Live-Fluoreszenz, inverse Bildgebung von Zellkräuseln und Macropinozytose

Zusammenfassung

Dieses Protokoll demonstriert die Dextran-Bildgebung in lebenden Zellen unter Verwendung von kontinuierlicher Aufnahme und inversen Bildern, um die Visualisierung von Kräuselung, Makropinosomenreifung und Analyse von Dextran und anderen Zellmarkierungen zu optimieren.

Zusammenfassung

Die Macropinozytose ist ein hochkonservierter, aber noch unvollständig verstandener Prozess, der für die Aufnahme und Aufnahme von Flüssigkeit, Flüssigphasennährstoffen und anderem Material in Zellen unerlässlich ist. Die dramatische Ausdehnung von Zelloberflächenkräuseln, ihr Verschluss zu Makropinosomen und die Reifung internalisierter Makropinosomen sind Schlüsselereignisse in diesem Signalweg, die mit der herkömmlichen konfokalen Bildgebung, die auf der Verfolgung eines Bolus fluoreszierender Fracht basiert, schwierig zu erfassen sein können. Fluoreszierende Dextrane werden häufig experimentell als Flüssigphasenmarker für Makropinosomen und für andere endozytäre Signalwege verwendet. Eine Methode, die das Labor zur Optimierung der Bildgebung der Dextranaufnahme übernommen hat, besteht darin, die Live-Bildgebung von Zellen zu verwenden, die in hohen Konzentrationen von fluoreszierendem Dextran im Medium gebadet wurden, wobei die unmarkierten Zellen im Relief (als schwarz) erscheinen. Die Zellkräusel werden hervorgehoben, um den Kräuselungsverschluss sichtbar zu machen, und internalisierte Makropinosomen erscheinen als fluoreszierende Vakuolen im Zellinneren. Diese Methode ist optimal für die Visualisierung von Makropinosomenmerkmalen und ermöglicht eine einfache Segmentierung und Quantifizierung. In dieser Arbeit wird die duale Markierung von Signalwegen mit Dextranen unterschiedlicher Größe und die Co-Expression von Lipidsonden und fluoreszierenden Membranproteinen zur Markierung von Makropinosomen und anderen Endosomen beschrieben. Die Detektion von internalisiertem Dextran auf ultrastruktureller Ebene mittels korrelativer Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM) wird ebenfalls demonstriert. Diese Zellprozesse können mit mehreren Live-Bildgebungsmodalitäten abgebildet werden, auch in 3D. Zusammengenommen optimieren diese Ansätze die Makropinosomen-Bildgebung für viele verschiedene Umgebungen und experimentelle Systeme.

Einleitung

Die meisten Zelltypen von Wirbeltieren teilen die angeborene Fähigkeit zur nicht-selektiven Aufnahme von Flüssigkeit mit ihren Vorgängern im Laufe der Evolution, die auf einzellige Amöben zurückgehen¹. Dieser hochkonservierte Prozess der Flüssigphasenaufnahme durch Makropinozytose (großes Trinken) wird von Amöben hauptsächlich zur Nährstoffaufnahme¹ genutzt, während er in Wirbeltierzellen in ähnlicher Weise ein Versorgungsweg für die Gewinnung von Nährstoffen unter Stress sein kann, und er wird von Immunzellen zur Probenahme und Überwachung von Gewebeumgebungen verwendet². Die Macropinozytose weist Merkmale auf, die sie von anderen Formen der Endozytose unterscheiden, einschließlich der charakteristischen, großen (>0,2 mm Durchmesser) vakuolären Makropinosomen, der nicht-selektiven Natur der Aufnahme von Flüssigkeit und gelösten Stoffen und der begleitenden Ausdehnungen der Plasmamembran, die opportunistisch in Makropinosomen internalisiert werden³. Die nicht-selektive Natur dieser Aufnahme bedeutet, dass die Sortierung und das Recycling schnell erfolgen müssen, um essentielle lösliche Proteine und Plasmamembranproteine zu retten, indem sie wieder an die Zelloberfläche zurückgeführt werden. Ein Großteil des Materials, das in Makropinosomen aufgenommen wird, ist für den Abbau in Lysosomen bestimmt und wird durch Makropinosomenreifung und Fusion mit anderen Endosomen in endo/lysosomale Wege geleitet. Plasmamembranproteine können auch aus Makropinosomen wieder an die Zelloberfläche zurückgeführt werden. Es besteht ein intensives Interesse auf dem Gebiet der Krebserkrankung, um den Prozess der Makropinozytose zu verstehen, die in Krebszellen aktiviert wird und dazu beiträgt, ihre Ernährung und Proliferation aufrechtzuerhalten 2,4,5,6. Die Macropinozytose tritt sowohl konstitutiv auf als auch kann durch Rezeptor-vermittelte Stimulation in Immunzellen weiter induziert werden, wo Makropinosomen die Rezeptorsignalisierung beherbergen, zur endo/lysosomalen Prozessierung der Antigenpräsentation beitragen und ein Eintrittsportal für eine Vielzahl von Viren, Bakterien und anderen Krankheitserregern darstellen ^3,7.

