Messung der Zusammensetzung von CD95 Death-Inducing Signaling Complex und Verarbeitung von Procaspase-8 in diesem Komplex

Zusammenfassung

Hier wird ein experimenteller Workflow vorgestellt, der den Nachweis der Caspase-8-Verarbeitung direkt am todesinduzierenden Signalkomplex (DISC) ermöglicht und die Zusammensetzung dieses Komplexes bestimmt. Diese Methodik hat breite Anwendungen, von der Entschlüsselung der molekularen Mechanismen von Zelltodwegen bis hin zur dynamischen Modellierung von Apoptose-Netzwerken.

Zusammenfassung

Die extrinsische Apoptose wird durch die Aktivierung von Todesrezeptoren (DRs) wie CD95/Fas/APO-1 oder Tumornekrosefaktor-bedingtem Apoptose-induzierendem Liganden (TRAIL)-Rezeptor 1/Rezeptor 2 (TRAIL-R1/R2) vermittelt. Die Stimulation dieser Rezeptoren mit ihren verwandten Liganden führt zum Aufbau des todinduzierenden Signalkomplexes (DISC). DISC umfasst DR, das Adapterprotein Fas-assoziiertes Protein mit Todesdomäne (FADD), Procaspasen-8/-10 und zelluläre FADD-ähnliche Interleukin (IL)-1β-converting enzyme-inhibitory proteins (c-FLIPs). Die DISC dient als Plattform für die Procaspase-8-Verarbeitung und -Aktivierung. Letzteres geschieht durch seine Dimerisierung / Oligomerisierung in den an der DISC zusammengesetzten Filamenten der Death Effector Domain (DED).

Auf die Aktivierung von Procaspase-8 folgt seine Verarbeitung, die in mehreren Schritten erfolgt. In dieser Arbeit wird ein etablierter experimenteller Workflow beschrieben, der die Messung der DISC-Bildung und die Verarbeitung von Procaspase-8 in diesem Komplex ermöglicht. Der Workflow basiert auf Immunpräzipitationstechniken, die durch die Western-Blot-Analyse unterstützt werden. Dieser Workflow ermöglicht eine sorgfältige Überwachung verschiedener Schritte der Procaspase-8-Rekrutierung in die DISC und ihrer Verarbeitung und ist für die Untersuchung molekularer Mechanismen der extrinsischen Apoptose von hoher Relevanz.

Einleitung

Einer der am besten untersuchten Todesrezeptoren (DRs) ist CD95 (Fas, APO-1). Der extrinsische apoptotische Signalweg beginnt mit der Interaktion des DR mit seinem verwandten Liganden, d.h. CD95L interagiert mit CD95 oder TRAIL bindet an TRAIL-Rs. Dies führt zur Bildung der DISC an der entsprechenden DR. DISC besteht aus CD95, FADD, Procaspase-8/-10 und c-FLIP Proteinen^1,2. Darüber hinaus wird die DISC durch Wechselwirkungen zwischen Death Domain (DD)-haltigen Proteinen wie CD95 und FADD und DED-haltigen Proteinen wie FADD, Procaspase-8/-10 und c-FLIP zusammengesetzt (Abbildung 1). Procaspase-8 wird durch Assoziation seiner DEDs oligomerisiert, was zur Bildung von DED-Filamenten führt, gefolgt von procaspase-8-Aktivierung und -Verarbeitung. Dies löst eine Caspase-Kaskade aus, die zum Zelltod führt (Abbildung 1)^3,4. Somit ist Procaspase-8 eine zentrale Initiator-Caspase des extrinsischen Apoptoseweges, vermittelt durch CD95 oder den TRAIL-Rs, aktiviert an der entsprechenden makromolekularen Plattform, DISC.

Es ist bekannt, dass zwei Isoformen von Procaspase-8, nämlich Procaspase-8a (p55) und -8b (p53), für die DISC⁵rekrutiert wurden. Beide Isoformen bestehen aus zwei DEDs. DED1 und DED2 befinden sich im N-terminalen Teil der Procaspase-8a/b, gefolgt von den katalytischen Domänen p18 und p10. Eine detaillierte Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) Analyse von Procaspase-8-DEDs ergab die Assemblierung von Procaspase-8-Proteinen zu fadenförmigen Strukturen, den sogenannten DED-Filamenten^4,6. Bemerkenswerterweise wurde zunächst vorgeschlagen, dass die linearen Procaspase-8-Ketten an der Dimerisierung beteiligt sind, gefolgt von der Procaspase-8-Aktivierung an der DISC. Nun ist bekannt, dass diese Ketten nur eine Unterkonstruktion des Procaspase-8-DED-Filaments sind, das aus drei Ketten besteht, die zu einer Dreifachhelix³, 4^,6,7zusammengesetzt sind.

