Thrombozyten-abgeleitete extrazelluläre Vesikelfunktionalisierung von Ti-Implantaten

Zusammenfassung

Hier stellen wir eine Methode zur Isolierung von extrazellulären Vesikeln (EVs) vor, die von den Thrombozytenlysaten (PL) abgeleitet sind, und deren Verwendung zur Beschichtung von Titan (Ti) Implantatoberflächen. Wir beschreiben das Drop-Casting-Beschichtungsverfahren, das EVs-Freisetzungsprofil von den Oberflächen und die In-vitro-Biokompatibilität von EVs beschichteten Ti-Oberflächen.

Zusammenfassung

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind biologische Nanovesikel, die eine Schlüsselrolle in der Zellkommunikation spielen. Ihr Inhalt umfasst aktive Biomoleküle wie Proteine und Nukleinsäuren, die ein großes Potenzial in der regenerativen Medizin darstellen. In jüngerer Zeit haben EVs, die von Thrombozytenlysat (PL) abgeleitet wurden, eine osteogene Fähigkeit gezeigt, die mit PL vergleichbar ist. Außerdem werden Biomaterialien häufig in der Orthopädie oder Zahnrestauration eingesetzt. Hier stellen wir eine Methode zur Funktionalisierung von Ti-Oberflächen mit PL-abgeleiteten EVs zur Verfügung, um ihre osteogenen Eigenschaften zu verbessern.

EVs werden durch Größenausschlusschromatographie von PL isoliert, und anschließend werden Ti-Oberflächen mit PL-EVs durch Drop-Casting funktionalisiert. Die Funktionalisierung wird durch die Freisetzung von EVs und ihre Biokompatibilität durch den Laktatdehydrogenase (LDH) -Freisetzungsassay nachgewiesen.

Einleitung

EVs sind Membranvesikel (30-200 nm), die von jeder Zelle sezerniert werden und eine Schlüsselrolle in der Zell-zu-Zell-Kommunikation spielen, indem sie ihre Fracht liefern. Sie enthalten eine Vielzahl von aktiven Biomolekülen, die Nukleinsäuren, Wachstumsfaktoren oder bioaktive Lipide enthalten ^können1. Aus diesen Gründen wurden EVs auf ihren potenziellen Einsatz in Therapeutika hin untersucht. In Bezug auf Orthopädie und Knochenregeneration wurden EVs aus verschiedenen Quellen getestet. Unter ihnen wurde gezeigt, dass Thrombozyten-abgeleitete EVs einen Differenzierungseffekt auf Stammzellen induzieren und gleichzeitig ein niedriges zytotoxisches Profil ^{beibehalten2,3}. Daher ist weitere Forschung erforderlich, um die Möglichkeit der Kombination von Elektrofahrzeugen mit Biomaterialien zu untersuchen, um sie in der täglichen klinischen Praxis zu verwenden.

Biomaterialien auf Titanbasis werden aufgrund ihrer mechanischen Eigenschaften, ihrer hohen Biokompatibilität und ihrer langfristigen Haltbarkeit häufig als Gerüste für klinische Eingriffe zur Knochenheilung ^eingesetzt4. Dennoch sind Ti-Implantate ein bioinertes Material und weisen daher eine schlechte Bindungsfähigkeit mit dem umgebenden Knochengewebe ^auf5. Aus diesem Grund werden Titanmodifikationen untersucht, um ihre Leistung zu verbessern, indem eine funktionellere Mikroumgebung auf ihrer Oberfläche erreicht ^wird4,6,7. In diesem Sinne können EVs durch ^chemische8 oder physikalische Wechselwirkungen an Titan verankert ^werden9,10. Immobilisierte EVs, die aus Stammzellen oder Makrophagen gewonnen werden, verbessern die Bioaktivität von Ti, indem sie die zelluläre Adhäsion und Proliferation fördern und dadurch eine osteogene Wirkung hervorrufen8,9,10.

Dieser Artikel konzentriert sich im Detail auf eine Tropfengussstrategie für die Beschichtung von Ti-Oberflächen mit PL-abgeleiteten Elektrofahrzeugen. Darüber hinaus werden wir das Freisetzungsprofil von Elektrofahrzeugen von der beschichteten Oberfläche im Laufe der Zeit bewerten und seine zelluläre Biokompatibilität in vitro bestätigen.

