern untersucht werden, um zwischen verschiedenen Phasen des Zellzyklus zu unterscheiden. Zellen in der S /G2-Phase ermöglichen die Untersuchung der Endresektion innerhalb der HR, während G1-Zellen zur Untersuchung des nicht-homologen Endzusammenfügens (NHEJ) verwendet werden können. Ein detailliertes Protokoll für diese IF-Methode, gekoppelt an die Zellzyklusunterscheidung, wird in diesem Artikel beschrieben.

Einleitung

Die Modulation von DNA-Reparaturfaktoren ist eine sich ständig weiterentwickelnde Methode für die Krebstherapie, insbesondere in DNA-DSB-Reparatur-defizienten Tumorumgebungen. Die Hemmung spezifischer Reparaturfaktoren ist eine der genialen Strategien, um Krebszellen für DNA-schädigende Wirkstoffe zu sensibilisieren. Jahrzehntelange Forschung führte zur Identifizierung verschiedener Mutationen von DNA-Reparaturgenen als Biomarker für therapeutische ^{Strategieentscheidungen1}. Infolgedessen ist das DNA-Reparaturfeld zu einem Zentrum für die Arzneimittelentwicklung geworden, um eine breite Palette von Behandlungen zu gewährleisten und das Konzept der personalisierten Medizin zu stärken.

DSBs werden durch zwei Hauptwege repariert: NHEJ und ^HR2. Der NHEJ-Signalweg ist fehleranfällig, indem er die beiden DNA-Enden mit wenig bis gar keiner DNA-Endverarbeitung schnell ligariert und die Proteinkinase (DNA-PKcs), den Ku70/80-Komplex, 53BP1 und RIF1-Proteine3 umfasst. Im Gegensatz dazu ist HR ein treuer Mechanismus, der von ^BRCA14 initiiert wurde. Ein wesentlicher Schritt bei der HR-Reparatur ist der DNA-Endresektionsprozess, bei dem es sich um den Abbau der gebrochenen Enden handelt, der zu einzelsträngiger (ss) DNA mit 3'-OH-Enden führt. BRCA1 erleichtert die Rekrutierung der nachgeschalteten Proteine, die das Resektosom MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO1 bilden, die an der 5' bis 3' DNA-Resektion beteiligt ^sind5.

Die anfängliche Endresektion wird durch die Endonukleaseaktivität von MRE11 erreicht, was eine weitere Verarbeitung durch die DNA2- und EXO1-Nukleasen ermöglicht. Die erzeugten ssDNA-Überhänge werden schnell mit Replikationsprotein A (RPA) beschichtet, um sie vor einer weiteren Verarbeitung zu schützen. Anschließend setzen BRCA2, PALB2 und BRCA1 ein, um die Verschiebung von RPA und die Montage des RAD51-Nukleofilaments zu vermitteln, das für den homologiegesteuerten Reparaturmechanismus erforderlich ist. Eine feine Balance zwischen der Verwendung von NHEJ und HR ist für die optimale Aufrechterhaltung der genomischen Integrität notwendig. Die Wahl des Weges hängt von der Zellzyklusphase ab. HR wird bevorzugt während der S- bis G2-Phasen verwendet, in denen die DNA-Resektion auf höchstem Niveau ist und die Schwesterchromatiden zur Verfügung stehen, um eine ordnungsgemäße Reparatur zu gewährleisten.

Poly (ADP-ribose) Polymerase 1 (PARP-1) ist eines der frühesten Proteine, die für das DSB rekrutiert wurden. Es regelt sowohl die Resektionsaktivität als auch die Montage von nachgeschalteten Effektoren, die am ^NHEJ5,6 beteiligt sind. PARP-1 wird auch für die Reparatur von DNA-Einzelsträngelbrüchen während der Replikation ^benötigt7,8. Aufgrund seiner wichtigen Rolle bei der DNA-Reparatur werden PARP-Inhibitoren (PARPi) als Krebstherapien eingesetzt. Bei mehreren HR-defizienten Krebsarten führt die PARPi-Behandlung zu einer synthetischen tödlichen Reaktion aufgrund der Unfähigkeit von HR-defizienten Zellen, den akkumulierten Schaden über einen alternativen Weg zu ^{reparieren9,10}. Derzeit gibt es vier von der FDA zugelassene PARPi: Olaparib, Rucaparib, Niriparib und Talazoparib (auch BMN 673 genannt), die für verschiedene Brust- und Eierstockkrebsbehandlungen eingesetzt ^werden11. PARPi-Resistenzen sind jedoch häufig, und eine mögliche Ursache entsteht durch den Erneuterwerb von ^{HR-Kenntnissen12}. Der Verlust oder die Hemmung von PARP-1 in Gegenwart von Bestrahlung dysreguliert die Resektosom-Maschinerie, was zur Anhäufung längerer ssDNA-Trakte ^führt13. Daher ist eine eingehende Untersuchung der DNA-Resektion in vivo entscheidend für ein klareres Verständnis der DNA-Reparaturwege und die anschließende Entwicklung neuer Strategien zur Behandlung von Krebs und zur Überwindung der PARPi-Resistenz.

