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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir beschreiben hier die Einrichtung und Anwendung einer Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (unten als αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 bezeichnet) Maus-Reporterlinie zur Beurteilung der kardialen Reprogrammierung. Neonatale kardiale Fibroblasten (NCFs), die aus dem Mausstamm isoliert wurden, werden in induzierte Kardiomyozyten (iCMs) umgewandelt, was eine bequeme und effiziente Bewertung der Reprogrammierungseffizienz und der funktionellen Reifung von iCMs über den Calcium(Ca2+)-Fluss ermöglicht.

Zusammenfassung

Die kardiale Reprogrammierung ist zu einer potenziell vielversprechenden Therapie zur Reparatur eines beschädigten Herzens geworden. Durch die Einführung mehrerer Transkriptionsfaktoren, einschließlich Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), können Fibroblasten in induzierte Kardiomyozyten (iCMs) umprogrammiert werden. Diese iCMs, wenn sie in situ in einem infarktierten Herzen erzeugt werden, integrieren sich elektrisch und mechanisch in das umgebende Myokard, was zu einer Verringerung der Narbengröße und einer Verbesserung der Herzfunktion führt. Aufgrund der relativ geringen Reprogrammierungseffizienz, Reinheit und Qualität der iCMs bleibt die Charakterisierung von iCMs eine Herausforderung. Die derzeit in diesem Bereich verwendeten Methoden, einschließlich Durchflusszytometrie, Immunzytochemie und qPCR, konzentrieren sich hauptsächlich auf die kardialspezifische Gen- und Proteinexpression, nicht aber auf die funktionelle Reifung von iCMs. Ausgelöst durch Aktionspotentiale führt das Öffnen spannungsgesteuerter Calciumkanäle in Kardiomyozyten zu einem schnellen Zustrom von Calcium in die Zelle. Daher ist die Quantifizierung der Rate des Kalziumeinstroms eine vielversprechende Methode zur Bewertung der Kardiomyozytenfunktion. Hier stellt das Protokoll eine Methode zur Bewertung der iCM-Funktion durch Calcium (Ca2 +) -Fluss vor. Ein αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3-Mausstamm wurde durch Kreuzung von Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (unten als Myh6-Cre bezeichnet) mit Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (unten als Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 bezeichnet) Mäuse etabliert. Neonatale kardiale Fibroblasten (NCFs) von P0-P2-Neugeborenenmäusen wurden isoliert und in vitro kultiviert, und eine polycistronische Konstruktion von MGT wurde in NCFs eingeführt, was zu ihrer Reprogrammierung auf iCMs führte. Da nur erfolgreich reprogrammierte iCMs GCaMP3-Reporter exprimieren, kann die funktionelle Reifung von iCMs durch Ca2+- Fluss mit Fluoreszenzmikroskopie visuell beurteilt werden. Im Vergleich zu nicht reprogrammierten NCFs zeigten NCF-iCMs einen signifikanten transienten Kalziumfluss und eine spontane Kontraktion, ähnlich wie CMs. Dieses Protokoll beschreibt detailliert die Etablierung von Mausstämmen, die Isolierung und Selektion neonataler Mäuseherzen, die NCF-Isolierung, die Produktion von Retroviren zur kardialen Reprogrammierung, die iCM-Induktion, die Auswertung des iCM Ca2+- Flusses unter Verwendung unserer Reporterlinie sowie die damit verbundene statistische Analyse und Datenpräsentation. Es wird erwartet, dass die hier beschriebenen Methoden eine wertvolle Plattform bieten werden, um die funktionelle Reifung von iCMs für kardiale Reprogrammierungsstudien zu bewerten.