Bei der Dimerisierung am DED-Filament führen Konformationsänderungen in der Procaspase-8a/b zur Bildung des aktiven Zentrums von Procaspase-8 und seiner Aktivierung^3,8. Es folgt die Procaspase-8-Verarbeitung, die über zwei Wege vermittelt wird: Der erste geht über die Erzeugung eines p43/p41-Spaltprodukts und der zweite über die initiale Erzeugung eines p30-Spaltprodukts. Der p43/p41-Signalweg wird durch die Spaltung von Procaspase-8a/b an Asp374 eingeleitet, was zu p43/p41- und p12-Spaltprodukten führt (Abbildung 2). Ferner werden diese Fragmente bei Asp384 und Asp210/216 automatisch katalytisch gespalten, was zur Bildung des aktiven Caspase-8-Heterotetramers, p10₂/p18₂⁹, 10^,11führt. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass parallel zum p43/p41-Verarbeitungsweg auch procaspase-8a/b an Asp216 gespalten wird, was zur Bildung des C-terminalen Spaltprodukts p30 führt, gefolgt von dessen Proteolyse zu p10 und p18¹⁰ (Abbildung 2).

Die Procaspase-8a/b-Aktivierung am DED-Filament wird streng durch Proteine namens c-FLIPs¹²reguliert. Die c-FLIP Proteine kommen in drei Isoformen vor: c-FLIP_Long (c-FLIP_L), c-FLIP_Short (c-FLIP_S) und c-FLIP_Raji (c-FLIP_R). Alle drei Isoformen enthalten zwei DEDs in ihrem N-terminalen Bereich. c-FLIP_L hat auch eine C-terminale katalytisch inaktive Caspase-ähnliche Domäne^12,13. Beide kurzen Isoformen von c-FLIP-c-FLIP_S und c-FLIP_Rwirken anti-apoptotisch, indem sie die Bildung von DED-Filamenten an der DISC 6^,14,15stören. Darüber hinaus kann c-FLIP_L die Caspase-8-Aktivierung konzentrationsabhängig regulieren. Dies kann sowohl zu pro- als auch zu anti-apoptotischen Wirkungen führen^16,17,18. Durch die Bildung des katalytisch aktiven Procaspase-8/c-FLIP_L Heterodimers führt c-FLIP_L zur Stabilisierung des aktiven Zentrums von Procaspase-8 und dessen Aktivierung. Die pro- oder anti-apoptotische Funktion von c-FLIP_L ist direkt abhängig von seiner Menge an den DED-Filamenten und der anschließenden Menge an zusammengesetzten Procaspase-8/c-FLIP_L Heterodimeren¹⁹. Niedrige oder mittlere Konzentrationen von c-FLIP_L an der DISC führen zu ausreichenden Mengen an Procaspase-8/c-FLIP L-Heterodimeren am DED-Filament, was die Aktivierung von Caspase-8 unterstützt. Im Gegensatz dazu führen erhöhte Mengen an c-FLIP_L direkt zu seiner anti-apoptotischen Wirkung an der DISC²⁰.

Zusammengenommen ist die Aktivierung und Verarbeitung von Procaspase-8a/b am DISC ein stark regulierter Prozess, der mehrere Schritte umfasst. Dieser Beitrag diskutiert die Messung der Procaspase-8-Verarbeitung direkt am DISC sowie die Analyse der Zusammensetzung dieses Komplexes. Dies wird anhand der CD95 DISC als exemplarischem DR-Komplex präsentiert.

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Protokoll

T-Zell-Experimente wurden gemäß der ethischen Vereinbarung 42502-2-1273 Uni MD durchgeführt.

1. Zellen für das Experiment vorbereiten

HINWEIS: Die durchschnittliche Anzahl der Zellen für diese Immunpräzipitation beträgt 1 × 10⁷_. Adhärente Zellen müssen einen Tag vor dem Experiment ausgesät werden, so dass es am Tag des Experiments 1 ×^{10 7} Zellen gibt.