Macropinosomen haben nur wenige markante oder einzigartige Marker. Sie sind am einfachsten während ihrer Bildung an der Basis dramatischer, aktinreicher Zelloberflächenkräuselungen zu identifizieren, die Flüssigkeit^{fast verschlingen 8}. Unmittelbar nach dem Verschluss wird das F-Aktin um die Makropinosomen depolymerisiert, und die Makropinosomen selbst unterliegen dynamischen Veränderungen, die mit homo- und heterotypischer Fusion, Tubulation und Schrumpfung verbunden sind⁹. Macropinosomen sind auch auf ultrastruktureller Ebene schwer zu identifizieren, da sie keine charakteristischen Hüllen oder andere Merkmale aufweisen und lediglich als Vakuolen unterschiedlicher Größe erscheinen. Ohne definitive Membranmarker werden Makropinosomen am einfachsten und traditionellsten durch ihre flüssige Fracht definiert, die experimentell durch die Verwendung von fluoreszierendem Dextran erfolgt. Dextran ist ein von Glukose abgeleitetes komplexes Polysaccharid, das an eine große Anzahl von fluoreszierenden oder elektronendichten Markern gekoppelt und dem Medium zur Aufnahme durch Zellen zugesetzt oder zur Aufnahme in Gewebe perfundiert werden kann. Darüber hinaus wird Dextran mit hohem Molekulargewicht (MW) (70 kDa) heute als größenselektive Fracht für Makropinosomen angesehen, da es nicht in andere, kleinere endozytäre Vesikel eindringt, und es ist zur gebräuchlichsten Markierung für Makropinozytose geworden^10,11. Bei der Betrachtung der Makropinozytose werden typischerweise Zellen mit einem Impuls aus fluoreszierendem Dextran inkubiert und fixierte oder lebende Zellen für die Fluoreszenzbildgebung verwendet, um den Bolus der Dextranmarkierung in Zellen in Makropinosomen zu betrachten. Aufgrund ihrer Größe können unmarkierte Makropinosomen in einigen Zelltypen auch mittels Phasenkontrast- oder Hellfeldmikroskopie betrachtet werden, wobei Makropinosomen als große weiße leere Vakuolen erscheinen. Aus den Phasenkontrastbildern der Zellen werden einige Kontextinformationen gewonnen, und diese Bilder können dann zusätzlich mit Fluoreszenzbildern überlagert werden, um die Aufnahme von fluoreszierendem Dextran darzustellen^12,13. Dextrane unterschiedlicher Größe und mit unterschiedlichen Markierungen können zur Überwachung der Flüssigkeitsaufnahme in mehrere zelluläre und endozytäre Signalwege ^10,14,15 verwendet werden^, und Dextran kann auf Zellkulturen aufgetragen oder in Mäuse für die intravitale Bildgebung^{perfundiert werden 16} oder sogar in Fliegenembryonen¹⁷ für die Lebendbildgebung injiziert werden.

