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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Detaillierte Schritt-für-Schritt-Protokolle werden hier beschrieben, um mechanische Signale in vitro mit multipotenten O9-1-Neuralleistenzellen und Polyacrylamid-Hydrogelen unterschiedlicher Steifigkeit zu untersuchen.

Zusammenfassung

Neuralleistenzellen (NCCs) sind embryonale multipotente Zellen von Wirbeltieren, die in eine Vielzahl von Zelltypen wandern und differenzieren können, aus denen verschiedene Organe und Gewebe hervorgehen. Gewebesteifigkeit erzeugt mechanische Kraft, ein physikalischer Hinweis, der eine entscheidende Rolle bei der NCC-Differenzierung spielt; Der Mechanismus bleibt jedoch unklar. Die hier beschriebene Methode liefert detaillierte Informationen für die optimierte Erzeugung von Polyacrylamid-Hydrogelen unterschiedlicher Steifigkeit, die genaue Messung einer solchen Steifigkeit und die Bewertung der Wirkung mechanischer Signale in O9-1-Zellen, einer NCC-Linie, die in vivo NCCs nachahmt.

Die Hydrogelsteifigkeit wurde mittels Rasterkraftmikroskopie (AFM) gemessen und zeigte entsprechend unterschiedliche Steifigkeitsstufen an. O9-1 NCCs, die auf Hydrogelen unterschiedlicher Steifigkeit kultiviert wurden, zeigten eine unterschiedliche Zellmorphologie und Genexpression von Stressfasern, was auf unterschiedliche biologische Effekte hinwies, die durch mechanische Signaländerungen verursacht wurden. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die Variation der Hydrogelsteifigkeit zu einem effizienten In-vitro-System führte, um die mechanische Signalgebung zu manipulieren, indem die Gelsteifigkeit verändert und die molekulare und genetische Regulation in NCCs analysiert wurde. O9-1 NCCs können sich unter dem Einfluss der entsprechenden Differenzierungsmedien in eine Vielzahl von Zelltypen differenzieren, und es ist praktisch, chemische Signale in vitrozu manipulieren. Daher ist dieses In-vitro-System ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Rolle der mechanischen Signalgebung in NCCs und ihre Wechselwirkung mit chemischen Signalen zu untersuchen, was den Forschern helfen wird, die molekularen und genetischen Mechanismen der Neuralleistenentwicklung und -krankheiten besser zu verstehen.

Einleitung

Neuralleistenzellen (NCCs) sind eine Gruppe von Stammzellen während der Embryogenese von Wirbeltieren mit einer bemerkenswerten Fähigkeit zu wandern und zur Entwicklung verschiedener Organe und Gewebe beizutragen. NCCs können sich in verschiedene Zelltypen differenzieren, einschließlich sensorischer Neuronen, Knorpel, Knochen, Melanozyten und glatter Muskelzellen, abhängig von der Lage des axialen Ursprungs und der lokalen Umweltführung des NCC1,2. Mit der Fähigkeit, sich in eine Vielzahl von Zelltypen zu differenzieren, können genetische Anomalien, die in jedem Stadium der Neuralleistenentwicklung (NC) eine Dysregulation verursachen, zu zahlreichen angeborenen Erkrankungen führen2. Zum Beispiel führen Störungen während der Bildung, Migration und Entwicklung von NCCs zu Entwicklungsstörungen, die zusammen als Neurokristopathien1,3bekannt sind. Diese Krankheiten reichen von kraniofazialen Defekten aufgrund eines Versagens der NCC-Bildung, wie dem Treacher-Collins-Syndrom, bis hin zur Entwicklung verschiedener Krebsarten aufgrund der metastasierenden Migrationsfähigkeit des NCC, wie sie beim Melanom3,4,5,6beobachtet wird . In den letzten Jahrzehnten haben Forscher bemerkenswerte Entdeckungen über die Rollen und Mechanismen von NCCs in der Entwicklung und bei Krankheiten gemacht, wobei sich die Mehrheit der Ergebnisse auf chemische Signale konzentriert7,8. In jüngerer Zeit wurde darauf hingewiesen, dass mechanische Signale eine kritische, aber wenig verstandene Rolle in der NCC-Entwicklungspielen 9,10.

Die Umwelthinweise von NCCs spielen während ihrer Entwicklung eine entscheidende Rolle, einschließlich der Regulierung der NCC-Differenzierung in verschiedene Zelltypen. Umwelteinflüsse, z. B. physikalische Hinweise, beeinflussen das entscheidende Verhalten und die zellulären Reaktionen, wie z. B. die funktionelle Diversifizierung. Die Mechanotransduktion ermöglicht es den Zellen, diese Hinweise zu spüren und darauf zu reagieren, um verschiedene biologische Prozesse aufrechtzuerhalten2. NCCs sind von benachbarten Zellen und verschiedenen Substraten wie der extrazellulären Matrix (ECM) umgeben, die mechanische Reize hervorrufen können, um die Homöostase aufrechtzuerhalten und sich durch Schicksalsbestimmung, Proliferation und Apoptose an die Veränderungen anzupassen11. Die Mechanotransduktion beginnt an der Plasmamembran, wo die sensorische Komponente mechanischer extrazellulärer Reize auftritt, was zur intrazellulären Regulation der Zelleführt 12. Integrine, fokale Adhäsionen und Verbindungen der Plasmamembran leiten mechanische Signale wie Scherkräfte, Spannung und Steifigkeit der umgebenden Substrate in chemische Signale um, um zelluläre Reaktionen zu erzeugen12. Die Weiterleitung chemischer Signale von der Plasmamembran zur endgültigen zellulären Regulation erfolgt über verschiedene Signalwege, um lebenswichtige Prozesse für den Organismus, wie z.B. die Differenzierung, abzuschließen.