Einleitung

Myokardinfarkt (MI) ist weltweit eine schwere Erkrankung. Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVDs) sind weltweit die häufigste Todesursache und für rund 18,6 Millionen Todesfälle im Jahr 20191 verantwortlich,2. Die Gesamtmortalität von CVDs ist im letzten halben Jahrhundert zurückgegangen. Dieser Trend wurde jedoch in einigen unterentwickelten Ländern verlangsamt oder sogar umgekehrt1, was eine wirksamere Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen erfordert. Als eine der tödlichen Manifestationen von CVD macht MI etwa die Hälfte aller Todesfälle aus, die auf CVDs in den Vereinigten Staaten zurückzuführen sind2. Während der Ischämie, mit der Blockierung der Koronararterien und der begrenzten Versorgung mit Nährstoffen und Sauerstoff, erleidet das Myokard schwere metabolische Veränderungen, beeinträchtigt die systolische Funktion von Kardiomyozyten (CMs) und führt zum CM-Tod3. Zahlreiche Ansätze in der Herz-Kreislauf-Forschung wurden erforscht, um Herzverletzungen zu reparieren und die Funktion des verletzten Herzens wiederherzustellen4. Die direkte kardiale Reprogrammierung hat sich als eine vielversprechende Strategie zur Reparatur des geschädigten Herzens und zur Wiederherstellung seiner Funktion herausgestellt5,6. Durch die Einführung von Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT) können Fibroblasten in vitro und in vivo auf iCMs umprogrammiert werden, und diese iCMs können den Narbenbereich reduzieren und die Herzfunktion verbessern7,8.

Obwohl die kardiale Reprogrammierung eine vielversprechende Strategie für die MI-Behandlung ist, gibt es noch eine Reihe von Herausforderungen. Erstens sind die Reprogrammierungseffizienz, Reinheit und Qualität nicht immer so hoch wie erwartet. Die MGT-Aufforderung kann nur 8,4% (cTnT+) oder 24,7% (αMHC-GFP+) der gesamten CFs erreichen, die in vitro7 auf iCMs umprogrammiert werden sollen7, oder bis zu 35% in vivo8, was ihre Anwendung einschränkt. Selbst mit mehr im System induzierten Faktoren wie Hand29 oder Akt1/PKB10 ist die Reprogrammierungseffizienz immer noch kaum zufriedenstellend, um in einem klinischen Umfeld eingesetzt zu werden. Daher sind in diesem Bereich weitere Studien erforderlich, die sich auf die Verbesserung der Reprogrammierungseffizienz konzentrieren. Zweitens sind die elektrische Integrität und die Kontraktionseigenschaften von iCMs wichtig für die effiziente Verbesserung der Herzfunktion, aber diese sind schwierig zu bewerten. Derzeit konzentrieren sich weit verbreitete Bewertungsmethoden auf diesem Gebiet, einschließlich Durchflusszytometrie, Immunzytochemie und qPCR der Expression einiger wichtiger CMs-Gene, alle auf die Ähnlichkeit von iCMs und CMs, aber nicht direkt mit den funktionellen Eigenschaften von iCMs. Darüber hinaus haben diese Methoden relativ komplizierte Verfahren und sind zeitaufwendig. Während Reprogrammierungsstudien in der Regel ein Screening potenzieller Reprogrammierungsfaktoren beinhalten, die die Reifung von iCMs fördern11, erfordert die kardiale Reprogrammierung eine schnelle und bequeme Methode, die auf der iCMs-Funktion basiert.

CMs öffnen die spannungsgesteuerten Calciumionenkanäle auf der Zytomembran während jedes Kontraktionszyklus, was zu einem vorübergehenden Zustrom von Calciumionen (Ca2+) aus der interzellulären Flüssigkeit in das Zytoplasma führt, um an der Myofilamentkontraktion teilzunehmen. Ein solcher Ca2+-Ein- und Abflusszyklus ist das grundlegende Merkmal der Myokardkontraktion und bildet die normale Funktion von CMs12. Daher könnte eine Methode, die den Ca2+-Zustrom erkennt, eine mögliche Möglichkeit sein, die Funktion von CMs und CM-ähnlichen Zellen, einschließlich iCMs, zu messen. Darüber hinaus bietet eine solche Methode für iCMs eine weitere Möglichkeit, die Reprogrammierungseffizienz zu bewerten.