Protokoll

Thrombozytenlysat (PL) wird wie zuvor beschrieben in Übereinstimmung mit den institutionellen ^Richtlinien3 unter Verwendung von frischen Büffelmänteln gewonnen, die von der IdISBa Biobank als Ausgangsmaterial zur Verfügung gestellt werden. Ihre Verwendung für das aktuelle Projekt wurde von ihrer Ethikkommission genehmigt (IB 1995/12 BIO).

1. EVs Isolierung von PL

1. Entfernung größerer Körper
   1. PL bei Raumtemperatur auftauen.
   2. Zentrifuge PL bei 1.500 x g für 15 min bei 4 °C. Entsorgen Sie das Pellet, da es Zellablagerungen enthält.
   3. Sammeln Sie den Überstand und führen Sie zwei aufeinanderfolgende Zentrifugationen bei 10.000 x g für 30 min bei 4 °C durch.
      HINWEIS: Das Pellet entspricht größeren Elektrofahrzeugen wie Mikrovesikeln und wird in diesem Fall verworfen.
   4. Filtern Sie den Überstand zuerst durch 0,8 μm poröse Membran und dann durch 0,2 μm poröse Membran.
      HINWEIS: Mit diesen Schritten werden alle nicht gewünschten EVs entfernt.
   5. Den gefilterten PL in einem Pool auffüllen und bis zum Gebrauch bei -20 °C lagern.
2. Größenausschlusschromatographie
   1. Die an Chromatographiegeräte gekoppelte Säule wird mit der gewünschten Durchflussrate mit gefiltertem PBS ausgeglichen.
      ANMERKUNG: Der verwendete Durchfluss hängt von den Spalteneigenschaften ab. in diesem Fall wird sie auf 0,5 ml/min eingestellt.
   2. Laden Sie das verarbeitete PL (5 ml) mit einer Spritze auf das Gerät.
   3. Injizieren Sie das PL in die Säule und beginnen Sie, 5 ml Fraktionen in 15 ml Röhrchen zu sammeln.
   4. Sammeln Sie die mit Elektrofahrzeugen angereicherten Fraktionen und lagern Sie sie bis zum Gebrauch bei -80 °C.
      HINWEIS: Wenn Sie das Experiment zum ersten Mal durchführen, charakterisieren Sie alle Fraktionen durch Proteinquantifizierung und Immundetektion, um diejenige zu bestimmen, die mit EVs angereichert ^ist3,11. In diesem Experiment wird die 9^. Fraktion gesammelt.
   5. Waschen Sie die chromatographische Säule mit 30 ml 0,2% iger NaOH-Lösung und lagern Sie sie in 20% iger Ethanollösung, sobald sie das Gleichgewicht erreicht hat.

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Isolierung von extrazellulären Vesikeln (EVs) durch Thrombozytenlysat (PL). PL wird zuerst bei 1.500 x g und dann bei 10.000 x g zentrifugiert, um größere Körper zu entfernen. Der Überstand wird durch 0,8- und 0,2-μm-Filter filtriert. Verarbeitetes PL wird auf die Säule geladen, und EVs werden durch Größenausschlusschromatographie getrennt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Charakterisierung von Elektrofahrzeugen

HINWEIS: Die Charakterisierung von Elektrofahrzeugen ist notwendig, um funktionelle Studien ^{durchzuführen12}. Über Elektronenmikroskopie oder Western-Blot-Charakterisierung wurde bereits ^berichtet13. Dieser Bericht konzentriert sich auf die wesentlichen Charakterisierungstechniken für die Ti-Oberflächenfunktionalisierung.

1. Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA)
   1. Verdünnen Sie die EVs (1:1000) in 0,2 μm gefiltertem PBS.
      HINWEIS: Zu konzentrierte Proben oder zu verdünnte Proben liegen außerhalb des Bereichs für die NTA-Bestimmung, und es ist eine Anpassung erforderlich.
   2. Laden Sie 1 ml der verdünnten EVs mit einer Spritze auf die NTA-Ausrüstung und injizieren Sie sie in die NTA-Ausrüstung.
   3. Befolgen Sie das Protokoll des Herstellers zur Bestimmung der Partikelkonzentration und der Größenverteilung.
2. Proteinkonzentration
   1. Bestimmen Sie die Konzentration mit 1 μL der EVs-Lösung. Messen Sie die Absorption mit einem Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 280 nm.
      HINWEIS: EVs sollten im Vergleich zur Anzahl der Partikel einen geringen Proteingehalt aufweisen.
   2. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, um den Absorptionswert mit dem Spektralphotometer zu erhalten.