1. Adhärenzzellen für das Experiment vorbereiten
   1. Samen Sie 5-8 × 10⁶ adhärente Zellen in 20 ml Medium (siehe Materialtabelle für die Zusammensetzung) für jede Bedingung in 14,5 cm Schalen einen Tag vor Beginn des Experiments.
   2. Stellen Sie am Tag des Experiments sicher, dass die Zellen zu 80-90% konfluent sind und an der Schale haften. Verwerfen Sie das Medium und fügen Sie den adhärenten Zellen frisches Medium hinzu.
2. Vorbereitung von Suspensionszellen für das Experiment
   1. 1 × 10⁷ Suspensionszellen vorsichtig in 10 mL Kulturmedium (siehe Tabelle der Materialien für die Zusammensetzung) pro Zustand unmittelbar vor Beginn des Experiments in 14,5 cm Schalen geben.
   2. Wenn Primärzellen verwendet werden, isolieren Sie primäre T-Zellen gemäß dem zuvor beschriebenen Verfahren²¹. Behandeln Sie primäre T-Zellen mit 1 μg / ml Phytohämagglutinin für 24 h, gefolgt von einer 25 U / ml IL2-Behandlung für 6 Tage.
   3. 1 × 10⁸ primäre T-Zellen vorsichtig in 10 ml Kulturmedium (siehe Materialtabelle für die Zusammensetzung) pro Bedingung unmittelbar vor Beginn des Experiments in 14,5 cm Schalen geben.
      HINWEIS: Diese höhere Anzahl von primären T-Zellen wird empfohlen, da diese Zellen kleiner sind.

2. CD95L Stimulation

1. Stimulieren Sie die Zellen mit CD95L (hergestellt wie zuvor^{beschrieben 20} oder kommerziell erhältlich (siehe Tabelle der Materialien)).
   ANMERKUNG: Die Konzentration des CD95L und der Zeitpunkt der Stimulation sind zelltypabhängig^{13,15,22,23,24,25}. Bereiten Sie eine Stimulationsbedingung zweimal vor, um parallel eine "Perlenkontrollprobe" zu erzeugen.
   1. Stimulieren Sie adhärente Zellen mit der ausgewählten Konzentration von CD95L. Halten Sie die Platte in einem Winkel und pipettieren Sie den Liganden in das Medium, ohne die adhäsiven Zellen zu berühren.
   2. Stimulieren Sie Die Suspensionszellen mit CD95L, indem Sie die Ligandenlösung in die Zellsuspension pipettieren.

3. Zellernte und Lyse

1. Stellen Sie das Zellgeschirr auf Eis.
   HINWEIS: Entsorgen Sie das Medium nicht. Sterbende Zellen schweben im Medium und sind wichtig für die Analyse.
2. 10 ml kalte phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in die Zellsuspension geben und die angeschlossenen Zellen von der Platte abkratzen. Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 50-ml-Röhrchen.
3. Waschen Sie die Zellschale zweimal mit 10 ml kaltem PBS und geben Sie die Waschlösung in dasselbe 50-ml-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 500 × g für 5 min, 4 °C.
4. Verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Zellpellet mit 1 ml kaltem PBS. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 1,5 ml Röhrchen.
5. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 500 × g für 5 min, 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Zellpellet mit 1 ml kaltem PBS.
6. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 500 × g für 5 min, 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Zellpellet mit 1 ml Lysepuffer (mit 4% Protease-Inhibitor-Cocktail). Inkubieren Sie es für 30 min auf Eis.
7. Zentrifugieren Sie das Lysat mit maximaler Geschwindigkeit (~17.000 × g) für 15 min, 4 °C.
8. Den Überstand (Lysat) in ein sauberes Röhrchen geben. Entsorgen Sie das Pellet. Nehmen Sie 50 μL des Lysats in einem anderen Röhrchen. Analysieren Sie die Proteinkonzentration mit dem Bradford-Assay und nehmen Sie die Menge an Lysat, die 25 μg Protein entspricht, in eine Durchstechflasche. Fügen Sie der Durchstechflasche Ladepuffer (siehe Materialtabelle für die Zusammensetzung) hinzu. Lagern Sie es bei -20 °C als Lysatkontrolle.