Mehrere Studien haben gezeigt, dass die mechanische Signalübertragung aus der Substratsteifigkeit eine Rolle bei der Zelldifferenzierung spielt13,14. Zum Beispiel haben frühere Studien gezeigt, dass mesenchymale Stammzellen (MSCs), die auf weichen Substraten mit einer Steifigkeit ähnlich der von Hirngewebe (im Bereich von 0,1-1,0 kPa) gezüchtet wurden, zu einer neuronalen Zelldifferenzierung führten15,16. Allerdings differenzieren sich mehr MSCs in myozytenähnliche Zellen, wenn sie auf 8-17 kPa-Substraten gezüchtet werden, die die Steifigkeit des Muskels nachahmen, während osteoblastenartige Differenzierung beobachtet wurde, wenn MSCs auf steifen Substraten kultiviert wurden (25-40 kPa)15,16. Die Bedeutung der Mechanotransduktion wird durch die Unregelmäßigkeiten und Anomalien im mechanischen Signalweg hervorgehoben, die möglicherweise zu schweren Entwicklungsdefekten und -krankheiten führen, einschließlich Krebs, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Osteoporose17,18,19. Bei Krebserkrankungen ist normales Brustgewebe weich, und das Brustkrebsrisiko steigt in steifem und dichtem Brustgewebe, einer Umgebung, die eher Brusttumorenähnelt 15. Mit diesem Wissen können die Auswirkungen der mechanischen Signalgebung auf die NCC-Entwicklung durch einfache Manipulation der Substratsteifigkeit durch ein In-vitro-System untersucht werden, was weitere Vorteile und Möglichkeiten zum Verständnis der Grundlagen des NC-bedingten Krankheitsverlaufs und der Ätiologie bietet.

Um den Einfluss mechanischer Signale in NCCs zu untersuchen, haben wir ein effizientes In-vitro-System für NCCs etabliert, das auf der Optimierung zuvor veröffentlichter Methoden und der Bewertung der Reaktionen von NCCs auf verschiedene mechanische Signale basiert20,21. Es wurde ein detailliertes Protokoll für die unterschiedliche Vorbereitung der Hydrogelsteifigkeit und die Bewertung der Auswirkungen der mechanischen Signalgebung in NCCs bereitgestellt. Um dies zu erreichen, werden O9-1 NCCs als NC-Modell verwendet, um die Auswirkungen und Veränderungen als Reaktion auf steife gegenüber weichen Hydrogelen zu untersuchen. O9-1 NCCs sind eine stabile NC-Zelllinie, die am Tag 8.5 aus dem Mausembryo (E) isoliert wurde. O9-1 NCCs ahmen NCCs in vivo nach, weil sie sich in definierten Differenzierungsmedien in verschiedene NC-abgeleitete Zelltypen differenzieren können22. Um die mechanische Signalisierung von NCCs zu untersuchen, wurde ein Matrixsubstrat mit abstimmbarer Elastizität aus unterschiedlichen Konzentrationen von Acrylamid- und Bisacrylamidlösungen hergestellt, um die gewünschte Steifigkeit zu erreichen, die der biologischen Substratsteifigkeit20,21,23entspricht. Um die Bedingungen des Matrixsubstrats für NCCs, insbesondere O9-1-Zellen, zu optimieren, wurden Modifikationen aus dem zuvor veröffentlichten Protokoll20vorgenommen. Eine Änderung in diesem Protokoll bestand darin, Hydrogele in Kollagen I, verdünnt in 0,2% Essigsäure anstelle von 50 mM HEPES, bei 37 ° C über Nacht zu inkubieren. Der niedrige pH-Wert der Essigsäure führt zu einer homogenen Verteilung und einem höheren Kollagen-I-Einbau, wodurch eine gleichmäßigere Bindung des ECM-Proteins24ermöglicht wird. Darüber hinaus wurde eine Kombination aus Pferdeserum und fetalem Rinderserum (FBS) in Konzentrationen von 10% bzw. 5% in Phosphatpuffersalzlösung (PBS) verwendet, bevor die Hydrogele im Inkubator gelagert wurden. Pferdeserum wurde als zusätzliche Ergänzung zu FBS aufgrund seiner Fähigkeit verwendet, die Zellproliferation und -differenzierung bei einer Konzentration von 10% zu fördern25.