Es wurden mehrere Methoden verwendet, um DNA-Resektionsereignisse ^{nachzuweisen5}. Eine solche Methode ist die klassische IF-basierte Technik, die eine indirekte Färbung und Visualisierung der resezierten DNA nach stressinduziertem DSB unter Verwendung eines Anti-RPA-Antikörpers ermöglicht. Die Markierung genomischer DNA mit 5-Brom-2′-Desoxyuridin (BrdU) und der Nachweis von nur ssDNA ist eine direkte Messung von DNA-Resektionsereignissen. Es umgeht die Überwachung von RPA, die an mehreren zellulären Prozessen wie der DNA-Replikation beteiligt ist. Bei der hier beschriebenen Methode ermöglichen zellen, die mit BrdU für einen einzelnen Zellzyklus inkubiert wurden, dass BrdU in einen Strang der replizierenden zellulären DNA eingebaut wird. Nach der Resektion wird die IF-Färbung unter Bedingungen durchgeführt, die einen BrdU-Nachweis nur in der ssDNA-Form unter Verwendung eines Anti-BrdU-Antikörpers ermöglichen. Dieser Antikörper kann nur auf exponierte BrdU-Nukleotide zugreifen und erkennt keine in doppelsträngige DNA integrierten Nukleotide. Mittels Fluoreszenzmikroskopie kann die resezierte DNA in Form von punktförmigen BrdU/ssDNA-Herden sichtbar gemacht werden. Die Kernintensität dieser Herde kann als Auslesung verwendet werden, um die Resektion nach DNA-Schäden zu quantifizieren. Diese Arbeit beschreibt Schritt für Schritt die Prozesse dieser Methode, die auf die meisten Säugetierzelllinien angewendet werden kann. Diese Methode sollte als einfache Möglichkeit zur Überwachung der DNA-Endresektion in Cellulo als Proof of Concept von großem Nutzen sein.

Protokoll

1. Zellkultur, Behandlungen und Deckglasvorbereitung

HINWEIS: Alle Zellplattierungen, Transfektionen und Behandlungen, mit Ausnahme der Bestrahlung, sollten unter einer sterilen Zellkulturhaube stattfinden.