3. Titan-Oberflächenfunktionalisierung

HINWEIS: Bei diesem Verfahren werden bearbeitete Titanscheiben, c.p. Grad IV, 6,2 mm Durchmesser und 2 mm Höhe, verwendet. Die Scheiben können mit einer Ti-Pinzette manipuliert werden, aber es ist wichtig, nicht an der Oberfläche zu kratzen. Darüber hinaus muss die bearbeitete Seite während des gesamten Prozesses nach oben zeigen.

1. Ti Discs waschen
   HINWEIS: Das Volumen der für das Ti-Waschen verwendeten Lösungen sollte ausreichen, um Ti-Platten abzudecken. Legen Sie Ti-Scheiben in ein Glasbecherglas und gießen Sie Lösungen darauf. Entfernen Sie dann die Lösung durch Dekantieren.
   1. Waschen Sie Ti-Implantate mit entionisiertem (DI) Wasser und entsorgen Sie dann das Wasser.
   2. Waschen Sie Ti-Implantate mit Ethanol 70% und dekantieren Sie dann, um die Lösung zu entfernen.
   3. Setzen Sie die Implantate in DI-Wasser und beschallen Sie sie bei 50 °C für 5 min. Entsorgen Sie das Wasser.
   4. Inkubieren Sie Ti-Implantate in einer 40% igen NaOH-Lösung bei 50 °C für 10 min unter Rühren. Verwerfen Sie die Lösung.
      ACHTUNG: NaOH-Lösung erwärmt sich während der Zubereitung. Die Lösung ist korrosiv und sollte in einem Abzug verwendet werden.
   5. Beschallen Sie die Implantate in DI-Wasser bei 50 °C für 5 min und entfernen Sie dann das Wasser.
   6. Führen Sie mehrere Wäschen mit DI-Wasser (mindestens 5) durch, bis der neutrale pH-Wert erreicht ist. Überprüfen Sie den pH-Wert mit pH-Indikatoren.
   7. Die Implantate in DI-Wasser bei 50 °C für 5 min beschallen und das Wasser entfernen.
   8. Inkubieren Sie Ti-Implantate in einer 50% igen _HNO3-Lösung bei 50 °C für 10 min unter Rühren. Entfernen Sie die Lösung.
      VORSICHT: _HNO3 ist eine korrosive und oxidierende Substanz und sollte in einem Abzug verwendet werden.
   9. Beschallung der Implantate in DI-Wasser bei 50 °C für 5 min. Entfernen Sie das Wasser.
   10. Führen Sie mehrere Wäschen mit DI-Wasser (mindestens 5) durch, bis ein neutraler pH-Wert erreicht ist. Überprüfen Sie den pH-Wert mit pH-Indikatoren.
   11. Beschallung der Implantate in DI-Wasser bei 50 °C für 5 min. Entfernen Sie das Wasser.
       HINWEIS: An diesem Punkt kann das Experiment gestoppt werden, indem Ti-Implantate in einer 70% igen Ethanollösung gelagert werden.
2. Ti Passivierung
   HINWEIS: Ti-Passivierungsschritte werden durchgeführt, indem Ti-Discs vollständig mit den verschiedenen Lösungen in der unten aufgeführten Reihenfolge abgedeckt werden. Ti-Scheiben werden in ein Glasbecherglas gelegt und Lösungen werden sanft auf sie gegossen. Die in allen Waschschritten verwendeten Volumina müssen die Implantate vollständig bedecken und werden durch Dekantieren entfernt.
   1. Inkubieren Sie die Ti-Implantate in einer 30% _HNO3-Lösung für 30 min bei Raumtemperatur unter sanfter Bewegung. Entfernen Sie die Lösung.
   2. Führen Sie mehrere Wäschen mit DI-Wasser (mindestens 5) durch, bis der neutrale pH-Wert erreicht ist. Überprüfen Sie den pH-Wert mit pH-Indikatoren.
   3. Inkubieren Sie Ti-Implantate über Nacht bei Raumtemperatur in DI-Wasser.
   4. Trocknen Sie die Implantate unter Vakuumbedingungen bei 40 °C für 10 min ab.
3. EVs Drop Casting
   HINWEIS: Für Zellfunktionsstudien ist es wichtig, in einem Zellkulturschrank zu arbeiten.
   1. Legen Sie die Ti-Implantate in eine 96-Well-Platte, wobei die bearbeitete Seite nach oben zeigt.
      HINWEIS: Wenn die Implantate auf den Kopf gestellt werden, kann eine Nadel verwendet werden, um sie zurückzusetzen.
   2. Tauen Sie die EVs-Lösung auf und mischen Sie sie mit Rührung. Verwenden Sie einen Wirbel, um für 3 s zu pulsieren.
   3. Legen Sie die EVs auf der Ti-Oberfläche ab. In dieser Studie werden Tropfen von 40 μL EVs-Lösung auf das Ti gegeben, um maximal 4 x ¹⁰¹¹ EVs pro Implantat entsprechend der durch NTA bestimmten Konzentration zu immobilisieren.
   4. Stellen Sie die Platten mit dem Ti unter Vakuumbedingungen bei 37 °C auf, bis die Tropfen vollständig trocken sind (~2 h).
      HINWEIS: Stellen Sie die Zeit in Abhängigkeit von der Anzahl der Implantate und dem in der Vakuumkammer vorhandenen Wasser ein.