Mit dieser Methode wurde eine biologische Umgebung durch die ECM-Proteinbeschichtung (z. B. Kollagen I) nachgeahmt, um eine genaue In-vitro-Umgebung für NCCs zu schaffen, um zu wachsen und zu überleben20,21. Die Steifigkeit der präparierten Hydrogele wurde mittels Rasterkraftmikroskopie (AFM), einer bekannten Technik zur Darstellung des Elastizitätsmoduls26,quantitativ analysiert. Um die Wirkung unterschiedlicher Steifigkeitsniveaus auf NCCs zu untersuchen, wurden Wildtyp-O9-1-Zellen kultiviert und auf Hydrogelen für die Immunfluoreszenz (IF) -Färbung gegen filamentöses Aktin (F-Aktin) vorbereitet, um die Unterschiede in der Zelladhäsion und Morphologie als Reaktion auf Veränderungen der Substratsteifigkeit zu zeigen. Mit diesem In-vitro-System werden die Forscher in der Lage sein, die Rolle der mechanischen Signalgebung in NCCs und ihre Wechselwirkung mit anderen chemischen Signalen zu untersuchen, um ein tieferes Verständnis der Beziehung zwischen NCCs und mechanischer Signalgebung zu erlangen.

Protokoll

1. Hydrogel-Zubereitung

HINWEIS: Alle Schritte müssen in einer Zellkulturhaube durchgeführt werden, die vor Gebrauch mit Ethanol desinfiziert und ultraviolett (UV)-sterilisiert wurde, um die Sterilität aufrechtzuerhalten. Werkzeuge wie Pinzetten und Pipetten müssen mit Ethanol besprüht werden. Pufferlösungen müssen ebenfalls sterilfiltriert werden.