1. Tag 1
   1. Legen Sie in eine 6-Well-Platte einen einzelnen Deckglas in jeden Brunnen für so viele Bedingungen wie nötig. Platte ~ 150.000 HeLa-Zellen für die Transfektion oder medikamentöse Behandlung, je nach Wunsch.
      HINWEIS: Bei der Transfektion wird empfohlen, zum Zeitpunkt der Beschichtung eine umgekehrte Transfektion durchzuführen, oder es ist möglich, einige Stunden nach der Beschichtung eine Vorwärtstransfektion durchzuführen, um die Haftung zu ermöglichen. Eine umgekehrte Transfektion wird erreicht, indem die Transfektionsmischung zum Deckglas gegeben wird, bevor die Zellen hinzugefügt werden; Somit beginnt die Transfektion, bevor die Zellen zu kleben beginnen. Eine Vorwärtstransfektion hingegen ist die Zugabe der Transfektionsmischung nach der Haftung an der Oberfläche in der Regel am folgenden Tag. Es ist jedoch möglich, dies am selben Tag zu tun, vorausgesetzt, es wird genügend Zeit für die Zellen gegeben, um zu haften.
   2. Verwenden Sie für diese Methode 4 Vertiefungen: Vertiefung 1: siRNA-Kontrolle (siCTRL genannt); Gut 2: siRNA gegen PARP-1 (siPARP-1); Brunnen 3: unbehandelt; Vertiefung 4: Zellen, die 1 h vor der Bestrahlung mit 5 μM BMN673 behandelt werden sollen.
      ANMERKUNG: In diesem Protokoll wurden alle Prüfungen unter bestrahlten Bedingungen durchgeführt (siehe Abschnitt 1.3).
   3. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem 5% _CO2 befeuchteten Inkubator über Nacht, obwohl das Transfektionsprotokoll eine Inkubation von bis zu 3 Tagen ermöglicht. Die Inkubationszeit vor der BrdU-Behandlung hängt von der siRNA-Transfektionseffizienz ab. Wenn es keine Transfektion gibt, reicht die Inkubation für 16 h aus, um die Einhaltung des Deckglases und ein gewisses Zellwachstum zu ermöglichen.
      HINWEIS: Die Bedingungen des Inkubators können je nach verwendeter Zelllinie geändert werden.
2. Tag 2
   1. BrdU in einer Endkonzentration von 10 μM in das entsprechende Kulturmedium geben und 16 h lang inkubieren (ein Zellzyklus).
      ANMERKUNG: Die BrdU-Lösung wird in Dimethylsulfoxid hergestellt; die verwendete Stammlösung beträgt 10 mM und wird in Aliquots bei -20 °C gelagert.
3. Tag 3
   1. Bestrahlen Sie die Platten mit einer Gesamtdosis von 5 Gy Röntgenbestrahlung (variieren Sie die Dosis der Bestrahlung je nach Bestrahlungstyp, z. B. Kleintierbestrahlungsgeräte vs. Tischbestrahlungsgeräte). Siehe die Materialtabelle für die Marke und das Modell des verwendeten Bestrahlungsgeräts.
   2. Bringen Sie die Platten zum Inkubator zurück und geben Sie die Zellen für 3 h frei.
   3. Bereiten Sie während der 3-stündigen Inkubationszeit die beiden Puffer A und B sowie 4% Paraformaldehyd (PFA) in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) vor.
      HINWEIS: Die Puffer A und B und die Saccharose sollten am Tag der Fixierung frisch zubereitet werden, wobei frische Saccharoselösung verwendet wird, um eine Kontamination zu vermeiden.
      1. Bereiten Sie Puffer A (Pre-Extraction Buffer) gemäß der in Tabelle 1 beschriebenen Reihenfolge (30 ml) vor.
         HINWEIS: Die 1M Saccharose sollte am Tag der Anwendung vorbereitet werden, um eine Kontamination zu vermeiden.
      2. Puffer B (Cytoskeleton Stripping Buffer) gemäß der in Tabelle 1 (30 ml) beschriebenen Reihenfolge herstellen.
         HINWEIS: Puffer B muss in der angegebenen Reihenfolge hergestellt werden, um die Ausfällung von Tween-20 und Natriumdesoxycholatlösung zu verhindern.
      3. Bereiten Sie 4% PFA, 2 ml pro Zustand (10 ml), unter einer chemischen Haube vor (Tabelle 1).

2. Vorextraktion und Fixierung

HINWEIS: Alle Vorextraktionen und Fixierungen werden mit den Deckgläsern durchgeführt, die in der Gewebekulturplatte auf Eis oder bei 4 °C verbleiben. der Deckglas wird erst im letzten Schritt der Montage angehoben (siehe Diskussion).

1. Vorextraktion
   1. Aspirieren Sie das Medium, waschen Sie die Zellen vorsichtig zweimal mit 1x PBS und entfernen Sie das PBS. 2 ml Vorextraktionspuffer A zugeben und sofort bei 4 °C für 10 min inkubieren.
      HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Inkubationszeit in Puffer A nicht verlängert wird. Eine verlängerte Inkubation in den Vorextraktionspuffern führt zu einer erhöhten Anzahl von abgelösten Zellen aus dem Deckglas. Alternativ kann anstelle der Inkubation bei 4 °C die Inkubation auf Eis erfolgen.
   2. Puffer A durch Aspiration entfernen.
      HINWEIS: Waschen Sie die Deckgläser nicht, nachdem Sie Puffer A entfernt haben. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort.
   3. 2 ml Cytoskeleton Stripping Buffer B zugeben und sofort bei 4 °C für 10 min inkubieren. Puffer B vorsichtig absaugen und die Zellen einmal vorsichtig mit 1x PBS waschen. Saugen Sie die 1x PBS vorsichtig ab.
2. Fixierung
   1. Fixieren Sie die Zellen, indem Sie 2 ml 4% PFA unter die chemische Haube geben.
      HINWEIS: PFA ist giftig und muss unter einer chemischen Haube manipuliert werden.
   2. Inkubieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur für 20 min. Waschen Sie die Deckgläser zweimal mit 1x PBS und saugen Sie den Überschuss ab.
   3. Die Deckgläser mit 100% kaltem Methanol bedecken und die Deckgläser bei -20 °C für 5 min inkubieren. Zweimal mit 1x PBS waschen.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Die Deckgläser können bei 4 °C in 1x PBS gelagert und die Platte bei Bedarf in Alufolie eingewickelt werden. Die Zellen sollten nicht länger als 5 Tage vor der Fortsetzung des IF-Protokolls aufbewahrt werden.

