Im lebenden Organismus Messung des isometrischen Drehmoments des Dorsiflexors der Hintergliedmaßen vom Schwein

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt prägnante experimentelle Details zur Auswertung und Interpretation von In-vivo-Drehmomentdaten , die durch elektrische Stimulation des gemeinsamen Peronealnervs bei betäubten Schweinen gewonnen werden.

Zusammenfassung

Eine zuverlässige Beurteilung der Stärke der Skelettmuskulatur ist wohl das wichtigste Ergebnismaß in neuromuskulären und muskuloskelettalen Erkrankungen und Verletzungsstudien, insbesondere bei der Bewertung der Wirksamkeit regenerativer Therapien. Darüber hinaus ist ein kritischer Aspekt bei der Übersetzung vieler regenerativer Therapien der Nachweis der Skalierbarkeit und Wirksamkeit in einem großen Tiermodell. Verschiedene physiologische Präparate wurden etabliert, um intrinsische Muskelfunktionseigenschaften in grundlegenden wissenschaftlichen Studien, vor allem in Kleintiermodellen, zu bewerten. Die Praktiken können kategorisiert werden als: in vitro (isolierte Fasern, Faserbündel oder ganzer Muskel), in situ (Muskeln mit intakter Vaskularisation und Innervation, aber distale Sehne, die an einem Kraftaufnehmer befestigt sind) und in vivo (Strukturen des Muskels oder der Muskeleinheit bleiben intakt). Jede dieser Vorbereitungen hat Stärken und Schwächen; Ein klarer Vorteil der In-vivo-Festigkeitsprüfung ist jedoch die Möglichkeit, wiederholte Messungen am selben Tier durchzuführen. Hierin werden die Materialien und Methoden zur zuverlässigen Beurteilung des isometrischen Drehmoments vorgestellt, das von den dorsiflexormuskeln der Hintergliedmaßen in vivo als Reaktion auf die peroneale elektrische Standardstimulation bei anästhesierten Schweinen erzeugt wird.

Einleitung

Die Hauptfunktion der Skelettmuskulatur besteht darin, Kraft zu erzeugen, die letztendlich Aktivitäten wie Atmen, Essen und Gehen ermöglicht. Zustände, die die Funktionsfähigkeit der Skelettmuskulatur verringern, können zu einer verminderten Leistung (Beruf oder Sport), einer Behinderung oder zum Tod führen. Zum Beispiel ist die Aufrechterhaltung der Muskelmasse und -funktion in alternden Bevölkerungen positiv mit der Lebensqualität und der Fähigkeit verbunden, grundlegende und instrumentelle Aktivitäten des täglichen Lebens auszuführen ^1,2. Und die abnehmende Muskelkraft bei Duchenne-Muskeldystrophie-Patienten führt zu Gehunfähigkeit und Atemversagen, was letztendlich zu einer vorzeitigen Mortalität beiträgt ^3,4,5. Daher ist die Messung der Muskelkraft ein kritisches Ergebnismaß in Studien mit neuromuskulären Erkrankungen oder Verletzungen.

Das maximale freiwillige isometrische oder isokinetische Drehmoment (und/oder Ermüdungsindex) wird in klinischen Studien häufig als Index der funktionellen Kapazität^{verwendet 6}. In Tierversuchen können analoge Messungen in vivo mittels elektrischer Nervenstimulation unter Narkose durchgeführt werden. Insbesondere sind In-vivo-Präparate minimal-invasiv, wobei Muskulatur, Sehnen, Gefäße und Innervation intakt bleiben und daher wiederholte funktionelle Bewertungen 7,8,9,10,11 ermöglichen. Dieses Präparat wird häufig in kleinen Nagetiermodellen und in geringerem Maße in größeren Tiermodellen wie Kaninchen 12, Hunden ^13,14, Schafen 15 und Schweinen^16,17 verwendet. Die allgemeine Anwendung einer solchen Methodik könnte sich auf viele translationale Forschungsstudien auswirken, z. B. in gentechnisch veränderten Schweinemodellen (Schweinemodellen der spinalen Muskelatrophie (SMA)¹⁸. Hierin werden Methoden zur Beurteilung des durch Nervenstimulation induzierten maximalen isometrischen Drehmoments der porcinen dorsiflexormuskelgruppe in vivo vorgestellt. Die vorgestellten Techniken wurden zunächst von den ursprünglich entwickelten Techniken zur Beurteilung des Vordermuskeldrehmoments der Maus^19,20 angepasst und anschließend durch Erfahrung bei der Untersuchung der Drehmomentproduktionskapazität nach einer Verletzung^verfeinert 17,21,22,23,24,25,26,27,28 und während der Entwicklung¹⁶ in verschiedenen Schweinemodellen.