  1. Herstellung von Aminosilan-beschichteten Glas-Deckgläsern
    1. Legen Sie die gewünschte Anzahl von Glasdeckgläsern auf ein Stück Labortuch.
      HINWEIS: Bereiten Sie zusätzliche 3-4 Deckgläser vor, um ausreichende Backup-Vorräte zu gewährleisten, da sie leicht brechen. Verschiedene Materialien von Glasdeckgläsern führen zu einer unterschiedlichen Kompatibilität der Zellaussaat und -befestigung. Es ist besser zu bestimmen, welcher Typ am besten zum Experiment passt, bevor Sie mit den Experimenten beginnen (siehe Materialtabelle).
    2. Verwenden Sie einen Alkoholbrenner oder Bunsenbrenner, um jeden Deckglas zu sterilisieren, indem Sie ihn durch die Flamme hin und her führen (30 s für Protein-Assay-Experimente). Legen Sie jedes Glasdeckglas auf ein Labortuch, um sich abzukühlen.
    3. Sobald die Glasdeckgläser abgekühlt sind, übertragen Sie sie auf eine mit Parafilm ausgekleidete Petrischale, um ein Verrutschen zu verhindern.
      HINWEIS: Wenn die Deckgläser nicht kühl genug sind, schmilzt die Restwärme den Parafilm auf die Zettel und macht sie unbrauchbar.
    4. Decken Sie die Deckgläser mit ca. 200 μL und 800 μL 0,1 M NaOH für einen 12 mm bzw. einen 25 mm Deckglas ab und lassen Sie sie 5 min ruhen. Dann saugen Sie die 0,1 M NaOH ab und lassen Sie die Deckgläser für weitere 5 minuten an der Luft trocknen, um einen gleichmäßigen Film zu bilden.
    5. Sobald die Deckgläser getrocknet sind, werden etwa 80 μL und 150 μL 3-Aminopropyltriethoxysilan (APTS) für 12 mm bzw. 25 mm Deckgläser pipettiert. Achten Sie darauf, dass die Lösung nicht auf den Parafilm verschüttet wird. Lassen Sie die Lösung 5 Minuten einwirken.
    6. Aspirieren Sie so viel überschüssiges APTS wie möglich und lassen Sie das verbleibende APTS 5 min trocknen. Spülen Sie die Deckgläser gut ab, indem Sie sie dreimal für jeweils 5 min in steriles, deionisiertes (DI)H2Otauchen.
      HINWEIS: Wenn die Glasdeckgläser nicht gut gespült werden, verursacht das verbleibende APTS unerwünschte Reaktionen mit Glutaraldehyd, wodurch sich ein weißer Niederschlag bildet und unbrauchbare Deckgläser entstehen.
    7. Bewegen Sie die Deckgläser mit der reaktiven Seite nach oben in eine neue Petrischale. Geben Sie genügend 0,5% Glutaraldehyd in die Petrischale, um die Deckgläser vollständig abzudecken, und lassen Sie die Deckgläser 30 Minuten einwirken.
    8. Das 0,5%ige Glutaraldehyd absaugen und die Deckgläser erneut in DIH2Oeinmalig für 3 min abspülen. Stellen Sie die Deckgläser mit der reaktiven Seite nach oben auf ein Labortuch oder eine saubere Petrischale, um sie vor dem Gebrauch vollständig an der Luft zu trocknen.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Die Deckgläser müssen bis zur Verwendung in steriles DIH2Oeingelegt werden.
  2. Herstellung von silikonisierten Deckgläsern
    1. Die gleiche Anzahl von Deckgläsern wie die mit Aminosilan beschichteten Deckgläser (Schritt 1.1.1) in eine mit Parafilm ausgekleidete Petrischale geben.
    2. 40 μL oder 150 μL für 12 mm bzw. 25 mm Deckgläser aus Dichlormethylsilan (DCMS) auf eine Seite des Deckglases pipettieren und die Lösung 5 min ruhen lassen.
    3. Die verbleibende Lösung aus dem Deckglas absaugen, 1 min lang in sterilem DIH2Owaschen und die reaktiven Deckgläser mit der Vorderseite nach oben auf ein Labortuch legen, um sie vollständig an der Luft zu trocknen, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
  3. Hydrogele zubereiten
    1. Mischen Sie Acrylamid, Bisacrylamid und DIH2Oin einem 1,5 ml Zentrifugenröhrchen, um 500 μL Lösungen mit unterschiedlichen Steifigkeiten herzustellen (siehe Tabelle 1). Vortex die Lösung für 30 s, um es gründlich zu mischen.
    2. Schnell arbeiten, die 10% ige Ammoniumpersulfatlösung (APS) und das Tetramethylethylendiamin (TEMED) in das Röhrchen geben und die Lösungen erneut verwirbeln, um die Lösungen zu mischen.
      HINWEIS: Bereiten Sie frisches 10% APS zu und lassen Sie es auf Eis oder gefrieren Sie es aufgrund seines empfindlichen Gefrier- / Auftauzyklus zu Einweg-Aliquots.
    3. Etwa 33 μL oder 100 μL der Lösung werden auf die getrockneten 12 mm bzw. 25 mm aminosilanbeschichteten Deckgläser pipettiert (Abschnitt 1.1).
    4. Legen Sie mit einer gekrümmten Pinzette sofort den DCMS-behandelten Deckglas auf die Gellösung, wobei die behandelte Seite die Gellösung berührt, wodurch die Gellösung zwischen dem DCMS-behandelten Deckglas und dem aminosilanbeschichteten Deckglas eingeklemmt wird.
    5. Lassen Sie die Gellösung für 5-15 min polymerisieren, während Sie aktiv auf die Gelpolymerisation der übrig gebliebenen Lösung im Röhrchen achten.
    6. Sobald das Gel polymerisiert ist, trennen Sie den DCMS-behandelten Deckglas mit einer gekrümmten Pinzette oder einer Rasierklinge, wobei das Gel an dem ursprünglichen aminosilanbeschichteten Deckglas befestigt bleibt.
    7. Legen Sie den Deckglas mit dem angebrachten Hydrogel sofort in eine vorgegebene 4-Well/24-Well- und 6-Well-Platte, die mit 500 μL und 2 mL sterilem PBS oder DI H2Ofür 12 mm bzw. 25 mm Deckgläser bedeckt ist, um ein Austrocknen des Gels zu verhindern.
    8. Wiederholen Sie die Schritte 1.3.4-1.3.7 für alle Deckgläser.
    9. Die Hydrogele werden 30 min lang in steriles PBS oder DIH2Ogetaucht, um überschüssige Acrylamidlösung zu entfernen. Lagern Sie die Hydrogele in sterilem PBS oder DIH2Obei 4 °C für einen Verfahrensstopp hier.
    10. In einem dunklen Raum wird das Sulfosuccinimidyl-6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino)-hexanoat(sulfo-SANPAH)-Gemisch hergestellt, indem 2,5 mL 50 mM 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethansulfonsäure(HEPES) (pH=8,5) mit 25 μL der 50 μg/ml Sulfo-SANPAH in einem konischen Röhrchen gemischt werden, das zum Schutz vor Licht in Aluminiumfolie eingewickelt ist. Verwenden Sie eine Pipette, um die Lösung vor der Verwendung gut zu mischen.
      HINWEIS: Ein Volumen von 2,5 ml Sulfo-SANPAH-Lösung reicht für etwa fünfundzwanzig 12-mm-Hydrogele oder fünf 25-mm-Hydrogele aus.
    11. Saugen Sie PBS oder DIH2Oaus der Vertiefungsplatte ab. Fügen Sie etwa 100 μL oder 500 μL für 12 mm bzw. 25 mm Deckgläser sulfo-SANPAH-Lösung (Schritt 1.3.10) hinzu, um das Gel zu bedecken. Stellen Sie sicher, dass die Lösung das Gel vollständig bedeckt.
      HINWEIS: Stellen Sie die Vakuumsaugstärke ein, um zu verhindern, dass die starke Kraft die Hydrogele zerreißt oder stört.
    12. Legen Sie die Gele mit der Lösung unter ein 15 W, 365 nm UV-Licht für 10 min, unbedeckt, um jede Interferenz des UV-Lichts, das mit dem Sulfo-SANPAH reagiert, zu minimieren.
    13. Aspirieren Sie das überschüssige Sulfo-SANPAH, indem Sie die Platte kippen, um so viel wie möglich von der Lösung zu sammeln. Waschen Sie das Gel mit 50 mM HEPES zwei- bis dreimal.
    14. 500 μL und 2 ml für 12 mm bzw. 25 mm Gele mit 50 mg/ml Kollagen I, verdünnt in 0,2 % Essigsäure, in jede Vertiefung geben, die das Hydrogel enthält. Lassen Sie die Gele über Nacht in einem 37 °C, 5% CO 2-Inkubator inkubieren.
      HINWEIS: Verdünnen Sie Kollagen I in 0,2% Essigsäure anstelle von 50 mM HEPES, um eine homogene Verteilung und Bindung von Kollagen I zu fördern.
    15. Aspirieren Sie das Kollagen I und waschen Sie die Gele dreimal mit sterilem PBS, um überschüssiges Kollagen I für 5 Minuten pro Wäsche zu entfernen. Inkubieren Sie die Hydrogele in PBS mit 10% Pferdeserum, 5% FBS für 2 h im 37 °C, 5%CO2 Inkubator.
      HINWEIS: Die Zugabe von 10% Pferdeserum fördert eine höhere Proliferation im Vergleich zur ausschließlichen Verwendung von FBS, wie in der vorherigen Veröffentlichung.
    16. Aspirieren Sie das Medium. Geben Sie 500 ml sterilfiltriertes Modifiziertes Eagle Medium (DMEM) von Dulbecco mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin (P/S) zu jeder Vertiefung hinzu. Lagern Sie die Gele im 37 °C, 5% CO2-Inkubator, bis sie für die Zellkultur bereit sind.
    17. Fertig, etwa 1,5 × 104 O9-1 Zellen/cm2 in Basalmedium in die Kulturschalen geben. Inkubieren Sie die Zellen für 2 Tage in einem Inkubator bei 37 ° C, 5%CO2. Überprüfen Sie die Zellen auf Konfluenz, um sicherzustellen, dass die Zellen ausreichend an Gele gebunden sind und dass die Anzahl der Zellen ausreicht, bevor Sie sie zur Analyse sammeln.
      HINWEIS: Siehe das zuvor veröffentlichte Protokoll für die Schritte der Wiederherstellung, Passage und Sammlung von O9-1-Zellen20.
    18. Fahren Sie mit den Abschnitten 2, 3 oder 4 fort, um die Hydrogele weiter zu analysieren.