3. Permeabilisierung

1. Inkubieren Sie die Zellen mit 2 ml 1x PBS, die 0,5% Triton X-100 enthalten, bei Raumtemperatur für 15 min. Waschen Sie die Deckgläser dreimal mit 2 ml 1x PBS.

4. Immunfärbung

1. Blockierender Schritt
   1. Bereiten Sie genügend frischen Blockierpuffer (3% BSA in 1x PBS) vor, um 2 ml pro Deckglas zu verwenden.
      HINWEIS: Bereiten Sie einen zusätzlichen 5 ml Blockierungspuffer vor, um die Antikörperlösungen herzustellen.
   2. Geben Sie 2 ml Blockierpuffer in jede Vertiefung und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 1 h.
2. Primäre Antikörper-Inkubation
   1. Bereiten Sie die primäre Antikörperlösung in frischem Blockierungspuffer vor: BrdU RPN202 1:1000 und Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) 1:500, 100 μL pro Deckglas.
      HINWEIS: Um den Antikörper zu erhalten, kann ein kleineres Volumen verwendet werden, 75-100 μL für einen 22 x 22 mm Deckglas, 50-75 μL für einen 18 x 18 mm Deckglas.
   2. Auf jedem Deckglas werden 100 μL primäre Antikörperlösung zugegeben. Decken Sie die Deckgläser mit einem Quadrat Parafilm mit einer Pinzette ab und positionieren Sie den Parafilm vorsichtig, um keine Blasen zu erzeugen.
   3. Decken Sie die Platte mit Aluminiumfolie ab und inkubieren Sie den primären Antikörper über Nacht bei 4 °C in einer befeuchteten Kammer.
   4. Entfernen Sie die Parafilmquadrate und waschen Sie die Deckgläser dreimal mit 2 ml sterilem 1x PBS.
3. Sekundäre Antikörper-Inkubation
   1. Bereiten Sie genügend sekundäre Antikörperlösung in frischem Blockierungspuffer vor: Anti-Maus 488 fluoreszierende sekundäre A11011 (für BrdU) Verdünnung 1:800 und Anti-Kaninchen 568 fluoreszierende sekundäre A11011 (für PCNA) Verdünnung 1:800.
      HINWEIS: Die verwendeten Farben können an die experimentellen Bedürfnisse angepasst werden. Die verwendete Marke finden Sie in der Materialtabelle.
   2. Fügen Sie auf jedem Deckglas 100 μL sekundäre Antikörperlösung hinzu, bedecken Sie die Deckgläser mit einem Quadrat Parafilm mit einer Pinzette und positionieren Sie den Parafilm vorsichtig ohne Blasen.
   3. Inkubieren Sie den sekundären Antikörper bei Raumtemperatur für 1 h mit der Platte, die mit Aluminiumfolie bedeckt ist.
   4. Waschen Sie die Deckgläser dreimal mit 2 ml 1x PBS.
4. Nukleare Färbung
   1. Bereiten Sie ein Volumen von 2 ml pro Deckglas von 1x PBS mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) in einer Endkonzentration von 1 μg/ml (1:1000) vor.
   2. Fügen Sie auf jedem Deckglas 2 ml der DAPI-Lösung hinzu. Die Deckgläser bei Raumtemperatur für 10 min mit der platte mit Alufolie bedecken. Waschen Sie die Deckgläser zweimal mit 1x PBS.
   3. Decken Sie die Deckgläser mit 1x PBS ab und verwenden Sie entweder eine Nadel oder eine feine Pinzette, um den Deckglas von der Unterseite des Brunnens zu heben. Tupfen Sie die überschüssige Flüssigkeit vorsichtig ab, indem Sie eine Kante vorsichtig auf ein Papiertuch klopfen.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, den Objektträger nicht fallen zu lassen oder die flache Oberfläche mit den anhaftenden Zellen das Papier berühren zu lassen.
   4. Montieren Sie die Deckgläser auf Dias mit 10-20 μL ZF-spezifischen Montagemedien.