Genetisch kodierte Kalziumindikatoren (GECIs) wurden entwickelt und weit verbreitet verwendet, um Zellaktivitäten, insbesondere Aktionspotenziale, anzuzeigen. Im Allgemeinen bestehen GECIs aus einer Ca2 +- Bindungsdomäne wie Calmodulin und einer Fluoreszenzdomäne wie GFP, und GCaMP3 ist eine mit hoher Affinität und Fluoreszenzintensität. Die Fluoreszenzdomäne von GCaMP3 wird aktiviert, wenn die lokale Calciumkonzentration geändert wird13. In diesem Artikel wird ein Mausstamm beschrieben, der speziell einen GCaMP3-Reporter in Myh6+-Zellen exprimiert. Durch die Einführung von MGT in die isolierten NCFs von Neugeborenen dieses Stammes kann die Reprogrammierung durch Fluoreszenz überwacht werden, die erfolgreich reprogrammierte iCMs aufweisen werden. Ein solcher Mausstamm und eine solche Methode wird eine wertvolle Plattform bieten, um die kardiale Reprogrammierung zu untersuchen.

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Protokoll

Alle experimentellen Verfahren und Praktiken mit Tieren wurden vom Institutional Animal Care & Use Committee der University of Michigan genehmigt. Alle experimentellen Verfahren und Praktiken mit Zellkultur müssen BSL2 Biological Safety Cabinet unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Für die Verfahren und Praktiken im Zusammenhang mit Viren wurde die Richtlinie zur ordnungsgemäßen Entsorgung von transfizierten Zellen, Pipettenspitzen und Röhrchen befolgt, um das Risiko von Umwelt- und Gesundheitsgefahren zu vermeiden.

1. Etablierung eines Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze /J (bezeichnet als Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3) Mausstamms (Abbildung 1)

  1. Präparieren Sie Tg(Myh6-cre)1Jmk/J Mausstamm (Jackson Lab Stock 009074, bezeichnet als Myh6-Cre) bzw. Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J Mausstamm (Jackson Lab Stock 014538, bezeichnet als Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3).
  2. Züchten Sie jeden Stamm bis zu einem Alter von 8 Wochen, um erwachsene Myh6-Cre- bzw. Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3-Mäuse zu erhalten.
  3. Kreuzung der erwachsenen Myh6-Cre und der Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 Mäuse.
    HINWEIS: Richten Sie Myh6-Cre männlich / Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 weiblich oder umgekehrt ein. Es gibt keinen signifikanten Unterschied zwischen ihren Nachkommen. Typischerweise bringen die weiblichen Mäuse 19-21 Tage nach der Kreuzung 8-10 Welpen zur Welt.

2. Isolierung und Auswahl von neonatalen Myh6-Cre / Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 Mäuseherzen.

  1. Erhalten Sie P0-P2 Welpen. Stellen Sie sicher, dass 8-10 Welpen vorhanden sind, um 10 Millionen NCFs mit diesem Protokoll zu isolieren.
  2. Tief betäubt die Welpen durch Unterkühlung. Legen Sie die Welpen in einen Latexhandschuh und tauchen Sie bis zum Hals in zerstoßenes Eis und Wasser (2°C - 3°C) ein.
  3. Desinfizieren Sie die Welpen kurz mit 75% Ethanol.
  4. Opfere die Welpen durch Enthauptung mit einer sterilen Schere.
  5. Machen Sie einen horizontalen Schnitt in der Nähe des Herzens, drücken Sie das Herz zusammen und isolieren Sie es dann, indem Sie es an der Wurzel der Aorta mit einer Schere trennen.
  6. Beobachten Sie das Herz schlagen unter einem Fluoreszenzmikroskop. Stellen Sie sicher, dass die Herzen mit Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 Genotyp ca2+ flux zeigt, der durch GCaMP3 mit Herzschlag angezeigt wird. Die anderen Genotypen zeigen keine Fluoreszenz (Abbildung 2, Video 1 und Video 2).

3. Isolierung von neonatalen kardialen Fibroblasten (NCFs)

HINWEIS: Für diesen Teil wurde das Protokoll aus Dr. Li Qians Labor14 mit geringfügigen Optimierungen übernommen, sofern dies für diese Studie anwendbar ist.