Zu den Schwierigkeiten bei der Verwendung von Dextran zur Verfolgung von Makropinosomen gehören sein Austritt aus Makropinosomen nach der Fixierung oder Permeabilisierung von Zellen, seine verdünnten oder schwer nachweisbaren Mengen in Zellen, die keine aggressive Makropinozytose durchführen, und seine dynamische Entfaltung und Dispersion in Zellen während der Makropinosomenreifung³. Diese Probleme werden in den meisten Experimenten verschärft, die darauf ausgelegt sind, die Aufnahme eines einzelnen Dextranimpulses zu verfolgen, der den Zellen zugesetzt und dann abgewaschen wird.

Stattdessen werden in dieser Arbeit die Vorteile des Auftragens von fluoreszierendem Dextran auf die Zellen und dessen Belassen im Medium während der Live-Bildgebung beschrieben, um eine kontinuierliche Aufnahme in die Zellen aufzuzeichnen. Dies verstärkt das Dextran-Signal in Makropinosomen und nachfolgenden Endosomen, die den gesamten Reifungsweg anzeigen. Betrachtet man markierte Makropinosomen vor dem unmarkierten (schwarzen) Inneren der Zellen, so zeigt sich in einer kontrastreichen inversen Einstellung alle Merkmale der Makropinosomen, und umgekehrt hebt das stark fluoreszierende Medium außerhalb der Zellen die dynamische Kräuselung der Zelloberfläche hervor. Diese Methode beschreibt die Live-Bildgebung von Dextran für lichtmikroskopische, konfokale Bildgebung und für dessen Detektion nach Zellfixierung durch korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM). Die hier enthaltene Bildgebung wurde an verschiedenen Zelltypen durchgeführt, um die breite Anwendbarkeit dieser Ansätze zu demonstrieren, einschließlich aktivierter Makrophagen und Mikrogliazellen, bei denen die Makropinozytose sehr aktiv und schnell ist, und bei Krebszellen, bei denen Makropinozytose relativ seltener vorkommt.

Protokoll

1. Vorbereitung der Zellen auf 35-mm-Glasbodenschalen (Tag 0)

1. Zelllinien in vollständigem Medium, ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem (für RAW264.7) oder normalem fötalem Kälberserum und 1 % L-Glutamin, bei 37 °C in befeuchtetem 5 % CO₂ -Inkubator aufbewahren und passieren.
2. Plattieren Sie die entsprechende Anzahl von Zellen, um eine Konfluenz von 60 % in 24 Stunden zu erreichen, auf 35-mm-Glasbodenschalen.
   HINWEIS: Die empfohlene Zelldichte liegt zwischen 2 ml von 0,15 x 10⁶ Zellen/ml bis 0,25 x 10⁶ Zellen/ml für die hier beschriebenen Brustkrebszellen RAW264.7, BV2 Mikrogliazellen und MDA-MB 231.

2. Transfektion von Fluoreszenz-DNA-Plasmiden (Tag 1) - optional

HINWEIS: Verschiedene fluoreszenzmarkierte Proteine und Sonden können vorübergehend oder stabil in klonierten Zelllinien exprimiert werden, um spezifisch Aktin-Rüschen und Kompartimente im endozytären Signalweg zu markieren, wie z. B. frühe Endosomen, späte Endosomen oder Lysosomen.

1. Transfizieren Sie die Zellen mit einem lipidbasierten Transfektionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers, 1 Tag nach der Beschichtung in einer Gewebekulturhaube.
2. 2 μg endotoxinfreies gereinigtes DNA-Plasmid in mindestens 125 μl essentiellem Medium (reduziertes Serum) verdünnen. Vorsichtig mischen und 5 min bei Raumtemperatur ziehen lassen.
3. 5 μl Transfektionsmittel in mindestens 125 μl essentiellem Medium (reduziertes Serum) verdünnen. Vorsichtig mischen und 5 min bei Raumtemperatur ziehen lassen.
4. Kombinieren Sie das verdünnte DNA-Plasmid und das verdünnte Transfektionsreagenz und inkubieren Sie weitere 10 Minuten, bevor Sie es tropfenweise in die Zellen geben.
5. Inkubieren Sie die Zellen mit dem Transfektionskomplex bei 37 °C in einem befeuchteten 5%igen CO2-Inkubator für 3-4 Stunden, bevor Sie sie durch frisches Vollkulturmedium ersetzen.
6. Verwenden Sie die transfizierten Zellen am nächsten Tag für Experimente oder unterziehen Sie sie einer Klonierung mit begrenzter Verdünnung, um stabil exprimierende Zelllinien zu erhalten.