Abbildung 2: Schematische Darstellung der Ti-Passivierung und der Funktionalisierung von Elektrofahrzeugen durch Tropfenguss. Ti-Implantate werden zunächst durch Inkubation für 30 min in einer 30% igen _HNO3-Lösung bei Raumtemperatur passiviert. Nach mehreren Wäschen mit DI-Wasser erreicht der pH-Wert neutral. Dann werden Ti-Implantate über Nacht bei Raumtemperatur in DI-Wasser inkubiert. Danach werden die Implantate unter Vakuumbedingungen bei 40 °C abgetrocknet. Für die Immobilisierung von Elektrofahrzeugen werden 40 μL EVs-Lösung auf Ti-Implantate aufgefüllt. Als nächstes werden Implantate im Vakuum für 2 h inkubiert, bis EVs physisch an die Oberfläche gebunden sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

4. Ti-Oberflächencharakterisierung

1. Release-Studie
   1. Inkubieren Sie die Ti-Oberfläche mit 200 μL gefiltertem PBS bei 37 °C.
      HINWEIS: PBS wird gefiltert, um Interferenzen mit der NTA-Messung zu vermeiden.
   2. Ersetzen Sie den PBS zu verschiedenen Zeitpunkten und lagern Sie ihn bei -80 °C.
      HINWEIS: In dieser Studie wurden 2-, 6-, 10- und 14-Tage-Zeitpunkte analysiert.
   3. Analysieren Sie gespeichertes PBS für Partikelstudien durch NTA gemäß den Anweisungen des Herstellers.
      HINWEIS: Die Partikelkonzentration in PBS zu verschiedenen Zeiten ist eine Darstellung des Freisetzungsprofils von Elektrofahrzeugen im Laufe der Zeit.
2. Biokompatibilitätsstudien
   HINWEIS: Menschliche nabelschnurgeleitete mesenchymale Stammzellen (hUC-MSC) werden aus der IdISBa Biobank in Übereinstimmung mit institutionellen Richtlinien gewonnen.
   1. Halten Sie hUC-MSC in DMEM niedriger Glukose, ergänzt mit 20% FBS bis zur Verwendung. Wechseln Sie das Medium zweimal pro Woche.
   2. Für die Zellaussaat waschen Sie die Zellen zweimal in Kolben mit 5 ml PBS.
   3. Trypsinisieren Sie hUC-MSC, indem Sie 1 ml Trypsinlösung hinzufügen. Stellen Sie sicher, dass es die Monoschicht der Zellen vollständig bedeckt. Die Trypsinlösung wird entfernt und der Zellkulturkolben bei 37 °C für ca. 2 min aufgestellt. Sehen Sie sich die Zellablösung unter dem Mikroskop an. Abgelöste Zellen erscheinen rund in der Form und sind in Suspension.
   4. Resuspend Zellen in DMEM niedrige Glukose mit 1% EVs erschöpften FBS.
      HINWEIS: Bereiten Sie Medien vor, die mit 1% FBS ergänzt wurden, und zentrifugieren Sie dann 18 h lang bei 120.000 x g , um FBS-EVs zu entfernen. Es ist wichtig, Elektrofahrzeuge zu entfernen, um Interferenzen mit Thrombozyten-Elektrofahrzeugen zu vermeiden.
   5. Bestimmen Sie die Zellkonzentration, indem Sie die Anzahl der Zellen mit einer Neubauer-Kammer ^zählen14.
   6. Bringen Sie hUC-MSC auf eine Konzentration von 50.000 Zellen/ ml.
   7. Säen Sie 200 μL der Zelllösung auf die Ti-Implantate.
   8. Sammeln Sie nach 48 h 50 μL Medien und führen Sie die zytotoxische Bestimmung unter Verwendung des Laktatdehydrogenase (LDH) -Aktivitätskits gemäß dem Protokoll des Herstellers durch.

