Ein Hochdurchsatz-Mikroplatten-Feeder-Assay zur Quantifizierung des Verbrauchs in Drosophila

Zusammenfassung

Der Microplate-Feeder-Assay bietet eine wirtschaftliche Methode mit hohem Durchsatz zur Quantifizierung des Verbrauchs flüssiger Lebensmittel in Drosophila. Ein 3D-gedrucktes Gerät verbindet eine 96-Well-Mikroplatte, in der Fliegen untergebracht sind, mit einer 1536-Well-Mikroplatte, von der Fliegen eine Fütterungslösung mit einem Tracerfarbstoff verbrauchen. Der Volumenrückgang der Lösung wird spektralphotometrisch gemessen.

Zusammenfassung

Die Quantifizierung der Nahrungsaufnahme in Drosophila wird verwendet, um die genetischen und physiologischen Grundlagen von konsumbedingten Merkmalen, ihre Umweltfaktoren und die toxikologischen und pharmakologischen Wirkungen zahlreicher Substanzen zu untersuchen. Nur wenige derzeit implementierte Methoden sind für Messungen mit hohem Durchsatz nutzbar. Der Microplate Feeder Assay (MFA) wurde entwickelt, um den Verzehr von flüssiger Nahrung für einzelne Fliegen mittels Absorption zu quantifizieren. In diesem Assay konsumieren Fliegen flüssiges Nahrungsmedium aus ausgewählten Vertiefungen einer 1536-Well-Mikroplatte. Durch die Einarbeitung eines verdünnten Tracerfarbstoffs in das flüssige Lebensmittelmedium und das Laden eines bekannten Volumens in jede Vertiefung spiegeln Absorptionsmessungen der vor und nach dem Verzehr erworbenen Vertiefung die resultierende Volumenänderung (d. H. Verbrauchtes Volumen) wider. Um eine Hochdurchsatzanalyse mit dieser Methode zu ermöglichen, wurde ein 3D-gedruckter Koppler entwickelt, mit dem Fliegen einzeln in 96-Well-Mikroplatten sortiert werden können. Dieses Gerät richtet 96- und 1536-Well-Mikroplatten präzise aus, um jeder Fliege Zugang zu bis zu 4 Brunnen für den Verzehr zu geben und so zusätzlich zum regelmäßigen Verzehr eine Quantifizierung der Lebensmittelpräferenz zu ermöglichen. Darüber hinaus verfügt das Gerät über Barrierestreifen, die zwischen offenen und geschlossenen Positionen umschalten, um eine kontrollierte Eindämmung und Freigabe einer Probensäule gleichzeitig zu ermöglichen. Diese Methode ermöglicht Hochdurchsatzmessungen des Verbrauchs von wässrigen Lösungen durch viele Fliegen gleichzeitig. Es hat auch das Potenzial, an andere Insekten angepasst zu werden und den Verbrauch von Nährstoffen, Toxinen oder Pharmazeutika zu überprüfen.

Einleitung

Drosophila melanogaster hat eine breite Verwendung als genetischer Modellorganismus gesehen, um die biologischen Grundlagen der Nahrungsaufnahme und die mit dem Verzehr verbundenen Merkmale zu untersuchen¹. Es wird geschätzt, dass 65% der menschlichen krankheitserregenden Gene funktionelle Homologe in Fliegen haben, wobei ein signifikanter Anteil davon in funktionell äquivalenten Geweben zwischen Fliegen und Menschen exprimiert wird². Darüber hinaus machen D. melanogasters Größe, kurze Intergenerationszeit, einfache Wartung und genetische Traktierbarkeit es zu^einemattraktiven Modell für Studien über den Verbrauch von^{Nährstoffen 3,4} und toxikologische und pharmakologische Wirkungen einer Vielzahl von Substanzen, einschließlich Insektizide⁵, Schadstoffe⁶, Pharmazeutika 7 und Missbrauchsdrogen^8,9,10.

In vielen Fällen erfordert die Untersuchung solcher Merkmale eine genaue Quantifizierung des Verbrauchs. Die Methoden zur Quantifizierung des Verbrauchs sind vielfältig und umfassen den CApillary FEeder (CAFE) Assay¹¹, den MAnual FEeding (MAFE) Assay¹², Proboscis Extension Response (PER) Assay¹³, tracer dye extraction^14,15, Oligonucleotid tracer extraction¹⁶und Radioisotopenextraktion^5,17. Jüngste Bemühungen haben sich darauf konzentriert, den Durchsatz dieser Assays zu verbessern, wie im Expresso Assay¹⁸ oder dem plattenbasierten Whole Animal Feeding FLat (WAFFL) System¹⁹. Trotz ihres Nutzens können diese Assays kompliziert, kostspielig oder arbeitsintensiv sein und ihre Verwendung in Hochdurchsatzstudien behindern.