3. Visualisierung von endozytären Vesikeln und Makropinosomen (Tag 2)

HINWEIS: Fluoreszierende Dextrane (Dextran Alexa Fluor 488/647 bei 10 kDa MW und Dextran Oregon Green 488/Tetramethylrhodamin bei 70 kDa MW, anionisch, Lysin fixierbar) mit unterschiedlichen Molekulargewichten werden verwendet, um die Aufnahme in die flüssige Phase in eine Reihe von endozytären Signalwegen^{zu überwachen 14}. 70 kDa Dextran für Makropinosomen und 10 kDa für alle Signalwege.

1. Bereiten Sie Dextran(e) als 2x konzentrierte Suspension bei 200-500 ng/ml in vorgewärmtem Kulturmedium für die Zugabe zu den Zellen vor.
2. OPTIONAL: Experimente können eine vorherige oder gleichzeitige Zugabe von Nahrungsergänzungsmitteln oder Arzneimitteln erfordern, um die endozytäre Aktivität zu beeinflussen. Zum Beispiel werden Makrophagen und Mikrogliazellen mit Wachstumsfaktoren (z. B. 200 ng/ml CSF-1) oder aktivierenden Liganden (z. B. LPS 100 ng/ml oder 300 ng/ml CpG) vorbehandelt, um die Kräuselung und Makropinozytose zu verbessern. Kultivieren Sie die Krebszellen in einem geeigneten serumfreien Medium für 12-16 h, bevor Sie das Dextran in das vollständige Medium aufnehmen. Die empfohlene Zelldichte finden Sie in Schritt 1.2.
3. Zur Vorbereitung der Live-Bildgebung positionieren Sie die in Glasbodenschalen gezüchteten Zellen auf dem Tisch eines inversen Konfokalmikroskops, das mit einem 37 °C warmen Heizkissen und einem 5 % CO₂ -befeuchteten Inkubator ausgestattet ist.
4. Das überschüssige Medium wird abgesaugt, wobei 500 μl des gesamten Mediums in der Glasbodenschale verbleiben.
5. Finden Sie eine geeignete Zellregion und legen Sie den Fokus fest. Für die Zeitraffer-Bildgebung wählen Sie vor der Aufnahme die geeigneten Fluoreszenzlaser, Filter und Einstellungen vor. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen, um einzelne Zellen und Makropinosomen aufzulösen.
   1. Nehmen Sie die Aufnahme des interessierenden Bereichs auf einem inversen konfokalen Mikroskop mit einem 63x 1,4 NA Ölimmersionsobjektiv von Plan Apochromat auf.
   2. Wählen Sie 512 x 512 für die Bildgröße, bidirektionales Scannen für schnelle Bildgebung.
   3. Fokussieren Sie sich auf eine einzelne Fokusebene der Zellen. Legen Sie diese Option so fest, dass sie als einzelne Schicht erfasst wird, oder stellen Sie eine optische Schichtdicke (Nyquist) von ca. 0,3 μm ein, um sie als Z-Stapel zu kombinieren.
   4. Wählen Sie einen Zeitraffer mit einem Intervall von 5 s für eine Dauer zwischen 20 und 45 Minuten, abhängig von den spezifischen Zelltypen.
   5. Wählen Sie den Hardware-Autofokus/die Fokusverfolgung, um die Bildstabilisierung während der Aufnahme für eine angemessene Dauer entsprechend den spezifischen Zellentypen zu unterstützen.
   6. Fügen Sie das gleiche Volumen von 2x Dextran-Spike-Medium hinzu und starten Sie sofort die Live-Bildaufnahme für Makrophagen. Warten Sie 20 Minuten, bevor Sie die langsamere Aufnahme in MDA-MB 231-Zellen abbilden.
      HINWEIS: Mit dieser Methode wurden die BV2-Zellen mit zwei Fluorophorkanälen erfolgreich auf einer einzigen Ebene mit maximaler Geschwindigkeitsverfolgung kontinuierlich für 45 Minuten nach Zugabe des Dextran-Gemisches abgebildet. Um frühe Makropinosomen in RAW 264.7-Zellen zu erkennen, in denen die Makropinozytose sehr schnell erfolgt, nehmen Sie eine einzelne Schicht (für eine schnelle Bildgebung) oder einen Z-Stapel von 4-6 Schichten (für die 3D-Erfassung) auf und führen Sie einen Zeitraffer mit einem 5-s-Intervall für 20 Minuten nach Zugabe von Dextran durch. Erfassen Sie für MDA-MB 231-Zellen optimale Z-Stacks zwischen 10 und 15 Slices mit 5-s-Intervallen für 40 Minuten.

4. Korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM) (Tag 3) - Optional

1. Bereiten Sie die Zellen gemäß den Schritten 1, 2 und 3 des Protokolls mit Anpassungen vor. Kurz gesagt, züchten Sie 0,2 x 10⁶ Zellen/ml RAW264,7 Zellen auf gegrillten Glasbodenschalen (35 mm Schale, Nr. 1,5 gerastertes Deckglas, 14 mm Glasdurchmesser, unbeschichtet), transfizieren Sie es mit einem fluoreszierenden Plasmid (z. B. mCherry-2xFYVE) und lassen Sie es über Nacht vor der Zugabe von Dextran-488 (70 kDa) für 20 Minuten bei 37 °C, 5 % CO₂ -Befeuchtungsbrutschrank stehen.
2. Waschen Sie die Zellen schnell mit 1 ml eiskaltem PBS und fixieren Sie sie mit 0,1 % Glutaraldehyd.
3. Erfassen Sie die fixierten Zellbilder des dextran-488 und mCherry-2xFYVE an einem konfokalen Mikroskop.
4. Nehmen Sie Hellfeldbilder auf, um die Gitterpositionen zu identifizieren, bevor die Schüsseln für die Transmissionselektronenmikroskopie (EM) bearbeitet werden, wie zuvor beschrieben¹⁸. Kurz gesagt, fixieren Sie die Zellen in 2,5 % Glutaraldehyd, postfixieren Sie sie in 1 % reduziertem Osmiumtetroxid, färben Sie sie en-bloc mit 2 % Uranylacetat und dehydrieren Sie sie dann durch eine Reihe von Ethanol, bevor Sie sie in LX112-Harz einbetten. Schneiden Sie die gerasterten Stellen aus dem Block heraus und sammeln Sie ultradünne Schnitte mit einem Ultramikrotom. Nehmen Sie Bilder mit einem Elektronenmikroskop bei 80 kV mit geeigneter Software für Bildgebungssysteme auf.

5. Datenverarbeitung und Visualisierung (Tag 4)

HINWEIS: FIJI - ein Open-Source-Bildanalysepaket - wird für die Visualisierung und Analyse^{verwendet 33}.

1. Duplizieren Sie die Rohdaten für die Verarbeitung, um den F.A.I.R.-Datenprinzipien zu entsprechen, d. h. dass Forschungsdaten auffindbar, zugänglich, interoperabel und wiederverwendbar sind.
2. Passen Sie die Helligkeit und den Kontrast für Bildsätze gleichermaßen anhand der Histogrammdaten an.
3. Zeigen Sie die Bilder als Projektionen mit maximaler Intensität aus Z-Stapel-Bildern an, die erfasst wurden.
4. Fügen Sie die Maßstabsleiste für Bildsätze ein.
5. FOV-Daten zuschneiden/drehen (optional). Erstellen Sie repräsentative Panels für die Zeitreihendaten.
6. Zur weiteren Analyse und Quantifizierung quantifizieren Sie die Fluoreszenzintensität von Dextran, das als Maß für die Makropinozytoseaktivität in die Zellen aufgenommen wird. Um die Analyse auf einzelne Zellen zu beschränken, verwenden Sie das hier beschriebene bildgebende Verfahren.
   1. Kehren Sie die LUT um, um die Farbe für Zellbereiche ohne Fluoreszenz umzukehren und so einen Schwellenwert durchzuführen.
   2. Segmentieren Sie das Vordergrundobjekt und erstellen Sie eine Zellmaske, um einzelne Zellen zu identifizieren.
   3. Verwenden Sie die Zellmaske in Verbindung mit einer zuvor veröffentlichten Methode¹⁹ , die einzelne Makropinosomen identifiziert und misst. Verwenden Sie diese Metriken, um die Makropinozytose zu quantifizieren, einschließlich Größe, Anzahl und Gesamtaufnahme pro Zelle.