2. Quantitative Analyse der Steifigkeit mittels AFM

  1. Starten Sie den AFM-Systemcomputer, gefolgt vom AFM-Controller (siehe Tabelle der Materialien).
  2. Montieren Sie den AFM-Freischwinger am AFM-Sondenhalter. Verwenden Sie einen sphärischen Cantilever mit einer 0,5 μm Silica-Perle, die am Ende des Cantilevers montiert ist (Cantilever mit kugelförmiger Perle).
    HINWEIS: Für steifere Hydrogele wie 10 kPa, 20 kPa und 40 kPa wurde eine steifere Sonde mit der Federkonstante von 0,24 N/m verwendet. Für weichere Hydrogele wie 0,5 kPa und 1 kPa wurde eine weichere Sonde mit einer Federkonstante von 0,059 N/m verwendet.
  3. Stellen Sie die AFM-Software in den Kontaktmodusein.
  4. Montieren Sie den Siliziumwafer auf dem AFM-Probentisch, um Kraftkurven zu sammeln, indem Sie auf Engage klicken, damit der Cantilever das Siliziumsubstrat berührt und so die Kraftkurven erzeugt.
  5. Verwenden Sie die oben genannten Kraftkurven (2.4) für die Kalibrierung, klicken Sie in der Steuerungssoftware auf Kalibrieren, um eine durchschnittliche Federkonstante des Cantilevers unter thermischen Tune-Bedingungen zu erhalten, und speichern Sie die kalibrierten Werte in der Steuerungssoftware.
  6. Montieren Sie die Proben, indem Sie den Deckglas mit dem angebrachten Hydrogel in einer 60-mm-Petrischale auf die AFM-Scanstufe legen. Geben Sie 3 ml PBS in die Schale, bevor Sie Messungen durchführen, um zu verhindern, dass das Gel austrocknet.
  7. Stellen Sie den AFM so ein, dass er im Kontaktmodus (Flüssigkeit) arbeitet, um die Messung zu starten. Aktivieren Sie die kugelförmige Perle, um die Gelprobe kontinuierlich zu berühren und zu heben.
  8. Stellen Sie den Ausleger so ein, dass seine Auslenkungsschwelle bei 10 nm bleibt. Halten Sie die Rampengröße der Sonde bei 10 μm. Notieren Sie dann die Kraftkurven wie in Schritt 2.4.
  9. Erfassen Sie mindestens 20 Kraftkurven von mindestens 3 bis 10 verschiedenen Stellen auf der Oberfläche des Hydrogels.
  10. Berechnen Sie den durchschnittlichen Elastizitätsmodul von ~ 20 Kraftkurven für jeden Punkt mit AFM-Bildgebungs- und Analysesoftware. Verwenden Sie verlängerte Rampenkraftkurven und ein linearisiertes Modell (sphärisch). Berechnen Sie den Durchschnitt aller Stellen für jede Probe, um die endgültige Steifigkeit zu erhalten.
    HINWEIS: Der Elastizitätsmodul und zugehörige Daten(d. h. Standardabweichungen) werden automatisch als Tabellenkalkulation gespeichert.
  11. Wiederholen Sie die Schritte 2.6-2.10 für alle Samples.