Abbildung 1: Komponenten des Microplate Feeder Assay. (A) 3D-Rendering des zusammengesetzten Microplate Feeder Assays. Die 1536-Well-Mikroplatte wird durch den 3D-gedruckten Koppler so ausgerichtet, dass jede Vertiefung der unteren 96-Well-Mikroplatte Zugang zu vier Vertiefungen der oberen 1536-Well-Mikroplatte hat. Der Zugang zu den Vertiefungen kann durch Einstellen der Position der durch die Kupplung geschlitzten Barrierestreifen gesteuert werden. (B) Eine grafische Darstellung jeder Vertiefung des Mikroplatten-Feeder-Assays. Verbrauchslösungen werden in jedem Bohrloch mit einer Dichtungsfolie zurückgehalten, die perforiert wurde, um den Zugang der Fliege zu ermöglichen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Überblick über die Verfahren im Microplate Feeder Assay. Die Abbildung zeigt ein Flussdiagramm, das den Schritten 4.1-5.8 des Protokolls entspricht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Um diese Hürden zu überwinden, hat der Microplate Feeder Assay (MFA; Abbildung 1) wurde entwickelt. Bei diesem Assay werden Fliegen einzeln in 96-Well-Mikroplatten untergebracht. Jede Mikroplatte wird mit einem 1536-Well-Mikrotiterplatten mit einem benutzerdefinierten, 3D-gedruckten Gerät gekoppelt. Das Gerät richtet die beiden Platten präzise so aus, dass jede Fliege in ihrem jeweiligen Brunnen der 96-Well-Platte Zugang zu 4 Wells der 1536-Well-Mikroplatte hat. Durch die Verwendung einer bodenlosen 1536-Well-Platte und Dichtungsfolien werden Lösungen in ausgewählte Vertiefungen dosiert und mit präzisen Nadeln mit einem Durchmesser von 0,25 mm perforiert, um den Zugang zu den Fliegen zu ermöglichen. Entscheidend ist, dass der Verbrauch direkt von einer Mikroplatte aus sofortige absorptionsbasierte Messungen mit einem Mikroplattenleser ermöglicht. Ein verdünnter Tracerfarbstoff wird in das Verbrauchsmedium eingearbeitet, und die Änderung der Absorption nach der Exposition wird verwendet, um das verbrauchte Volumen zu bestimmen (Abbildung 2 und Abbildung 3). Da die Flüssigkeit in jeder Vertiefung einer Flüssigkeitssäule annähert, manifestieren sich volumetrische Unterschiede als Höhenunterschiede der Säule. (Abbildung 3A) Gemäß dem Beer-Lambert-Gesetz²⁰:

wobei A die Absorption ist, ε der molare Absorptionskoeffizient für den dämpfenden Analyten, l die optische Weglänge und c die Konzentration des dämpfenden Analyten ist. Bei konstantem molaren Absorptionskoeffizienten und Konzentration sind Absorptionsänderungen also ausschließlich auf Änderungen des optischen Lichtwegs, d.h. des Flüssigkeitsspiegels innerhalb einer gegebenen Vertiefung, zurückzuführen. Durch die Messung der Absorption vor und nach der Exposition spiegelt die proportionale Änderung der Absorption die proportionale Volumenänderung wider (Abbildung 3B).

Abbildung 3: Absorptionsbasierte Quantifizierung des Bohrmengenvolumens. (A) Einfallendes Licht bekannter Eingangsintensität (I₀) durchquert jede Vertiefung. Die Dämpfung von Licht bei unterschiedlichen Füllvolumina ergibt unterschiedliche Ausgangsstärken (I), die eine lineare Beziehung zwischen Volumen und Absorption aufweisen. (B) Empirische Messung der Absorption vs. des Volumens. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Basierend auf der Volumenänderung kann die Menge einer aufgenommenen Verbindung aus ihrer bekannten Konzentration in der Fütterungslösung berechnet werden. Die für den Assay benötigten Teile sind kostengünstig und haben einen hohen Grad an Wiederverwendbarkeit, wodurch die wiederkehrenden Kosten des Assays erheblich reduziert werden. Somit bietet dieses Verfahren eine kostengünstige Methode mit hohem Durchsatz, um den Verbrauch präzise zu quantifizieren.