Dieses Protokoll hebt die isometrische In-vivo-Drehmomentmessung unter Verwendung einer Methodik hervor, die einen Computer erfordert, der in eine Wägezelle und einen elektrischen Stimulator integriert ist. Die hier vorgestellten Verfahren verwenden eine handelsübliche integrierte Swine Isometric Footplate Test Apparatus, Plattformapparatur und entsprechende Software (siehe Materialverzeichnis). Die Methodik kann jedoch angepasst werden, um andere kommerziell verfügbare oder maßgeschneiderte Software, Datenerfassungsgeräte und Stimulatoren zu verwenden. Diese Methoden sind für den Einsatz in einem speziellen großen Tierchirurgiesaal vorgesehen, der mit Standardausrüstung ausgestattet ist, wie z. B.: verriegelbarer OP-Tisch, zweiter Verriegelungstisch gleicher Höhe für die Testplattform, Beatmungs- und Überwachungsgeräte sowie Heizmatte oder andere Geräte zur Aufrechterhaltung der Körpertemperatur.

Die folgenden Teammitglieder werden benötigt, um diese Methoden durchzuführen: ein qualifizierter Anästhesietechniker und zwei Studienmitarbeiter, um die Funktionstests durchzuführen. Diese Menschen werden gemeinsam an der anfänglichen Stabilisierung der Extremität auf dem Plattformapparat arbeiten. Dann wird eines der beiden Mitarbeiter für die Platzierung / Positionierung der Elektroden und das andere für die Computeranwendungen während der Tests verantwortlich sein.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem Tierschutzgesetz, den Durchführungsbestimmungen zum Tierschutz und den Grundsätzen des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren durchgeführt. Frühere Tests haben gezeigt, dass diese Methoden zuverlässig^{sind 26} und keine nachteiligen Auswirkungen auf die Gesundheit oder die Funktion der Gliedmaßen des Schweins haben. Die Tests wurden so oft wie wöchentlich ohne unerwünschte Ereignisse^{durchgeführt 23}. Darüber hinaus können prä- und postoperative Eingriffe am selben Tag getestet werden, ohne das Tier übermäßig zu belasten oder eine neuromuskuläre Dysfunktion auszulösen.