  1. Nach der Isolierung der αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 Herzen werden sie in vier Lose miteinander verbundene Teile geschnitten. Waschen Sie sie in eiskaltem DPBS in einer 6 cm großen Platte mehrmals gründlich, um die Blutzellverschmutzung in den isolierten Zellen zu begrenzen.
  2. Übertragen Sie die Herzen in ein 15 ml konisches Rohr.
  3. Verdauen Sie die Herzen mit 8 ml warmem 0,25% Trypsin-EDTA bei 37 °C für 10 min.
  4. Verwerfen Sie den Trypsinüberstand und geben Sie 5 ml warme Typ-II-Kollagenase (0,5 mg/ml) in HBSS.
  5. Die Mischung gründlich vorrühren und bei 37 °C für 5 min inkubieren.
  6. Nach der Inkubation gründlich wirbeln und das unverdaute Gewebe durch schwerkraft absetzen lassen.
  7. Sammeln Sie den Überstand in einem 15 ml konischen Röhrchen mit 5 ml kaltem Fibroblastenmedium (FB) (IMDM mit 20% FBS und 1% Penicillin/ Streptomycin).
  8. Wiederholen Sie die Schritte 3.4-3.7 für das unverdaute Gewebe 4-5 Mal.
  9. Sammeln Sie alle Überstände zusammen und filtern Sie den Überstand mit einem 40 μm Sieb.
  10. Zentrifugiere bei 200 x g für 5 min bei 4 °C und entsorge den Überstand.
  11. Resuspendieren Sie die Zellen in 10 mL Magnetaktivierten Zellsortierpuffer (MACS-Puffer; 1x PBS mit 2 mM EDTA und 0,5% BSA).
  12. Bestimmen Sie die lebensfähige Zellzahl durch Trypanblaufärbung.
    1. Nehmen Sie 10 μL Zellen aus 10 ml Zellsuspension in Schritt 3.11.
    2. Mischen Sie mit 10 μL 0,4% iger trypanblauer Lösung und inkubieren Sie für 5 min bei Raumtemperatur.
    3. Fügen Sie die Mischung zu einem Hämozytometer hinzu und bestimmen Sie die lebensfähige Zellzahl. Die toten Zellen sind blau gefärbt, während die lebensfähigen Zellen nicht angefärbt sind.
  13. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 5 min bei 4 °C und verwerfen Sie den Überstand.
  14. Resuspendieren Sie die Zellen mit 10 μL Thy1,2-Mikrokügelchen in 90 μL gekühltem MACS-Puffer für weniger als 10 Millionen lebensfähige Zellen. Fügen Sie proportional mehr Perlen hinzu, wenn es mehr als 10 Millionen lebensfähige Zellen gibt. Die Mischung gut pipettieren und bei 4 °C für 30-60 min inkubieren.
  15. Fügen Sie 10 ml MACS-Puffer hinzu und mischen Sie gut.
  16. Zentrifugiere bei 200 x g für 5 min, verwerfe den Überstand.
  17. Wiederholen Sie die Schritte 3.15-3.16 einmal.
  18. Resuspendieren Sie die Zellen und Kügelchen mit 2 ml MACS-Puffer.
  19. Richten Sie einen MACS-Separator in der Haube ein. Fügen Sie eine LS-Spalte in das Trennzeichen ein und gleichen Sie die Spalte mit 3 ml MACS-Puffer aus.
  20. Wenn die LS-Spalte ausgeglichen ist, führen Sie die Zellen durch die Spalte.
  21. Waschen Sie die LS-Säule dreimal mit 2 ml MACS-Puffer.
  22. Nehmen Sie die Säule vom Separator, eluieren Sie sie dreimal mit 2 ml MACS-Puffer und sammeln Sie dann die Elution in einem 50 ml Rohr.
  23. Zentrifugiere bei 200 x g für 5 min und entsorge den Überstand.
  24. Resuspendieren Sie die Zellen mit 5 ml FB-Medien.
  25. Bestimmen Sie die Zellzahl mit einem Hämozytometer.
  26. Verdünnen Sie die Zellen mit FB-Medien und säen Sie die Zellen nach Belieben auf Schalen oder Teller. Stellen Sie sicher, dass die Zellaussaatdichte etwa 2-2,5 x 104 Zellen/cm2 beträgt (optimieren Sie die Dichte basierend auf einzelnen Experimenten). Stellen Sie sicher, dass die anhaftenden Fibroblasten am zweiten Tag nach der Aussaat eine ovale bis runde Form haben (Abbildung 3).