Protokoll

1. Vorbereitung der Hungerplatte

1. 1,5 g Agarose in ein 250 ml Glasbecherglas wiegen.
2. 100 ml destilliertes_H2Oin das Becherglas geben.
3. Mikrowelle intermittierend, bis Agarose vollständig geschmolzen ist.
   HINWEIS: Beobachten Sie das Becherglas, da die Agarose zum Überkochen neigt.
4. Gießen Sie die geschmolzene Agarose in einen Reagenztrog und dosieren Sie 80 μL geschmolzene Agarose mit einer Mehrkanalpipette in jede Vertiefung einer 96-Well-Mikroplatte. Lassen Sie die Platten aushärten, während sie bei Raumtemperatur bedeckt sind. Kühlen Sie die übrig gebliebene Agarose bis zu einer Woche in einem versiegelten Beutel und schmelzen Sie sie für die Herstellung zusätzlicher Platten wieder auf.

2. Fliegensortierung und Hunger

1. Bereiten Sie Kupplungen vor, indem Sie Barrierestreifen in die Barrierestreifenkanäle einführen. Wenn Barrierestreifen zu locker sind, wickeln Sie sie um den Finger, um ihnen eine Krümmung zu geben, um sie in den Kanälen zu halten.
2. Befestigen Sie die Kupplung an einer Hungerplatte. Verwenden Sie den Koppler nicht, um die Platte zu manipulieren, da der Kupplungsgeber abrutschen kann. Stellen Sie sicher, dass die Koppler richtig ausgerichtet sind (d. h. stellen Sie sicher, dass die abgewinkelte Ecke des Kopplers mit der abgewinkelten Ecke der Mikroplatte übereinstimmt).
3. Unter CO₂ Anästhesie (Materialtabelle) sortieren Sie 3-5 Tage alte Fliegen. Laden Sie einzelne Fliegen per Säule in die Hungerplatte.
   HINWEIS: Obwohl Fliegen nach Spalten geladen werden, wird empfohlen, Gruppen von Proben in Reihen der Platte und nicht in Spalten nach unten zu verteilen (siehe Abbildung 4 für ein Beispiel für das Plattenlayout).
4. Schließen Sie jede Spalte, während sie sich füllt, indem Sie ihren Barrierestreifen an die geschlossene Position anpassen.

Abbildung 4: Repräsentatives Layout der Hungerplatte. Das Diagramm zeigt die Organisation von Verdunstungskontrollen und männlichen und weiblichen Fliegen in einer 96-Well-Platte, die in dieser Studie verwendet wurde. Alternative Konfigurationen, einschließlich abwechselnder Reihen von Männchen und Weibchen mit Verdunstungskontrollen in den Reihen A und H, können ebenfalls verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

5. Zeichnen Sie das Probenlayout innerhalb der Mikroplatte sorgfältig auf. Sobald die Hungerplatte gefüllt ist, lassen Sie die Fliegen sich nach dem Entfernen des CO₂ spontan erholen und verhungern Sie sie für 6 h ab ihrer anfänglichen Betäubungszeit.

3. Flüssige Lebensmittelzubereitung

HINWEIS: Machen Sie flüssige Lebensmittel jeden Tag frisch.

1. Bereiten Sie eine 10 mg / ml Farbstoffstofflösung von FD & C Blue # 1 in destilliertem H₂O vor.
   HINWEIS: Diese kann bis zu 6 Monate bei Raumtemperatur gelagert werden.
2. Bereiten Sie 10 ml flüssige Nahrung (4% Saccharose, 1% Hefeextrakt, 40 μg / ml FD & C Blue # 1) in einem 15 mL konischen Röhrchen vor, indem Sie 0,4 g Saccharose und 0,1 g Hefeextrakt in 10 ml destilliertem_H2O auflösen. Fügen Sie 40 μL Farbstofflösung hinzu und kehren Sie das Röhrchen wiederholt um, um die Lösung zu homogenisieren.
3. Die flüssigen Lebensmittel werden in eine 10-ml-Spritze mit einem 0,45-μm-Filter gegeben. Filtern Sie ~1,5 ml der Lösung gleichzeitig in ein 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Legen Sie die Spritze mit der Lösung beiseite und filtern Sie die zusätzliche Lösung nach Bedarf während der Zubereitung der Zuführplatte.

4. Zubereitung der Zuführplatte

HINWEIS: Behandeln Sie die Feederplatten nach dem Füllen vorsichtig, um die Bildung von Blasen oder Tröpfchen im Brunnen zu verhindern, die die Absorptionswerte beeinflussen könnten.