3. Molekulare Analyse der Steifigkeit durch Immunfluoreszenzfärbung

  1. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Deckglas auf eine neue Platte zu transportieren, um falsche Signale von Zellen zu minimieren, die direkt auf die Platte gezüchtet werden. Waschen Sie die Zellen dreimal mit 500 μL sterilem PBS, um abgestorbene Zellen und verbleibendes Kulturmedium zu entfernen.
  2. Fixieren Sie die Zellen mit 500 μL 4% Paraformaldehyd (PFA) für 10 min bei Raumtemperatur, ungestört. Dann waschen Sie die Zellen dreimal mit 500 μL PBS / Well für jeweils 2 min.
    HINWEIS: Für einen Verfahrensstopp bei 4 °C aufbewahren.
  3. Behandeln Sie die Zellen mit 500 μL 0,1% Triton X-100 für 15 min bei Raumtemperatur. Dann waschen Sie die Zellen dreimal mit 500 μL PBS / Well.
  4. Blockieren Sie die Zellen mit 250 μL 10% Eselserum (verdünnt in PBS und 0,1% Tween 20) pro Vertiefung für 30 min bei Raumtemperatur.
  5. Inkubieren Sie die Zellen mit 250 μL primären Antikörpern für 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C. Dann waschen Sie die Zellen dreimal mit 500 μL PBS / Well für jeweils 5 min.
    HINWEIS: Anti-Vinculin (Vcl) (1:250) und Anti-AP2 alpha (1:250) wurden in diesem Experiment verwendet und in 10% Eselserum verdünnt.
  6. Inkubieren Sie die Zellen mit entsprechenden sekundären Antikörpern und/oder Phalloidin, die für die F-Aktin-Färbung verwendet werden, bei einer Verdünnung von 1:400 in 250 μL 10% Eselserum für 30 min bei Raumtemperatur. Dann waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS für jeweils 5 Minuten.
    HINWEIS: 568 nm Phalloidin kann mit 488 nm oder 647 nm sekundären Antikörpern oder allein co-inkubiert werden.
  7. Inkubieren Sie die Zellen mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI, 1:1000 Verdünnung) in 250 μL PBS für 10 min, gefolgt von einer letzten Wäsche PBS für 2 min.
  8. Fügen Sie jedem Bohrloch 3-4 Tropfen Montagemedium hinzu. Lagern Sie die Proben bei 4 °C, um sie vor der Bildgebung für mindestens 2 h einzustellen, um sicherzustellen, dass das Montagemedium richtig eingestellt ist.
  9. Erfassen Sie Bilder von mindestens 3 zufälligen Bildern pro Hydrogelprobe mit einem Fluoreszenzmikroskop und erzeugen Sie einzelne und verschmolzene Kanäle.

4. Quantitative real-time PCR (RT-qPCR)

  1. Übertragen Sie die Hydrogele mit den adhärenten Zellen für die RNA-Sammlung auf eine neue Platte, um unerwünschte RNA von Zellen, die an die Zellplatte gebunden sind, zu minimieren. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS, um abgestorbene Zellen und Kulturmedium zu entfernen.
  2. Extrahieren Sie die gesamte mRNA mit einem RNA-Extraktionskit. Führen Sie die umgekehrte Transkription von RNA in cDNA mit einem Reverse-Transkriptions-Supermix gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.
  3. Führen Sie RT-qPCR mit Primern für Vcl als Steifigkeitsmarker der Wahl durch und analysieren Sie mit der 2-ΔΔCT-Methode.
    HINWEIS: Primer-Sequenz von Vcl: Forward 5' GCTTCAGTCAGACCCATACTCG 3'; reverse 5' AGGTAAGCAGTAGGTCAGATGT 3'.

Ergebnisse

Hydrogelvorbereitung und Steifigkeitsbewertung durch AFM und das Hertz-Modell
Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung von Polyacrylamid-Hydrogelen unterschiedlicher Steifigkeit bereitgestellt, indem das Verhältnis von Acrylamid und Bisacrylamid reguliert wird. Die Polyacrylamid-Hydrogele sind jedoch aufgrund des Mangels an ECM-Proteinen nicht bereit für die Adhäsion von Zellen. So bindet Sulfo-SANPAH, das als Linker fungiert, kovalent an die Hydrogele und reagiert mit den primären Amin...

Diskussion

Ziel der aktuellen Studie ist es, ein effektives und effizientes In-vitro-System bereitzustellen, um die Auswirkungen mechanischer Signale in NCCs besser zu verstehen. Zusätzlich zur Befolgung des oben genannten Schritt-für-Schritt-Protokolls müssen die Forscher bedenken, dass die Zellkultur von O9-1-NCCs von der Art der Glasdeckgläser beeinflusst wird, die zur Herstellung von Hydrogelen verwendet werden. Zum Beispiel wurde festgestellt, dass Zellen, die auf einer bestimmten Art von Glasdeckglas gesät wurde...

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken Dr. Ana-Maria Zaske, Betreiberin der Atomic Force Microscope-UT Core-Anlage am Health Sciences Center der University of Texas, für die in diesem Projekt beigebrachte Expertise in AFM. Wir danken auch den Finanzierungsquellen der National Institutes of Health (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704 und R01HL142704 an J. Wang).