4. Immunpräzipitation (IP)

1. Dem Lysat werden 2 μL Anti-APO-1-Antikörper und 10 μL Protein-A-Sepharoseperlen (wie vom Hersteller empfohlen hergestellt) zugegeben. Geben Sie nur 10 μL der Kügelchen in ein separates Röhrchen, das Lysat enthält (stimulierte Probe), um eine "Perlenkontrolle" zu erzeugen.
   HINWEIS: Verwenden Sie Pipettenspitzen mit breiten Öffnungen, indem Sie entweder die Spitzen schneiden oder spezielle Spitzen für IP kaufen, während Sie mit den Protein-A-Sepharose-Perlen umgehen.
2. Inkubieren Sie die Mischung aus Lysat mit Antikörpern/Eiweiß A-Sepharoseperlen mit sanftem Mischen über Nacht bei 4 °C. Zentrifugieren Sie die Lysate mit Antikörpern/Protein A Sepharoseperlen bei 500 × g für 4 min, 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand, geben Sie 1 ml kaltes PBS zu den Kügelchen und wiederholen Sie diesen Schritt mindestens dreimal.
3. Verwerfen Sie den Überstand. Die Kügelchen vorzugsweise mit einer 50 μL Hamilton Spritze absaugen.

5. Western Blot

1. 20 μL 4x Ladepuffer (siehe Tabelle der Materialien für die Zusammensetzung) zu den Kügelchen geben und bei 95 °C für 10 min erhitzen. Erhitzen Sie die Lysatsteuerungen bei 95 °C für 5 min.
2. Laden Sie die Lysate, IPs und einen Proteinstandard auf ein 12,5% iges Natriumdodecylsulfat (SDS) -Gel (siehe Materialtabelle für die Gelvorbereitung) und laufen Sie mit einer konstanten Spannung von 80 V.
3. Übertragen Sie die Proteine aus dem SDS-Gel auf eine Nitrocellulosemembran.
   HINWEIS: Hier wurde die für die interessierenden Proteine optimierte Halbtrockentechnik für den Transfer über 12 min (25 V; 2,5 A= konstante) verwendet. Weichen Sie die Nitrocellulosemembran und zwei Mini-Transferstapel in Elektrophoresepuffer (siehe Materialtabelle für die Zusammensetzung, bereiten Sie sie gemäß den Anweisungen des Herstellers vor) für einige Minuten vor dem Western Blotting ein.
4. Legen Sie die abgefleckte Membran in eine Box und blockieren Sie sie für 1 h in Blocklösung (0,1% Tween-20 in PBS (PBST) + 5% Milch). Inkubieren Sie die Membran mit der Blockierlösung unter sanfter Bewegung.
5. Waschen Sie die Membran dreimal mit PBST für 5 min pro Wäsche.

6. Erkennung von Western Blot

1. Der erste Primärantikörper in der angegebenen Verdünnung (siehe Materialtabelle)wird in die Membran gegeben und über Nacht bei 4 °C unter sanfter Bewegung inkubiert.
2. Waschen Sie die Membran dreimal mit PBST für 5 min pro Wäsche.
3. Inkubieren Sie die Membran mit 20 ml sekundärem Antikörper (verdünnt 1:10.000 in PBST + 5% Milch) mit sanftem Schütteln für 1 h bei Raumtemperatur.
4. Waschen Sie die Membran dreimal mit PBST für 5 min pro Wäsche.
5. Entsorgen Sie PBST und geben Sie etwa 1 ml Meerrettichperoxidase-Substrat zur Membran.
6. Erkennen Sie das chemolumineszente Signal (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Die Belichtungszeit und die Anzahl der aufgenommenen Bilder hängen von der Proteinmenge in der Zelle und der Spezifität der verwendeten Antikörper ab. Sie muss für jeden zum Nachweis verwendeten Antikörper empirisch ermittelt werden.

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Ergebnisse

Um die Caspase-8-Rekrutierung auf die DISC und deren Verarbeitung an der CD95 DISC zu analysieren, beschreibt dieses Papier einen klassischen Workflow, der IP der CD95 DISC mit Western-Blot-Analyse kombiniert. Dies ermöglicht den Nachweis mehrerer Schlüsselmerkmale der Caspase-8-Aktivierung an der DISC: die Montage der Caspase-8-aktivierenden makromolekularen Plattform, die Rekrutierung von Procaspase-8 in die DISC und die Verarbeitung dieser Initiator-Caspase (Abbildung 1 und

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Diskussion

Dieser Ansatz wurde erstmals von Kischkel et al.²⁷ beschrieben und seitdem von mehreren Gruppen erfolgreich entwickelt. Für eine effiziente DISC-Immunpräzipitation und überwachung der Caspase-8-Verarbeitung in diesem Komplex müssen mehrere wichtige Aspekte berücksichtigt werden.