1. Bereiten Sie eine Zuführplatte vor, indem Sie den Boden einer 1536-Well-Mikroplatte mit einer Dichtfolie versiegeln. Verwenden Sie ein Dichtungspaddel, um gründlich an der Folie zu haften. Schneiden Sie überschüssigen Film mit einer Rasierklinge vom linken und rechten Rand ab.
2. Dosieren Sie 10 μL des gefilterten flüssigen Lebensmittels säulenweise (siehe Abbildung 5 zur Veranschaulichung) in die entsprechenden Vertiefungen der 1536-Well-Mikroplatte. Geben Sie für jeden Cluster von vier Bohrungen in die obere linke Vertiefung (siehe Abbildung 5 zur Veranschaulichung).

Abbildung 5:Füllauftrag und Bohrplatzposition für die 1536-Well-Zuführplatte. Das Diagramm veranschaulicht Schritt 4.2 des Protokolls. Pfeile zeigen die Reihenfolge, in der die Zuführlösung von Spalte 1 bis 12 säule für 1 in die Zuführplatte eingebracht wird. Die Probe B1 wird vergrößert, um ein Beispiel für die Lage der Fütterungslösungen für 1-Choice- und 2-Choice-Assays zu zeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3. Sobald alle Vertiefungen gefüllt sind, tragen Sie eine Dichtungsfolie auf die Oberseite der Platte auf. Verwenden Sie ein Dichtungspaddel, um gründlich an der Folie zu haften. Schneiden Sie überschüssigen Film mit einer Rasierklinge vom linken und rechten Rand ab. Wiederholen Sie den Vorgang für die gewünschte Anzahl von Platten.
4. Zentrifuge die Platten bei 200 x g für 10 s, um die Flüssigkeit abzulegen. Lassen Sie die Platte nicht kühlen, da sich dadurch Kondensation in den Vertiefungen ansammeln und die Absorptionswerte verdecken kann.

5. Exposition

1. Sobald die Fliegen für den Verzehrstest bereit sind, perforieren Sie die Vertiefungen auf der Oberseite der Platte mit dem Nadelsondenwerkzeug, das mit einer Nadel mit einem Durchmesser von 0,25 mm ausgestattet ist. Verwenden Sie die gleiche Reihenfolge zum Perforieren, die beim Dosieren der Lösungen verwendet wurde. Drehen Sie die Platte um und perforieren Sie die Vertiefungen auf der Unterseite. Wischen Sie die Nadel zwischen den Lösungen ab, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Achten Sie darauf, die Perforationen nicht zu berühren, da dies die Lösung aus den Vertiefungen ableitt.
2. Lesen Sie die Absorption der Platte bei 630 nm ohne Deckel ab.
3. Legen Sie einen internen Deckel auf die obere Dichtungsfolie, um sicherzustellen, dass die Kondensationsringe die perforierten Vertiefungen umgeben. Legen Sie den außenwirtschaftlichen Deckel auf die Platte.
4. Legen Sie die Zuführplatte mit der Vorderseite nach oben auf die Kupplung, so dass die Führungen die entsprechenden Löcher der Zuführplatte und der Hungerplatte ausrichten. Stellen Sie sicher, dass die Kupplung und die Platten richtig ausgerichtet sind (d. h. stellen Sie sicher, dass die abgewinkelte Ecke der Kupplung und die Platten übereinstimmen). Wickeln Sie elastische Bänder um die obere und untere Platte, um die Kupplung zusammenzuhalten. Prüfen Sie die Ausrichtung und Lücken zwischen Zuführplatte und Kupplung.
5. Sobald alle Zuführplatten auf die Kupplungen geladen sind, öffnen Sie die Vertiefungen für die Platten, indem Sie die Barrierestreifen an der Kupplung einstellen. Legen Sie die Koppler-/Plattenbaugruppen in den Sekundärbehälter. Jeder sekundäre Container kann bis zu sechs Baugruppen aufnehmen.
6. Legen Sie die untere Hälfte einer Pipettenbox mit eingeweichten Papiertüchern in jeden sekundären Behälter, um Feuchtigkeit zu liefern. Schließen Sie den Deckel der Sekundärbehälter und bringen Sie sie in eine kontrollierte Umgebung (25 °C, feuchtigkeitsgesteuert, 12 h Hell-Dunkel-Zyklen). Lassen Sie die Fliegen für 22 h verbrauchen.
7. Überprüfen Sie nach der 22-h-Belichtung jede Platte auf tote Fliegen und aktualisieren Sie das Plattenlayout entsprechend. Nachdem alle Platten überprüft wurden, betäuben Sie die Fliegen massenhaft, indem Sie CO₂ in den Sekundärbehälter pumpen. Stellen Sie nach ~ 60 s sicher, dass alle Fliegen immobilisiert sind. Dämpfen Sie die Fliegen vorsichtig in die Hungerplatte und ersetzen Sie die Kunststoffbarrierestreifen. Entfernen Sie die Zuführungsplatten zum Lesen.
8. Lesen Sie die Absorption der Platte bei 630 nm erneut ab. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Platten gelesen wurden.