5. Bildaufnahme und -analyse

HINWEIS: Die Bildaufnahme kann auf verschiedenen Arten von Fluoreszenzmikroskopen erfolgen. Ein Epifluoreszenzmikroskop mit einem 63-fachen Ölobjektiv wurde verwendet; siehe die Materialtabelle für die Marke und das Modell. Z-Stacks sind nicht erforderlich, obwohl sie je nach Zelllinie und Grad der mitochondrialen Färbung von Nutzen sein können.

1. Bildanalyse
   1. Erstellen Sie für jedes Bild mehrere TIFF-Dateien. Verschmelzen Sie alle Ebenen, aber halten Sie die Farbkanäle getrennt. Importieren Sie diese Dateien in Cell Profiler (The Broad Institute https://cellprofiler.org/home) und analysieren Sie sie mithilfe der Speckle Counting-Pipeline (Supplemental Video 1).
   2. Laden Sie die Bilder hoch (ergänzende Abbildung S1A).
      1. Um mit der Erstellung des Projekts zu beginnen, laden Sie die Speckle-Zählpipeline in das Programm und die zu analysierenden Bilder im bereitgestellten Bereich.
      2. Verwenden Sie das NamesAndTypes-Modul , um jedem Bild einen aussagekräftigen Namen zuzuweisen, mit dem andere Module auf it-C01: Darstellung des BRDU-Kanals verweisen. C02: Darstellung des PCNA-Kanals; C03: Darstellung des DAPI-Kanals.
         HINWEIS: Diese Identifikatoren hängen vom Mikroskop ab. Der Dateiname sollte einen Bezeichner enthalten, um zwischen den Kanälen zu unterscheiden.
   3. Identifizieren Sie, welche Datei verwendet werden soll, um die Kerne zu identifizieren, und benennen Sie sie (ändern Sie diesen Namen nach Bedarf) (siehe Ergänzende Abbildung S1B und Ergänzende Abbildung S1C).
      1. Wählen Sie den Durchmesser des Objekts zwischen 50 und 300 Pixeleinheiten aus, was der akzeptable Größenbereich für Kerne ist, aber ändern Sie den Wert so, dass er zu den Kernen im Bild passt.
         HINWEIS: Es kann sein, dass 50 ein zu großer Wert ist und verhindert, dass kleinere Kerne identifiziert werden; Ebenso kann 300 es ermöglichen, große Gruppierungen von Kernen als 1 zu zählen.
      2. Verwerfen Sie Objekte außerhalb des Durchmesserbereichs, um sicherzustellen, dass nur Objekte gezählt werden, die den Kriterien entsprechen.
      3. Verwerfen Sie Objekte, die Rahmen berühren, um Zellen zu entfernen, die sich möglicherweise nur teilweise im Feld befinden.
      4. Wenden Sie den Schwellenwert an, um ihn an die spezifischen Bilder anzupassen. Beachten Sie die folgenden Einstellungen als Beispiel. Ändern Sie den Schwellenwertkorrekturfaktor basierend darauf, wie streng die Schwellenwertstrategie sein wird. Zu den weiteren Einstellungen gehören die Schwellenwertstrategie: Global; Schwellenwertmethode: Otsu; Schwellenwerte für zwei Klassen oder drei Klassen: Zwei Klassen; Schwellenwert-Glättungsskala: 1; Schwellenwert-Glättungsfaktor: 1; untere und obere Grenzen des Schwellenwerts: 0,0 und 1,0; Methode zur Unterscheidung verklumpter Objekte: Shape; und Methode zum Zeichnen von Trennlinien zwischen verklumpten Objekten: Propagate.
         HINWEIS: Für jeden Parameter bietet der Zellenprofiler ergänzende Definitionen und verfügbare Möglichkeiten für die Variableneinstellung.
   4. Identifizieren Sie das primäre Objekt, um die Herde zu identifizieren (ergänzende Abbildung S2A).
      1. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen: Wählen Sie das Eingabebild aus: Maskedgreen; benannte das primäre Objekt, das identifiziert werden soll: BrdUFoci; typischer Durchmesser des Objekts: 1-15; Verwerfen Sie das Objekt außerhalb des Durchmesserbereichs: Ja; Verwerfen Sie das Objekt, das den Rand des Bildes berührt: Nein; Schwellenwertstrategie: Adaptiv; Schwellenwertmethode: Otsu; Schwellenwerte für zwei Klassen oder drei Klassen: Drei Klassen; Schwellenwert-Glättungsskala: 1; Schwellenwert-Glättungsfaktor: 3; und Größe des Glättungsfilters: 4.
   5. Messen Sie die Intensität (ergänzende Abbildung S2B).
      1. Wählen Sie das zu messende Bild aus: OrigGreen.
      2. Klicken Sie auf Weiteres Bild hinzufügen. Wählen Sie das zu messende Bild aus: PCNA. Wählen Sie die zu messenden Objekte aus: Kerne.
         HINWEIS: Dies wird verwendet, um die BrdU- und PCNA-Intensität zu messen - die endgültigen Daten, die grafisch dargestellt werden.