4. Herstellung eines Retrovirus-kodierenden polycistronischen MGT-Vektors zur kardialen Reprogrammierung

  1. Halten Sie Plat-E mit Plat-E-Kulturmedien (DMEM ergänzt mit 10% FBS, 1 μg/ml Puromycin und 10 μg/ml Blasticidin) bei 37 °C mit 5% CO2.
  2. Teilen Sie an Tag 1 Plat-E in eine 6-Well-Platte mit einer Dichte von ca. 4-5 x 105 Zellen / Well.
  3. An Tag 2 erreicht Plat-E typischerweise 80% Konfluenz. Transfizieren Sie die Zellen mit den folgenden Verfahren. Passen Sie das Volumen und die Menge jedes hier vorhandenen Elements basierend auf jeder Vertiefung in einer 6-Well-Platte an.
    1. Verdünnen Sie 2 μg pMX-puro-MGT polycistronischen Retrovirus-Expressionsplasmidvektor (Addgen 111809) auf 500 ng/μL mit TE-Puffer.
    2. Bereiten Sie die Transfektionsmischung vor, indem Sie 10 μL Lipofektamin mit 150 μL reduziertem Serummedium mischen. Vorsichtig pipettieren, gut mischen und bei Raumtemperatur für 5 min inkubieren. Achten Sie darauf, Blasen beim Pipettieren zu vermeiden.
    3. In der Zwischenzeit eine Plasmidmischung herstellen, indem Sie das Plasmid mit 150 μL reduziertem Serummedium mischen. Vorsichtig pipettieren, gut mischen und bei Raumtemperatur für 5 min inkubieren. Achten Sie darauf, Blasen beim Pipettieren zu vermeiden.
    4. Die beiden Mischungen vorsichtig vermischen und bei Raumtemperatur 5 min inkubieren. Die Lösung kann wolkig erscheinen.
    5. Fügen Sie die Mischung Tropfen für Tropfen zu den zu transfizierenden Zellen hinzu.
    6. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 °C.
  4. Wechseln Sie am Tag 3 das Medium in ein frisches vollständiges Zellkulturmedium ohne Puromycin und Blasticidin.
  5. Am Tag 4, 48 h nach der Transfektion, sammeln Sie den Überstand, der Retroviren enthält, und lagern Sie ihn in 4 ° C.
  6. Sammeln Sie am Tag 5, 72 h nach der Transfektion, den Überstand, der Retroviren enthält.
  7. Sowohl den 48 h als auch den 72 h Überstand mit einem 0,45 μm Filter filtrieren, über Nacht bei 4 °C durch Zugabe von 1/5 Volumen 40% Poly (Ethylenglykol) (PEG) Lösung zu einer Endkonzentration von 8% PEG ausfallen.
  8. Zentrifugieren Sie bei 4.000 x g für 30 min, um das Virus auszufällen.
    HINWEIS: Das PEG8000-Virus bildet einen kleinen weißen Niederschlag.
  9. Resuspendieren Sie das Virus mit einem iCM-Medium, das 8 μg/ml Polybrenn enthält, wie gewünscht. Verwenden Sie das Retrovirus sofort.