6. Datenanalyse

HINWEIS: Die Analyse kann mit dem bevorzugten Softwarepaket des Prüfers durchgeführt werden.

1. Lassen Sie alle Fliegen weg, die während der 22-Stunden-Exposition gestorben sind.
2. Berechnen Sie für jede Vertiefung das verbrauchte Volumen wie:
   
   C - Verbrauchtes Volumen (μL)
   V - Anfangsbrunnenvolumen (d. h. 10 μL)
   ABS₀ - Absorption vor der Exposition
   ABS₁ - Absorption nach der Exposition
   HINWEIS: Der Verbrauch wird in der Berechnung als positives Volumen bezeichnet.
3. Um die Verdunstung zu berücksichtigen, subtrahieren Sie das mittlere Verdunstungsvolumen von den Fliegenverbrauchswerten innerhalb der jeweiligen Platten. Für 2-Wahl-/Präferenztests passen Sie jede Bohrung nach ihrer jeweiligen Lösung an,z. B."Auswahl 1" -Vertiefungen durch "Wahl 1" in den Verdampfungssteuerungen.
4. Lassen Sie nach der Anpassung an die Verdampfung alle Proben mit einem Verbrauchswert kleiner als Null fallen.
5. Berechnen Sie für 2-Auswahl-Tests die Präferenz für jede Vertiefung wie:
   
   P - Präferenzindex (positive Richtung zeigt Präferenz an)
   F_A - Volumen der konsumierten flüssigen Lebensmittel, die Zusatzstoff enthalten (Auswahl 2)
   F_N - Volumen der normalen flüssigen Nahrung (Auswahl 1)

7. Mikroplatte und KopplerWaschprotokoll.

HINWEIS: Achten Sie darauf, Schäden an den Unterseiten der Mikroplatten zu vermeiden, da Schäden die Versiegelung beeinträchtigen können.

1. Entfernen Sie die Filme und Etiketten von den 1536-Well-Mikroplatten. Trennen Sie die Kupplungen und Barrierestreifen. Legen Sie die Barrierestreifen in einen verschließbaren Behälter, z. B. eine Flasche. Waschen Sie die Barrierestreifen durch kräftiges Schütteln in einer Reihe von warmem Leitungswasser, milder Reinigungslösung, warmem Leitungswasser und dann destilliertem_H2O.
2. 1536-Well-Mikroplatten und Kupplungen unter warmem Leitungswasser abspülen. Für Mikroplatten führen Sie Leitungswasser durch die Brunnen jeder Mikroplatte, um so viel Lösung und Schmutz wie möglich zu entfernen. Verwenden Sie bei Bedarf eine Pipettenspitze, um Ablagerungen zu entfernen. Verwenden Sie keine Metall- oder Glasutensilien auf den Platten.
3. Decken Sie jede Platte und Kupplung mit einer milden Reinigungsmittellösung (z. B. 1% v/ v Aquet) ab. Für die Platten schrubben Sie die Oberflächen mit einer behandschuhten Hand. Verwenden Sie für die Kupplungen eine Bürste.
4. Spülen Sie jede Platte gründlich mit Leitungswasser und dann mit destilliertem H₂O. Stellen Sie sicher, dass die Brunnen speziell unter dem Wasserstrom ausgespült werden.
5. Lassen Sie die Platten und Kupplungen abgedeckt bei Raumtemperatur an der Luft trocknen. Bis zum Gebrauch in einem sauberen Aufbewahrungsbehälter aufbewahren.
   HINWEIS: Behandeln Sie die 1536-Well-Mikroplatten niemals ohne Handschuhe. Restöle aus der Haut können die Versiegelung behindern, was zu Leckagen und Verdunstung führt.

Ergebnisse

Um festzustellen, ob Korrelationen zwischen den Vertiefungen einzelner Platten bestehen, wurde die Verdampfung für jede Bohrung quantifiziert (n = 96 Vertiefungen/Platte für drei Platten). Die Verdampfung betrug -0,036 μL ± 0,003 μL (mittlere ± REM durchgehend). (Abbildung 6A) Pearson-Korrelationen wurden berechnet, um Trends zwischen Verdunstung und Bohrstandorten zu bewerten. Der Korrelationskoeffizient (Abbildung 6B, C) für Verdampfung versus Zeilen betrug -0,04 (p = 0,4949) und für Verdampfung vs. Spalten -0,23 (p = 0,0001). Die Gruppen wurden anschließend auf die Spalten verteilt, um die milden, aber statistisch signifikanten Korrelationen zwischen den Spalten zu mildern.