1. Computer einrichten

1. Stellen Sie sicher, dass die anfängliche Einstellung und Kalibrierung der Apparate und Komponenten gemäß den Herstellungsspezifikationen durchgeführt wird (siehe Materialtabelle). Es wird empfohlen, eine Kalibrierung mit einem Gewichtsbereich von 0,2 bis 2,5 kg durchzuführen.
   HINWEIS: Das Drehmoment wird von einem 140-mm-Fußpedal (0,14 m) gemessen, das an einen linearen Drehmomentsensor mit einer Kapazität von 50 Newtonmetern (N·m) angeschlossen ist. Die Verstärkung des Instruments ist standardmäßig auf 25 N·m Kapazität skaliert, um der erwarteten Drehmomentproduktion besser gerecht zu werden. Die Kalibrierung erfolgt durch Anlegen einer bekannten Masse (z. B. 1 kg) auf das Fußpedal in einem bekannten Abstand (z. B. 100 mm von der Drehachse) und Berechnung des Drehmoments. Zum Beispiel entspricht 1 kg 9,806 N, die bei 0,1 m angewendet werden, um 0,9806 N · m Drehmoment zu erreichen. Anschließend kann eine Beziehung zwischen dem am Drehmomentsensor angelegten Drehmoment und der entsprechenden vom Drehmomentsensor abgegebenen Spannung hergestellt werden. Die Drehmomentsensoren des Autors haben die Linearität dieser Beziehung von 0,2-20 kg bestätigt, die auf eine bestimmte 40-cm-Kalibrierplatte angewendet wird. Aufgrund der Länge des Standardpedals wird ein Kalibrierbereich von 0,2-2,5 kg empfohlen. Dies erzeugt genügend Signal, um den Skalierungsfaktor durch lineare Regression zu berechnen.
2. Schalten Sie den Computer, den Stimulator, das Wandlersystem und die analog-digitale Schnittstelle etwa 30 Minuten vor dem Test ein, um wärmebedingte Materialänderungen zu stabilisieren, die sich auf die elektrischen Eigenschaften auswirken können. Wählen Sie das entsprechende und angeschlossene Datenerfassungsgerät (Data Acquisition, DAQ) aus.
3. Richten Sie bei Bedarf experimentelle Parameter in der Software ein; Die Software ermöglicht eine gespeicherte Studienvorlage. Bereiten Sie das Einrichten des Experiments (d. h. der Studienvorlage) zum Erstellen einer neuen Studie mithilfe der Arbeitsmappenoption Neue Studie erstellen vor.
   HINWEIS: Experimentelle Parameter können vor Beginn der Studie vorgeladen werden, was dazu führt, dass zusätzliche spezifische Experimentinformationen wie Geschlecht, Körpermasse, Geburtsdatum, Zeitpunkt des Tests, Behandlungsgruppe oder ähnliche Variablen nach Bedarf enthalten sind. Die Parameter des Studienaufbaus können gespeichert und im gesamten Experiment verwendet werden.
4. Wählen Sie zu Beginn jeder Auswertung die zuvor erstellte Studie aus. Fügen Sie ein neues Tier hinzu, wenn dies der erste Test für das zu testende Schwein ist, und befolgen Sie die Eingabeaufforderung für die in die Studie eingegebenen Variablen.
5. Klicken Sie auf Experiment vorbereiten , sobald Sie mit der Studie beginnen können, die zur Optimierung der Elektrodenplatzierung erforderlich ist. Erneute Zuckungen an den Nerv abgeben und gleichzeitig die optimale Platzierung bestimmen, sobald die Elektroden platziert sind (siehe Schritt 3.6.).
6. Klicken Sie zuerst auf Instant Stim konfigurieren und passen Sie dann die Pulsfrequenz, die Pulsbreite, die Anzahl der Impulse, die Zugfrequenz und die Laufzeit an.
7. Klicke dann auf Instant Sim, um wiederholte Zuckungen zu liefern. Alternativ können Sie die manuelle Trigger-Taste an der Stimulatoreinheit drücken, um manuell ein Zucken zu geben.
8. Öffnen Sie den Live Data Monitor während des Studienprotokolls, wenn Sie bereit sind, das gesamte Experiment zu starten, um eine Echtzeituntersuchung / Visualisierung der Kontraktionen zu ermöglichen. Klicken Sie auf Experiment ausführen , wenn Sie für den Beginn des Experiments vorbereitet sind (nach der Tierpräparation siehe Schritt 2).