Ergebnisse

In diesem Protokoll wurde der Bromodeoxyuridin (BrdU)-basierte Assay verwendet, um die Resektionsreaktion von HeLa-Zellen auf bestrahlungsinduzierte Schäden quantitativ zu messen. Die erzeugten ssDNA-Spuren werden nach der Immunfluoreszenzfärbung als unterschiedliche Herde visualisiert (Abbildung 1A). Die identifizierten Herde wurden dann quantifiziert und als integrierte Gesamtintensität der BrdU-Färbung in den Kernen ausgedrückt (Abbildung 1B, Erg...

Diskussion

Dieser Artikel beschreibt eine Methode, die die IF-Färbung nutzt, um Variationen in der DNA-Resektion in Cellulo zu messen. Der aktuelle Standard für die Beobachtung eines Effekts auf die DNA-Resektion ist die RPA-Färbung; Dies ist jedoch eine indirekte Methode, die durch DNA-Replikation beeinflusst werden kann. Zuvor wurde eine weitere BrdU-Inkorporations-basierte DNA-Resektions-IF-Technik zur Klassifizierung der resultierenden Intensitäten in BrdU-positiven und BrdU-negativen Zellen beschrieben. Diese Meth...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa 568 goat anti-rabbit	Molecular probes	A11011	1:800
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse	Molecular probes	A11001	1:800
Anti PARP1 (F1-23)	Homemade		1:2500
Anti PCNA (SY12-07)	Novus	NBP2-67390	1:500
Anti-Alpha tubulin (DM1A)	Abcam	Ab7291	1:100000
anti-BrdU	GE Healthcare	RPN202	1:1000
Benchtop X-ray Irradiator	Cell Rad
BMN673	MedChem Express	HY-16106
Bromodeoxyuridine (BrdU)	Sigma	B5002
BSA	Sigma	A7906
Cell profiler	Broad Institute	V 3.19	https://cellprofiler.org/
Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft	Fisher scientific	13-374-12
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Invitrogen Life Technology	D1306
DMEM high glucose	Fisher scientific	10063542
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
Fetal Bovine serum	Gibco	12483-020
Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22	Fisher scientific	12 541B
Fluorescent microscope	Leica	DMI6000B	63x immersion objective
HeLa	ATCC	CCL-2
HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120V	VWR	51030408	37% CO2
MgCl2	BioShop Canada	MAG520.500
NaCl	BioShop Canada	SOD002.10
Needle
PBS 1x	Wisent Bio Products	311-010-CS
PFA 16%	Cedarlane Labs	15710-S(EM)
PIPES	Sigma-Aldrich	P6757-100G
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen Life Technology	P-36930
RNAiMAX	Invitrogen	13778-075
siPARPi	Dharmacon		AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT
siRNA control	Dharmacon		UUCGAACGUGUCACGUCAA
Sodium Deoxycholcate	Sigma-Aldrich	D6750-100G
Sucrose	BioShop Canada	SUC507.5
Tris-base	BioShop Canada	TRS001.5
Trition X-100	Millipore Sigma	T8787-250ML
Tween20	Fisher scientific	BP337500
Tweezers