Abbildung 6: Verdunstung im MFA. (A) Dichteverteilung der Verdampfung ändert sich mit mittlerer ± SD, die durch die gestrichelte Linie angezeigt wird. Korrelationen zwischen Verdampfung und Zeilen (B) oder Spalten (C) mit dem Pearson-Korrelationskoeffizienten und dem p-Wert wie angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Um die Gültigkeit des Protokolls festzustellen, wurde der Verbrauch für 3-5 Tage alte Canton-S B-Fliegen quantifiziert (n = 36/Geschlecht/Platte und n = 24 Verdunstungskontrollen/Platte für drei Platten) (Abbildung 7). Die Verdampfung zwischen den Kontrollbohrungen unterschied sich signifikant von Null (-0,030 μL ± 0,006 μL, p = 4,81 x 10^-6;eine Probe t-Test vs. Null). Zwei Proben (beide männlich) wurden aus dem Datensatz weggelassen, eine aufgrund des Todes während der nächtlichen Exposition und die andere aufgrund eines negativen Verbrauchswerts nach Anpassung an die Verdunstung. Dies ergab eine > 99% Probenretentionsrate.

Abbildung 7: Verbrauchsquantifizierung mit dem MFA. (A) Der Verbrauch wurde mit einer speziell angefertigten Glaskammer visualisiert. Es wurde beobachtet, wie Fliegen aus perforierten Vertiefungen tranken und nach der Einnahme der gefärbten Lösung blaue Bauchfärbungen zeigten. Siehe auch Ergänzendes Video S.1. (B) Verbrauchswerte (mittlere ± REM) zwischen Verdunstungskontrollen, männlichen Fliegen und weiblichen Fliegen. Für statistische Vergleiche wurde ein paarweiser Post-hoc-t-Testmit ungleicher Varianz durchgeführt, wobei die Signifikanz durch Balken angegeben wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Anschließend wurde ein ANOVA-Modell (Analysis of Variance) konstruiert, wie es durch Y = μ + S + P + SxP + e beschrieben wird, mit Y als Gruppenmittelwert, μ als Gesamtmittelwert, S als fester Effekt des Geschlechts, P als fester Effekt der Platte, SxP als Interaktion zwischen Geschlecht und Platte und e als Restvariabilität. ANOVA zeigte keine signifikante Plate-to-Plate-Variabilität (p = 0,671) oder geschlechtsspezifische Interaktionen mit Platten (p = 0,104) für den Konsum, während Sex allein signifikant zur beobachteten Variation des Konsums beitrug (p = 4,17 x 10^-18). Ein Post-hoc-t-Testzeigte, dass Männer signifikant weniger konsumierten als Frauen (0,500 μL ± 0,017 μL vs. 0,811 μL ± 0,028 μL, p = 1,13 x 10^-17,zwei Proben t-Test mit ungleicher Varianz).

Um zu zeigen, dass der Assay für die Zwei-Wahl-Präferenzquantifizierung verwendet werden kann, wurde den Fliegen die Wahl zwischen einer 4% igen Saccharoselösung mit 1% Hefeextrakt und einer 4% igen Saccharoselösung mit 15% Ethanol und 1% Hefeextrakt gegeben. Sowohl Männer als auch Frauen zeigten eine überwältigende Präferenz für die Lösung mit Ethanol und Hefeextrakt mit Präferenzindizes von 0,974 ± 0,026 für Männer und 0,876 ± 0,06 für Frauen (durchschnittliche ± REM) (Abbildung 8).