2. Vorbereitung und Aufrechterhaltung der Anästhesie

1. Schnelle männliche oder weibliche Schweine, 40-90 kg, über Nacht vor dem Anästhesieereignis, Wasser ad libitum zulassen. Erhalten und notieren Sie das korrekte Körpergewicht des Schweins am Tag des Eingriffs.
2. Induzieren Sie eine Anästhesie mit intramuskulären Injektionen von Tiletamin/Zolzepam (Telazol, 4-6 mg/kg), Xylazin (1-3 mg/kg) und Propofol (2,6 mg/kg). Zunächst mit 5% Isofluran über Gesichtsmaske pflegen.
3. Intubieren Sie das Schwein mit einem Endotrachealtubus und legen Sie es auf ein automatisches Beatmungsgerät. Halten Sie das Schwein auf Spitzendruck bei 20 cm H₂O, einem anfänglichen Tidalvolumen von 10 ml / kg und Atemfrequenzen bei 8-12 Atemzügen / min.
4. Stellen Sie die Einstellung des Beatmungsgeräts so ein, dass ein Endgezeiten-PCO₂ von 40 ± 5 mmHg aufrechterhalten wird. Aufrechterhaltung der Anästhesie mit 1%-3% Isofluran in 30%-37%_O2.
5. Halten Sie die Körpertemperatur des Schweins für die Dauer des Protokolls bei 37 °C. Setzen Sie bei Bedarf Ohrvenen- und Foley-Katheter für die Flüssigkeitsabgabe und Urinsammlung ein.
   HINWEIS: Die Verwendung einer chirurgischen Plananästhesie verhindert sekundäre Kontraktionen während des Tests, insbesondere von den Gesäßmuskeln.
6. Überwachen Sie die Tiefe der Anästhesie über Augenreflex und -position, fehlenden Kiefertonus, Herzfrequenz (Bereich 80-150 bpm), systolischen Blutdruck (Bereich 120-70 mmHg) oder eine Kombination all dieser Anzeichen.
7. Bereiten Sie sowohl die rechten als auch die linken Hinterbeine vor, sobald das Schwein vollständig betäubt und stabil ist, indem Sie zuerst die Gliedmaßen mit Wasser und Seife reinigen, um Ablagerungen zu entfernen, und dann die Haare von der Haut rasieren. Achten Sie genau auf den seitlichen Kniebereich, der später für die Elektrodenplatzierung verwendet wird.
8. Transportieren Sie das Schwein auf einen OP-Tisch und legen Sie es sicher in Rückenlage. Positionieren Sie das Schwein in Richtung des Tischfußes mit den Gesäßmuskeln am oder leicht über dem Ende des Tisches.
   HINWEIS: Dadurch können der Operationstisch und der Tisch, auf dem sich das Testgerät befindet, widerstehen.
9. Extubieren Sie das Schwein nach dem Test und lassen Sie es sich erholen. Standard-Schweinefutter und -wasser sollten ersetzt werden, sobald sich das Schwein vollständig erholt hat und sich frei im Käfig bewegen kann.
   HINWEIS: Eine Analgesie nach dem Eingriff ist für den In-vivo-Test allein unnötig; Carprofen und/oder Buprenorphin SR können jedoch gemäß tierärztlicher Empfehlung zur Verfügung gestellt werden. Die Konsultation eines örtlichen Tierarztes wird empfohlen. Die hier aufgeführten Anästhesie und Medikamente dienen nur zur Orientierung und sind derzeit an der University of Minnesota zugelassen. Die Aufrechterhaltung der Anästhesie mit Isofluran wurde aufgrund seines schnellen Auftretens und Ausgleichs und seiner minimalen Auswirkungen auf die in vivo erzeugte Nervenstimulation des Drehmoments^{gewählt 29}. Achten Sie auf eine Konsistenz der Anästhesieparameter in allen Studien. Während des Protokolls wird die Beurteilung und Aufzeichnung der Anästhesie in Abständen von 15 Minuten durchgeführt. Die Aufzeichnung erfolgt auf der Grundlage der lokalen Richtlinien und Anforderungen des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) und des US-Landwirtschaftsministeriums (USDA).