Ergebnisse

Die in diesem Artikel vorgestellte Methode ermöglicht es, funktionalisierte Titanscheiben von Elektrofahrzeugen zu erhalten. EVs sind physisch an die Oberfläche gebunden, was eine anhaltende Freisetzung im Laufe der Zeit ermöglicht. Die Anzahl der freigesetzten EVs kann durch NTA an Tag 2, 6, 10 und 14 gemessen werden. Die ersten Messungen an Tag 2 zeigen, dass rund ¹⁰⁹ EVs freigesetzt werden, gefolgt von einer anhaltenden Freisetzung an Tag 6 (~ ¹⁰⁸ EVs); Tag 10 (~¹⁰⁷ EVs) und Tag 14 ...

Diskussion

Dieses Protokoll zielt darauf ab, klare Anweisungen für die Funktionalisierung von Elektrofahrzeugen auf Ti-Oberflächen bereitzustellen. Das vorgestellte Verfahren basiert auf einer Tropfengießstrategie, bei der es sich um eine Physisorptionsart der Funktionalisierung handelt. Es gibt eine schlechte Bibliographie in Bezug auf die Funktionalisierung von Elektrofahrzeugen auf Ti-Oberflächen, obwohl es nur wenige Studien gibt, die unterschiedliche Vorteile durch die Immobilisierung von Elektrofahrzeugen auf

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,8 µm syringe filter	Sartorius	16592K
1.5 mL Centrifuge tube	SPL life sciences	PLC60015
1mL syringe	BD	303174
96-well culture plate	SPL life sciences	PLC30096
Absolut ethanol	Scharlau	ET0006005P	Used to prepare 20 %  ethanol with Milli-Q® water
AKTA purifier System	GE Healthcare	8149-30-0014
Allegra X-15R Centrifuge	Beckman Coutler	392934	SX4750A swinging rotor
Centrifuge 5430 R	Eppendorf	5428000210	F-45-48-11 rotor
Conical Tube, Conical Bottom, 50ml	SPL life sciences	PLC50050
Cytotoxicity Detection Kit (LDH)	Roche	11644793001
Disposable Syringes 10 ml	Becton Dickinson	BDH307736
DMEM Low Glucose Glutamax	GIBCO	21885025
Dulbecco's PBS (1x)	Capricorn Scientific	PBS-1A
Fetal Bovine Serum (FBS) Embrionic Certified	GIBCO	16000044
Filtropur S 0.2 µm syringe filter	Sarstedt	83.1826.001
HiPrep 16/60 Sephacryl S-400 HR	GE Healthcare	28-9356-04	Precast columns
human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (hUC-MSC)	IdISBa Biobank
Nanodrop 2000 spectrophotometer	ThermoFisher	ND-2000
NanoSight NS300 nanoparticle tracking analysis	Malvern	NS300	Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS
Needle	Terumo	946077135
Nitric acid 69,5%	Scharlau	AC16071000
Optima L-100 XP Ultracentrifuge	Beckman Coulter	8043-30-1124	SW-32Ti Rotor
Penicillin-Streptomycin Solution 100X	Biowest	L0022
pH Test strips 4.5-10.0	Sigma	P-4536
Platelet Lysate (PL)	IdISBa Biobank		Obtained from  buffy coats discarded after blood donation
Polypropylene centrifuge tubs	Beckman Coutler	326823
Power wave HT	BioTek	10340763
Screw cap tube, 15 ml, (LxØ): 120 x 17 mm, PP, with print	Sarstedt	62554502
Sodium hidroxide	Sharlau	SO04251000
Titanium implants replicas	Implantmedia, SA	NA	Titanium grade IV. Diameter: 6,2 mm. Height: 1,95 mm
Trypsin-EDTA 1 X	Biowest	L0930
Tryton X100	Sigma	T8787