Abbildung 8: Präferenzquantifizierung mit dem MFA. Verzehr von 4% Saccharose gegenüber 4% Saccharose ergänzt mit 15% Ethanol und Hefeextrakt für männliche und weibliche Fliegen (n = 33 für jedes Geschlecht). Männliche Fliegen verbrauchten mehr Ethanollösung als die Kontrollscharoselösung (0,511 μL ± 0,029 μL gegenüber 0,00 μL ± 0,017 μL; p = 4,06e-10; Zwei-Proben-t-Test). Weibliche Fliegen verbrauchten auch mehr Ethanollösung als die Kontrollscharoselösung (0,939 μL ± 0,044 μL gegenüber 0,132 μL ± 0,044 μL; p = 7,38e-17; Zwei-Proben-t-Test). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzendes Video S.1: Das Video zeigt eine Fliege, die sich aus dem perforierten Brunnen ernährt und blaue Bauchflecken ansammelt, während sie die gefärbte Lösung einnimmt. Ein Standbild ist in Abbildung 7A dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Zusatzdatei S.2: Mikroplatten-Feeder-Assay-Koppler. Dies ist ein 3D-druckbares Konstrukt des im MFA verwendeten Kopplers. Für die MFA wurde das Druckmaterial Nylon PA12 verwendet. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei S.3: Microplate Feeder Assay Barrier Strip. Dies enthält das Design der Kunststoffbarrierestreifen, die verwendet werden, um die Exposition von Fliegen auf die Futterplatte umzuschalten. Ein einziger Koppler kann bis zu zwölf Barrierestreifen verwenden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Zusatzdatei S.4: Auspack- und Fertigungsanweisungen für den Microplate Feeder Assay. Eine Anleitung zum Auspacken der Kupplung und der Schrankenleisten enthält. Fertigungsanweisungen sind für den Innendeckel, den äußeren Deckel und den Sekundärbehälter enthalten, um die Verdunstung während der Exposition zu begrenzen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei S.5:Kostenvergleich des Microplate Feeder Assay (MFA) und eines 1-Choice Single Fly CApillary FEeder (CAFE) Assays. Das Testen von 72 Fliegen / Sex für eine einzelne Linie würde zwei Sätze von MFA-Geräten (Kupplungen + Platten + Barrierestreifen) erfordern, während das CAFE nur 1 Kapillare für jede Kulturfläschchen benötigt. Trotz des großen Unterschieds bei den Anfangsinvestitionen für das MFA würde der große Unterschied bei den wiederkehrenden Kosten (14,80 USD bzw. 46,08 USD) es ermöglichen, die Vorkosten nach dem Testen von nur 4 Zeilen (Break-Even-Punkt) zu decken. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Die Studie beschreibt ein neuartiges Protokoll zur Quantifizierung des Verbrauchs in Drosophila:den Microplate Feeder Assay (MFA). In diesem Assay verbrauchen Fliegen aus versiegelten Vertiefungen einer 1536-Well-Mikroplatte durch Perforationen kontrollierter Größe (Abbildung 1, Abbildung 2; Ergänzendes Video S.1). Da flüssige Lebensmittel gefärbt und über Mikroplatten bereitgestellt werden, können Messungen der optischen Absorption der Lebensmittel mit einem Mikroplatten-Spektralphotometer erhalten werden (Abbildung 3). Auf diese Weise wird der Verbrauch bestimmt, indem die Absorption vor und nach dem Verbrauch verglichen und dieser Anteil dann auf das bekannte Volumen angewendet wird, das vor dem Verzehr abgegeben wurde. Dies wurde empirisch nachgewiesen, indem die Absorption verschiedener Volumina des gefärbten Mediums gemessen wurde (Abbildung 3B).

Um diesen Assay zu entwickeln, wurde ein Gerät benötigt, das die absorptionsbasierte Quantifizierung des Verbrauchs nutzen konnte. Das Testen von Fliegen in einem Mikroplattenformat ist attraktiv, da es die Mikroplatte ergänzt, die zur Abgabe von Lebensmitteln verwendet wird, und flexibilität bei der Auswahl aus mehreren Plattenformaten (z. B. 6-, 12-, 48- oder 96-Well-Formate) durch Anpassung der Kopplergeometrie ermöglicht. Ein 96-Well-Mikroplattenformat wurde gewählt, um eine individuelle Fliegenkultur zu ermöglichen.

Das 3D-gedruckte Gerät (Abbildung 1) richtet die 1536-Well-Feederplatte präzise mit der 96-Well-Kulturplatte aus und gibt jeder Fliege Zugang zu bis zu 4 Wells der Feeder-Platte für den Verzehr. Um ausreichend Zeit für die Verteilung von Fliegen in die Gehäuseplatte und zur Kontrolle der Assay-Initiation zu bieten, enthält das Gerät umschaltende Barrierestreifen, die die Fliegen in ihren jeweiligen Vertiefungen enthalten und Brüche verhindern. Die zur Beschaffung oder Modifikation dieser Teile erforderlichen Dateien werden zur Verfügung gestellt (Ergänzungsdateien S.2-S.3) sowie die notwendigen Fertigungsanweisungen für die entsprechenden Teile (Ergänzungsakte S.4).