5. Umprogrammierung von NCFs auf iCMs mit MGT-kodierender Retrovirus-Infektion

  1. Züchten oder passieren Sie NCFs vor der Virusinfektion.
    HINWEIS: Normalerweise kann NCF zweimal durchlaufen werden.
  2. Am Tag 0 ncf auf die Dichte von etwa 1-2 x 104 Zellen/cm2 in FB-Medium ausrichten.
  3. Ersetzen Sie an Tag 1 das Kulturmedium durch ein virushaltiges Medium für jede Vertiefung nach Belieben. Verwenden Sie das Virus aus einem Brunnen Plat-E in einer 6-Well-Platte, um zwei Vertiefungen in einer 24-Well-Platte zu infizieren. Titeren Sie das Virus, um die optimale Viruskonzentration zu bestimmen.
    HINWEIS: Viren, die andere Reprogrammierungsfaktoren von Interesse enthalten, könnten zusammen mit dem MGT-Retrovirus eingeführt werden.
  4. Über Nacht bei 37 °C inkubieren.
  5. Ersetzen Sie am Tag 2, 24 h nach der Virusinfektion, das virushaltige Medium durch ein normales iCM-Medium.
  6. Um die GCaMP3-Expression zu überwachen, platten Sie sie unter ein inverses Fluoreszenzmikroskop. Beobachten Sie unter 10x am GFP-Kanal die milde basale GCaMP3-Fluoreszenz eines Teils der Zellen bereits am Tag 5.
  7. Tauschen Sie das Medium während der Neuprogrammierung alle 2-3 Tage aus. Falls erforderlich, führen Sie eine positive Selektion für MGT-Retrovirus-infizierte Zellen durch, indem Sie 3 Tage lang 2 μg/ml Puromycin in das Kulturmedium geben und bei 1 μg/ml halten.
    HINWEIS: Einführung von Chemikalien von Interesse (z. B. IGF-1, MM589, A83-01 und PTC-209, die als IMAP bezeichnet werden, wie wir bereits berichtet haben15), zusammen mit der Mitteländerung.
  8. Ersetzen Sie das Medium nach 14 Tagen Infektion durch B27-Medium, um die iCM-Reifung weiter zu induzieren.

6. Bewertung der iCM-Funktionsreifung und Reprogrammierungseffizienz durch Ca2+ Fluss

HINWEIS: Geben Sie den zu bewertenden Zellen vor der Beurteilung erforderlichenfalls 1 μM Isoproterenol hinzu.

  1. Beurteilen Sie den Ca2+ -Fluss mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop bei Raumtemperatur.
  2. Beobachten Sie im GFP-Kanal die GCaMP3+-Zellen unter dem 10-fachen Objektiv. Stellen Sie sicher, dass es spontane Zellschläge im Hellfeldkanal zeigt.
  3. Wählen Sie nach dem Zufallsprinzip drei Felder unter 20x aus und zeichnen Sie den Ca2+ -Fluss der iCMs für 3 Minuten für jedes Feld auf.
    HINWEIS: Hier wurde der Ca2+- Fluss mit spontanem Zellschlag synchronisiert (Abbildung 4, Abbildung 5 und Video 3, Video 4, Video 5, Video 6, Video 7, Video 8).
  4. Quantifizieren Sie die Zellen manuell mit ca2+ Fluss.

7. Statistische Auswertung und Datendarstellung

  1. Analysieren Sie die Unterschiede zwischen den Gruppen, einseitige Varianzanalyse (ANOVA) und führen Sie die Multiple-Vergleichstests Student-Newman-Keuls durch.
    ANMERKUNG: Die Ergebnisse entsprechen dem Mittelwert ± S.E. mit p < 0,05, die als statistisch signifikant angesehen werden. Jedes Experiment wurde mindestens dreimal durchgeführt.

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Ergebnisse

Der experimentelle Workflow zur Erzeugung des Mausstamms Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 und die Genstruktur der transgenen Mäuse ist in Abbildung 1 dargestellt. Während der Mausstamm etabliert ist, wurden die Herzen der Welpen isoliert und unter einem umgekehrten Fluoreszenzmikroskop beobachtet, um den Genotyp zu bestätigen. Herzen mit korrektem Genotyp zeigen ca2+-Fluss synchronisiert mit schlagen, visualisiert als GCaMP3-Fluoreszenz, während in Kontrollherzen keine F...