3. Bewertung des isometrischen In-vivo-Drehmoments

1. Legen Sie den Fuß auf die Fußplatte des Kraftaufnehmers. Verwenden Sie einen flexiblen zusammenhängenden Verband, um den Fuß an der Fußplatte zu befestigen.
   HINWEIS: Eine ganze Rolle pro Fuß ist notwendig; Im Idealfall ist die 4-Zoll x 5-Yard-Rolle ausreichend.
2. Halten Sie den Fuß in Position auf der Fußplatte mit dem Knöchel an der neutralen (A) und sichern Sie den Fuß an der Platte, indem Sie den zusammenhängenden Verband im Stil eines geschlossenen Korbgewebes (B) um den Fuß und die Fußplatte wickeln.
   HINWEIS: Die beiden Studienmitarbeiter müssen gleichzeitig die einzelnen (A) und (B) Aufgaben ausführen.
3. Positionieren Sie den Knöchel in einem rechten Winkel, sobald der Fuß an der Fußplatte befestigt ist, definiert als 0 ° oder neutral als Referenz für Plantar- oder Dorsalflexionsgrade.

Abbildung 1: Bilder aus verschiedenen Blickwinkeln zeigen die Schweinebefestigung an der Fußplatte und die anatomische Ausrichtung auf dem Rahmen. Anatomische Landmarken für die vorderen Kompartimentmuskeln, den Fibularkopf, das Knie, das Tibiaplateau und den Femur werden notiert. Beachten Sie die Platzierung von subdermalen Elektrodenpaaren auf der seitlichen Seite des Beins. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

4. Stabilisieren Sie das Knie und den Knöchel im rechten Winkel.
5. Positionieren Sie zunächst die Gliedmaßenklemmstangen in der Nähe der benötigten Stellen. Wenn Sie bereit sind, beginnend mit dem medialen Aspekt der Extremität, richten Sie die Gliedmaßenklemmstange etwa auf dem Tibiaplateau aus.
6. Richten Sie dann die seitliche Gliedmaßenklemmstange am distalen Kopf des Femurs aus.
   HINWEIS: Zwischen dem Ende jedes Gliedmaßes verwendet die Klemmstange ein gefaltetes 4 x 4 Mullpad, um die Haut neben der Stange zu schützen.
7. Stabilisieren Sie die Stangen fest mit den feststellbaren Rändelschrauben.
   HINWEIS: Die Gliedmaßenklemmstangen sind nicht aufeinander abgestimmt, sondern orientieren sich an der Anatomie des Schweins.
8. Reinigen Sie die Haut um den Fibularkopf, indem Sie 70% Alkohol über saubere Gaze in konzentrischen Kreisen auftragen, beginnend in der Mitte der beabsichtigten Elektrodenplatzierung und nach außen. Platzieren Sie die sterilen perkutanen Nadel- (50 mm, 26 G monopolaren) und elektromyographischen (EMG) Elektroden (siehe Materialtabelle) über den Peronealnerv. Implantatelektroden subdermal, ca. 5-10 mm.
9. Optimieren Sie die Elektrodenplatzierung mit steigenden Stromamplituden, wie am Stimulator eingestellt. Beginnen Sie bei 100 mA und erhöhen Sie nach Bedarf.
   HINWEIS: 300-500 mA sind normalerweise für das maximale Zuckungsmoment erforderlich.
10. Visualisieren Sie die Größe des Zuckungsdrehmoments in der Live-Datenansicht und über dem vorderen Kompartiment des Schweins. Die Hufe können sich auch spreizen und nach oben bewegen.
11. Stellen Sie sicher, dass das hintere Kompartiment oder der Nervus tibia während der Stimulation nicht aktiviert wird. Untersuchen und tasten Sie die Kontraktion des hinteren Kompartiments und die Abwärtsbewegung der Hufe während der Stimulation visuell ab.
12. Untersuchen Sie die Plateauregion der tetanischen Kontraktion aus der Live-Drehmoment-Zeit-Verfolgung in den folgenden Schritten auf Mangel an antagonistischer Muskelrekrutierung (dh Plantarflexion für dieses Protokoll).
13. Elicit maximales isometrisches tetanisches Drehmoment unter Verwendung der folgenden Stimulationsparameter: 100 Hz, 0,1 ms Pulsbreite, über einen 800 ms Zug¹⁷, sobald die Elektrodenplatzierung und die Stimulationsamplituden optimiert sind.
    HINWEIS: Diese Parameter können für verschiedene kontraktile Auswertungen verwendet werden.