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
12 mm #1 Corning 0211 Glass CoverslipChemglass Life SciencesCLS-1763-012
2% Bis-AcrylamideSigma AldrichM1533
24-well plateGreiner Bio-one662165
25 mm #1 Corning 0211 Glass CoverslipChemglass Life SciencesCLS-1763-025
3-aminopropyl triethoxysilane (APTS)Sigma AldrichA3648
4-well cell culture plateThermo Scientific179830
4% ParaformaldehydeSigma AldrichJ61899-AP
40% AcrylamideSigma AldrichA4058
50% glutaraldehydeSigma AldrichG7651
6-well cell culture plateGreiner Bio-one657160
AFM cantilever (spherical bead)Novascan
AFM softwareCatalyst NanoScopeModel: 8.15 SR3R1
Alexa Fluor 488 PhalloidinThermo FisherA12379
Ammonium Persulfate (APS)Sigma Aldrich248614Powder
anti-AP-2α AntibodySanta Cruzsc-12726
anti-Vinculin antibodyAbcamab129002
Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope CatalystBruker Corporation
Collagen type I (100mg)Corning354236
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)Thermo FisherD1306
Dichloromethylsilane (DCMS)Sigma Aldrich440272
Donkey serumSigma AldrichD9663
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Corning10-017-CV
Fetal bovine serum (FBS)Corning35-010-CV
Fluorescence microscopeLeicaModel DMi8
Fluoromount-G mounting mediumSouthernBiotech0100-35
HEPESSigma AldrichH3375Powder
Horse serumCorning35-030-CI
iScript Reverse Transcription SupermixBio-Rad1708841
Penicillin-Streptomycin antibioticThermo Fisher15140148
RNeasy micro kitQiagen74004
Sterile 1x PBSHycloneSH30256.02
Sterile deionized waterHardy DiagnosticsU284
sulfo-SANPAHThermo Fisher22589
SYBR greenApplied Biosystems4472908
TEMEDSigma AldrichT9281
Triton X-100Sigma AldrichX100
Tween 20Sigma AldrichP9416