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Diskussion

Die Bewertung der iCMs-Funktion ist für das Kardiale Reprogrammierungsfeld notwendig. In diesem Manuskript beschreibt das Protokoll einen Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J Mausstamm, der etabliert wurde, wie die ncFs, die von den neonatalen Mäusen in diesem Stamm isoliert wurden, für die Reprogrammierung auf iCMs und die Bewertung der iCMs-Funktion durch Ca2+- Fluss verwendet werden. Dies ist eine De-novo-Methode zur Bewertung der funktionellen Reifung von iCMs.

...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Danksagungen

Wir schätzen die Bemühungen von Leo Gnatovskiy bei der Bearbeitung des englischen Textes dieses Manuskripts. Abbildung 1 wurde mit BioRender.com erstellt. Diese Studie wurde durch das Stipendium der National Institutes of Health (NIH) der Vereinigten Staaten (1R01HL109054) an Dr. Wang unterstützt.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL Conical Centrifuge TubesThermo Fisher Scientific14-959-70C
50mL Conical Centrifuge TubesThermo Fisher Scientific14-959-49A
6 Well Cell Culture PlatesAlkali ScientificTP9006
A83-01Stemgent04–0014
All-in-One Fluorescence MicroscopeKeyenceBZ-X800EInverted fluorescence microscope
B-27 Supplement (50X), serum freeThermo Fisher Scientific17504044
Blasticidin S HCl (10 mg/mL)Thermo Fisher ScientificA1113903
Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free PowderThermo Fisher ScientificBP9706100
CD90.2 MicroBeads, mouseMiltenyi Biotec130-049-101Thy1.2 microbeads
Collagenase, Type 2Thermo Fisher ScientificNC9693955
Counting ChamberThermo Fisher Scientific02-671-51BHemocytometer
DMEM, high glucose, no glutamineThermo Fisher Scientific11960069
DPBS, calcium, magnesiumThermo Fisher Scientific14-040-133
Ethanol, 200 proof (100%)Thermo Fisher Scientific04-355-451
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Certified ACS)Thermo Fisher ScientificE478-500
Fetal Bovine SerumCorning35-010-CV
HBSS, calcium, magnesium, no phenol redThermo Fisher Scientific14025092
IMDM mediaThermo Fisher Scientific12440053
IX73 Inverted MicroscopeOlympusIX73P2FInverted fluorescence microscope
Lipofectamine 2000 Transfection ReagentThermo Fisher Scientific11-668-019
LS ColumnsMiltenyi Biotec130-042-401
Medium 199, Earle's SaltsThermo Fisher Scientific11150059
MidiMACS Separator and Starting KitsMiltenyi Biotec130-042-302
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilizedMillipore SigmaSLHV033RB
MM589Obtained from Dr. Shaomeng Wang’s lab in University of Michigan
Opti-MEM I Reduced Serum MediumThermo Fisher Scientific31-985-070
PBS, pH 7.4Thermo Fisher Scientific10-010-049
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell LineCell BiolabsRV-101
pMx-puro-MGTAddgene111809
Poly(ethylene glycol)Millipore SigmaP5413-1KGPEG8000
Polybrene Infection / Transfection ReagentMillipore SigmaTR-1003-G
PTC-209SigmaSML1143–5MG
Puromycin DihydrochlorideThermo Fisher ScientificA1113803
Recombinant Human IGF-IPeprotech100-11
RPMI 1640 MediumThermo Fisher Scientific11875093
ST 16 Centrifuge SeriesThermo Fisher Scientific75-004-381
Sterile Cell StrainersThermo Fisher Scientific22-363-54740 µm strainer
Surface Treated Tissue Culture DishesThermo Fisher ScientificFB012921
TE BufferThermo Fisher Scientific12090015
Trypan Blue solutionMillipore SigmaT8154
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redThermo Fisher Scientific25300054
Vortex MixerThermo Fisher Scientific02215365

Referenzen

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