Erstens ist es wichtig, alle Waschschritte während der Immunpräzipitation zu befolgen. Besonders wichtig sind die letzten Waschschritte der Sepharoseperlen und das Trocknen der Sepharosep...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
12.5% SDS gel	self made		for two separating gels: 3.28 mL distilled H2O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL acrylamide 100 µL 10% SDS 100 µL 10% APS 7.5 µL TEMED for two collecting gels: 3.1 mL distilled H2O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL acrylamide 50 µL 10% SDS 25 µL 10% APS 7.5 µL TEMED
14.5 cm cell dishes	Greiner	639160
acrylamide	Carl Roth	A124.1
Aerosol filter pipet tips with high recovery filter and wide orifice	VWR	46620-664 (North America) or 732-0559 (Europe)	Used for pipetting beads to the lysate
anti-actin Ab	Sigma Aldrich	A2103	dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-APO-1 Ab	provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by Enzo	ALX-805-038-C100	used only for immunoprecipitation
anti-caspase-10 Ab	Biozol	MBL-M059-3	dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-caspase-3 Ab	cell signaling	9662 S	dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-caspase-8 Ab C15	provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-804-242-C100	dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3
anti-CD95 Ab	Santa Cruz	sc-715	dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-c-FLIP NF6 Ab	provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-804-961-0100	dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3
anti-FADD 1C4 Ab	provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ADI-AAM-212-E	dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3
anti-PARP Ab	cell signaling	9542	dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3
APS	Carl Roth	9592.3
β-mercaptoethanol	Carl Roth	4227.2
Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml	Bio Rad	500-0006	used according to manufacturer's instructions
CD95L	provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-522-020-C005
chemoluminescence detector Chem Doc XRS+	Bio Rad
cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC)	Sigma Aldrich	11 836 145 001	prepared according to manufacturer's instructions
DPBS (10x) w/o Ca, Mg	PAN Biotech	P04-53500	dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge
eletrophoresis buffer	self made		10x electrophoresis buffer: 60.6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H2O 1:10 dilution before usage
glycine	Carl Roth	3908.3
Goat Anti-Mouse IgG1 HRP	SouthernBiotech	1070-05	dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Goat Anti-Mouse IgG2b HRP	SouthernBiotech	1090-05	dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Goat Anti-Rabbit IgG-HRP	SouthernBiotech	4030-05	dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Interleukin-2 Human(hIL-2)	Merckgroup/ Roche	11011456001	for activation of T cells
KCl	Carl Roth	6781.2
KH2PO4	Carl Roth	3904.1
loading buffer 4x Laemmli Sample Buffer,10 mL	Bio Rad	161-0747	prepared according to manufacturer's instructions
Luminata Forte Western HRP substrate	Millipore	WBLUFO500
lysis buffer	self made		13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O
medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine,  2,438 g/L	PAN Biotech	P04-41154	adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium
medium for primary T cells	gibco by Life Technologie	21875034	adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium
milk powder	Carl Roth	T145.4
Na2HPO4	Carl Roth	P030.3
NaCl	Carl Roth	3957.2
PBST	self made		20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 20 mL Tween-20 ad 2 L H2O dilution 1:20 before usage
PBST + 5% milk	self made		50 g milk powder + 1 L PBST
PHA	Thermo Fisher Scientific	R30852801	for activation of T Cells
Power Pac HC	Bio Rad
Precision Plus Protein Standard All Blue	Bio Rad	161-0373	use between 3-5 µL
Protein A Sepharose CL-4B beads	Novodirect/ Th.Geyer	GE 17-0780-01	affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions
scraper	VWR	734-2602
SDS	Carl Roth	4360.2
shaker	Heidolph
sodium azide	Carl Roth	K305.1
TEMED	Carl Roth	2367.3
Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks	Bio Rad	170-4270	used according to manufacturer's instructions
TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer	Bio Rad	10026938	prepared according to manufacturer's instructions
TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane	Bio Rad	170-4270	used according to manufacturer's instructions
Trans-Blot-Turbo	Bio Rad
Tris	Chem Solute	8,08,51,000
Triton X-100	Carl Roth	3051.4
Tween-20	Pan Reac Appli Chem	A4974,1000