Ergebnisse

Der Ansatz, unmarkierte lebende Zellen abzubilden, die in eine hohe Konzentration von fluoreszierendem Dextran getaucht sind, hat mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen bildgebenden Verfahren zur Verfolgung der Makropinozytose. Durch die Darstellung der Bilder im Relief erscheinen die Zellkörper schwarz und ermöglichen eine verbesserte Visualisierung der dramatischen Kräuselung der Zelloberfläche vor einem hellen, fluoreszierenden Hintergrund, gefolgt von der Fluidphaseninternali...

Diskussion

In diesem Artikel werden Variationen traditioneller Methoden zur Verwendung der Dextran-Markierung zur Verfolgung der Makropinozytose beschrieben, basierend auf der Live-Bildgebung von Zellen, die kontinuierlich in fluoreszierenden Dextranen gebadet wurden, und der Visualisierung der Aufnahme von unmarkierten Zellen auf dem schwarzen Hintergrund. Das optimierte Protokoll bietet die Möglichkeit, zwischen verschiedenen intrazellulären Vesikeln zu unterscheiden und ermöglicht eine räuml...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2% Osmium Tetroxide	ProSciTech	EMS19192
647-Transferrin	Molecular Probes, Invitrogen	T23366
BV2 cells	Gift kindly given to us by Dr Liviu Bodea (Queensland Brain Institute)	-
CpG (Class B) B	Integrated DNA Technologies	Custom Order
Dextran Alexa Fluor 488  at 10 kDa MW	Life Technology Australia Pty Ltd	D22910
Dextran Alexa Fluor 647  at 10 kDa MW	Life Technology Australia Pty Ltd	D22914
Dextran Oregon Green 488 at 70 kDa MW	Life Technology Australia Pty Ltd	D1818
Dextran Tetramethylrhodamine at 70 kDa MW	Life Technology Australia Pty Ltd	D7173
DMEM medium with sodium pyruvate and L-glutamine	Gibco Invitrogen	#11995
Fetal Calf serum	Interpath Services Pty Ltd	SFBS-F
Glutaraldehyde aqueous solution, EM Grade 25%	ProSciTech	C002
Jeol 1011 electron microscope	JEOL	-
L-Glutamine	Gibco Invitrogen	25030081
Lipofectamine 2000	Gibco Invitrogen	11668019
MatTek  Glass Bottom Dish 35 mm, uncoated grid	MatTek Corporation	P35G-2-14-CGRD
MatTek glass bottom dishes 35 mm uncoated	MatTek Corporation	P35G-1.5-14C
MDA-MB 231 cells	ATCC	HTB-26
Opti-MEM reduced serum medium	Thermo Fisher Scientific	31985088
Plasmid mCherry-2XFYVE	Gift kindly given to us by Dr Frederic Meunier (University of Queensland)	-
Plasmid mCherry-PLCδ-PH	Gift kindly given to us by Dr Frederic Meunier (University of Queensland)	-
Raw264.7 cells	ATCC	TIB-71
RPMI medium 1640,without L-glutamine	Gibco Invitrogen	#21870
Ultrapure LPS	Jomar Life Research Pte Ltd	TLR-3PELPS
Uranyl Acetate	ProSciTech	C079
Zeiss inverted LSM880 confocal microscope	Zeiss	-