Die MFA bietet eine einfache Hochdurchsatzmethode, die ausgefeiltere Methoden zur Überwachung des Fütterungsverhaltens von Drosophila ergänzt^18,21,22. Das MFA bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen Methoden zur Quantifizierung der Nahrungsaufnahme. Der Durchsatz wird durch die Quantifizierung des Verbrauchs mit einem Plattenleser erhöht. Dies eliminiert manuelle Messungen und macht die manuelle Dateneingabe überflüssig. Daten sind auch für die programmatische Extraktion und Verarbeitung nutzbar. Darüber hinaus erhöht der höhere Durchsatz die realisierbare Anzahl biologischer Replikate, insbesondere im Vergleich zu kommunalen Feeder-Designs, was die Leistung zur Erkennung kleiner Verbrauchsunterschiede erheblich erhöht. Mit dem MFA kann ein einzelner Experimentator den Verbrauch oder die Präferenz von über 500 Fliegen pro Nachtlauf des Assays quantifizieren. Durch überlappende Durchläufe des Assays können über 2.000 Fliegen in einem Zeitraum von 5 Tagen getestet werden. Schließlich gibt es langfristige Kosteneinsparungen durch die Wiederverwendbarkeit von Mikroplatten und Kopplern (Ergänzungsdatei S.5). Mit dem MFA können die geschätzten Kosten pro Assay so niedrig wie $ 14.80 sein, mit einem $ 127.60 Vorabkosten für die Ausrüstung. Unter Verwendung des klassischen CApillary FEeder (CAFE) Assays, der kostspielige Präzisionsmikrokapillaren erfordert, betragen die geschätzten Kosten pro Assay für eine vergleichbare Anzahl von Replikaten 46,08 US-Dollar. Während also eine Vorabinvestition in die Anschaffung der notwendigen Ausrüstung getätigt wird, kann die Reduzierung der wiederkehrenden Kosten zu erheblichen Einsparungen führen, insbesondere in Fällen, in denen wiederholte Tests durchgeführt werden.

Wie bei allen Assays hat auch der MFA gewisse Einschränkungen. Hauptsächlich erfordert es Zugang zu einem Mikroplatten-Spektralphotometer, das 1536-Well-Mikroplatten lesen kann. Darüber hinaus macht die Abhängigkeit von Absorptionsmessungen zur Quantifizierung die Methode anfällig für optische Interferenzen. Dies manifestiert sich als negative Verbrauchswerte für eine kleine Teilmenge der getesteten Proben. Nährstoffe, Medikamente, Pharmazeutika oder Toxine von Interesse müssen ebenfalls wasserlöslich sein, um mit dem Assay kompatibel zu sein.

Trotz ihrer Einschränkungen bietet diese Methode eine Methode mit hohem Durchsatz zur Quantifizierung des Verbrauchsverhaltens in Drosophila. Darüber hinaus konnte die Koppelvorrichtung leicht modifiziert werden, um viele Plattenformate aufzunehmen, so dass sie eine Vielzahl von Insektenarten aufnehmen konnte.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25 mm Diameter Needles	Rave Scientific	RS-MN-52-001012
0.45 µm Syringe Filters	Olympus Plastics	25-245
10 mL Disposable Syringe	EXELINT	26200
Agarose	Fisher Scientific	BP1600
Barrier Strips (Laser Cut)	Ponoko	-	Material: clear PETG, 0.5mm thickness; Supplementary File:
Centrifuge 5810 R	Eppendorf	22625501
Centrifuge Rotor A-4-62 with micro-titer plate buckets	Eppendorf	22638041
FD&C Blue #1	Spectrum Chemical Mfg Corp	FD110
Film Sealing Paddle	Fisher Scientific	50-563-280
Flystuff Flypad	Genesee Scientific	#59-114 and #59-119	CO2 Anesthesia: The Flypads  come in two sizes, either of which is appropriate
Microplate Coupler (3D Printed)	Shapeways	-	Material: Multi Jet Fusion nylon (MJF PA12); Supplementary File:
Microplate Lids	Greiner Bio-One	656170
Molecular Devices SpectraMax iD5	Molecular Devices	-	Any microplate reader with 1536-well resolution will do.
Needle Probe Holder	Rave Scientific	RS-MN-52-001000
Polyester Sealing Film	Excel Scientific, Inc.	100-SEAL-PLT
Polystyrene 96-well microplates	Greiner Bio-One	655101
Polystyrene, Bottomless, 1536-well microplates	Greiner Bio-One	783000	Made to Order; allow for adequate lead time when purchasing.
Rubber Bands
Sucrose	Sigma	S7903
Weather Stripping			1/2" x 1/8" High Density Self Adhesive Neoprene Rubber
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422