Referenzen

  1. Mehrotra, P., Tseropoulos, G., Bronner, M. E., Andreadis, S. T. Adult tissue-derived neural crest-like stem cells: Sources, regulatory networks, and translational potential. Stem Cells Translational Medicine. 9 (3), 328-341 (2020).
  2. Liu, J. A., Cheung, M. Neural crest stem cells and their potential therapeutic applications. Developmental Biology. 419 (2), 199-216 (2016).
  3. Watt, K. E. N., Trainor, P. A., Trainor, P. A. Neurocristopathies: the etiology and pathogenesis of disorders arising from defects in neural crest cell development. Neural Crest Cells-Evolution, Development and Disease. , 361-394 (2014).
  4. Lavelle, C. L. B. . Applied oral physiology. , (1988).
  5. Chin, L. The genetics of malignant melanoma: lessons from mouse and man. Nature Reviews Cancer. 3 (8), 559-570 (2003).
  6. Hindley, C. J., et al. The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
  7. Wang, Q., et al. Perturbed development of cranial neural crest cells in association with reduced sonic hedgehog signaling underlies the pathogenesis of retinoic-acid-induced cleft palate. Disease Models & Mechanisms. 12 (10), (2019).
  8. Rocha, M., Singh, N., Ahsan, K., Beiriger, A., Prince, V. E. Neural crest development: insights from the zebrafish. Developmental Dynamics. 249 (1), 88-111 (2020).
  9. Barriga, E. H., Franze, K., Charras, G., Mayor, R. Tissue stiffening coordinates morphogenesis by triggering collective cell migration in vivo. Nature. 554 (7693), 523-527 (2018).
  10. Weber, G. F., Bjerke, M. A., DeSimone, D. W. A mechanoresponsive cadherin-keratin complex directs polarized protrusive behavior and collective cell migration. Developmental Cell. 22 (1), 104-115 (2012).
  11. Mason, D. E., et al. YAP and TAZ limit cytoskeletal and focal adhesion maturation to enable persistent cell motility. Journal of Cell Biology. 218 (4), 1369-1389 (2019).
  12. Dupont, S., et al. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction. Nature. 474 (7350), 179-183 (2011).
  13. Lu, Y. -. B., et al. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (47), 17759-17764 (2006).
  14. Georges, P. C., Miller, W. J., Meaney, D. F., Sawyer, E. S., Janmey, P. A. Matrices with compliance comparable to that of brain tissue select neuronal over glial growth in mixed cortical cultures. Biophysical Journal. 90 (8), 3012-3018 (2006).
  15. Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. Journal of Cell Science. 124 (1), 9-18 (2011).
  16. Engler, A., Sweeney, H., Discher, D., Schwarzbauer, J. E. Extracellular matrix elasticity directs stem cell differentiation. Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions. 7 (4), 335 (2007).
  17. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
  18. Engler, A. J., et al. Embryonic cardiomyocytes beat best on a matrix with heart-like elasticity: scar-like rigidity inhibits beating. Journal of Cell Science. 121 (22), 3794-3802 (2008).
  19. Robling, A. G., Turner, C. H. Mechanical signaling for bone modeling and remodeling. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 19 (4), 319-338 (2009).
  20. Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current Protocols in Cell Biology. , (2010).
  21. Cretu, A., Castagnino, P., Assoian, R. Studying the effects of matrix stiffness on cellular function using acrylamide-based hydrogels. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2089 (2010).
  22. Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
  23. Engler, A., et al. Substrate compliance versus ligand density in cell on gel responses. Biophysical Journal. 86 (1), 617-628 (2004).
  24. Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. Varying solvent type modulates collagen coating and stem cell mechanotransduction on hydrogel substrates. APL Bioengineering. 3 (3), 036108 (2019).
  25. Fedoroff, S., Hall, C. Effect of horse serum on neural cell differentiation in tissue culture. In vitro. 15 (8), 641-648 (1979).
  26. Huth, S., Sindt, S., Selhuber-Unkel, C. Automated analysis of soft hydrogel microindentation: Impact of various indentation parameters on the measurement of Young's modulus. PLoS One. 14 (8), 0220281 (2019).
  27. Mitchell, P. J., Timmons, P. M., Hébert, J. M., Rigby, P., Tjian, R. Transcription factor AP-2 is expressed in neural crest cell lineages during mouse embryogenesis. Genes & Development. 5 (1), 105-119 (1991).
  28. Wegner, M. Neural crest diversification and specification: transcriptional control of Schwann Cell differentiation. Encyclopedia of Neuroscience. , 153-158 (2010).
  29. Park, J. S., et al. The effect of matrix stiffness on the differentiation of mesenchymal stem cells in response to TGF-β. Biomaterials. 32 (16), 3921-3930 (2011).
  30. Sun, M., et al. Effects of matrix stiffness on the morphology, adhesion, proliferation and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. International Journal of Medical Sciences. 15 (3), 257 (2018).
  31. Burridge, K., Guilluy, C. Focal adhesions, stress fibers and mechanical tension. Experimental Cell Research. 343 (1), 14-20 (2016).
  32. Burridge, K. Focal adhesions: a personal perspective on a half century of progress. The FEBS Journal. 284 (20), 3355-3361 (2017).
  33. Zhou, C., et al. Compliant substratum modulates vinculin expression in focal adhesion plaques in skeletal cells. International Journal of Oral Science. 11 (2), 1-9 (2019).
  34. Fernández, J. L. R., Geiger, B., Salomon, D., Ben-Ze'ev, A. Overexpression of vinculin suppresses cell motility in BALB/c 3T3 cells. Cell Motility and the Cytoskeleton. 22 (2), 127-134 (1992).
  35. Coll, J., et al. Targeted disruption of vinculin genes in F9 and embryonic stem cells changes cell morphology, adhesion, and locomotion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9161-9165 (1995).
  36. Saunders, R. M., et al. Role of vinculin in regulating focal adhesion turnover. European Journal of Cell Biology. 85 (6), 487-500 (2006).
  37. Kuo, J. -. C. Focal adhesions function as a mechanosensor. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 126, 55-73 (2014).
  38. Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58346 (2018).
  39. Kolewe, K. W., Zhu, J., Mako, N. R., Nonnenmann, S. S., Schiffman, J. D. Bacterial adhesion is affected by the thickness and stiffness of poly (ethylene glycol) hydrogels. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (3), 2275-2281 (2018).
  40. Lin, Y. -. C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical Review E. 82 (4), 041918 (2010).
  41. Mullen, C. A., Vaughan, T. J., Billiar, K. L., McNamara, L. M. The effect of substrate stiffness, thickness, and cross-linking density on osteogenic cell behavior. Biophysical Journal. 108 (7), 1604-1612 (2015).
  42. Tusan, C. G., et al. Collective cell behavior in mechanosensing of substrate thickness. Biophysical Journal. 114 (11), 2743-2755 (2018).
  43. McBurney, M. W., Jones-Villeneuve, E. M., Edwards, M. K., Anderson, P. J. Control of muscle and neuronal differentiation in a cultured embryonal carcinoma cell line. Nature. 299 (5879), 165-167 (1982).
  44. Hasegawa, A., Shirayoshi, Y. P19 cells overexpressing Lhx1 differentiate into the definitive endoderm by recapitulating an embryonic developmental pathway. Yonago Acta Medica. 58 (1), 15 (2015).
  45. Wells, R. G. Tissue mechanics and fibrosis. Biochimica et Biophysica Acta. 1832 (7), 884-890 (2013).
  46. Gavara, N. A beginner's guide to atomic force microscopy probing for cell mechanics. Microscopy Research and Technique. 80 (1), 75-84 (2017).
  47. Butler, J. P., Tolic-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
  48. Leong, W. S., et al. Thickness sensing of hMSCs on collagen gel directs stem cell fate. Biochemical and Biophysical Research Communications. 401 (2), 287-292 (2010).
  49. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  50. Funaki, M., Janmey, P. A. Technologies to engineer cell substrate mechanics in hydrogels. Biology and Engineering of Stem Cell Niches. , 363-373 (2017).

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