4. Protokoll für die Drehmoment-Fugenwinkelanalyse

1. Messen Sie das maximale isometrische tetanische Drehmoment über einen Bereich von Knöchelpositionen, die von neutral bis zu den nahen Endbereichen der Plantarflexion oder 0-50 ° der Plantarflexion reichen.
   HINWEIS: Die Verwendung von 10°-Schritten erfordert sechs Kontraktionen, und die inkrementelle Änderung kann für bestimmte experimentelle Fragen angepasst werden.
2. Beginnen Sie mit dem Lösen beider Verriegelungsschrauben der Goniometerstufe, um sich zwischen den Verbindungswinkeln zu bewegen. Stellen Sie sicher, dass beide Verriegelungsschrauben vor der nächsten Kontraktion angezogen sind.
   HINWEIS: Das Goniometer ist mit Gradmarkierungen versehen, um eine präzise Ausrichtung zu ermöglichen. Es ist wahrscheinlich 0 ° der Plantarflexion, die auf dem Goniometer um 180 ° versetzt ist. Seien Sie vorsichtig, um die beabsichtigte Positionierung sicherzustellen.
3. Bestimmen Sie die Zeit zwischen den Kontraktionen experimentell; 2 min reichen jedoch aus, um Ermüdung zu vermeiden.
   HINWEIS: Da der Knöchelgelenkwinkel inkrementell geändert wird, können sich die Nadelelektroden verschieben. Es kann notwendig sein, die Platzierung der Elektroden mit zuckenden Kontraktionen zu bestätigen, wie oben erwähnt (siehe Schritt 3.8).

5. Protokoll zur Drehmoment-Frequenz-Analyse

1. Positionieren Sie den Knöchel im gewünschten Gelenkwinkel. Achten Sie darauf, jedes Mal experimentell Tests im gleichen Gelenkwinkel durchzuführen.
   HINWEIS: Typischerweise werden Drehmoment-Frequenz-Analysen in einem einzigen Gelenkwinkel durchgeführt, der dem isometrischen Spitzendrehmoment entspricht, das aus der Drehmoment-Gelenkwinkel-Analyse abgeleitet wird. Das Spitzendrehmoment wird bei ~ 30-35 ° Plantarflexion erzeugt.
2. Messen Sie das maximale isometrische Drehmoment über einen Bereich von Stimulationsfrequenzen, die unverschmolzene Zuckungszüge bis hin zu und über diejenigen hinaus induzieren, die vollständig verschmolzenes Tetani induzieren.
   HINWEIS: Dies kann durch Stimulation bei 10, 20, 40, 60 und 100 Hz (0,1 ms Pulsbreite; 800 ms Zug) mit 2 Minuten zwischen jeder Kontraktion erreicht werden, um Ermüdung zu vermeiden. Abhängig von genauen experimentellen Fragestellungen und spezifischen Molchmodellen können die Frequenzen angepasst werden. Das bioenergetische Substrat, das höchstwahrscheinlich während einer 800-ms-Kontraktion zur Aufrechterhaltung des intrazellulären ATP verwendet wird, ist Phosphokreatin³⁰, und die Resynthese von Phosphokreatin beruht auf dem Phosphokreatin-Shuttle³¹. Die Phosphokreatin-Erholungskinetik zeigt eine bemerkenswerte Erholung von 90% oder mehr zwischen 90-120 s nach Beendigung der Kontraktion³⁰ an. Daher betragen die empfohlenen Ruheintervalle zwischen den Kontraktionen 90-120 s. Dies kann jedoch durch experimentelle Designs beeinflusst werden, einschließlich Muskelerkrankungen, Verletzungen und / oder Alterung.

6. Datenanalyse

1. Klicken Sie auf Ergebnisse analysieren , wenn Sie sich noch in der Software befinden, um das Analysefenster zu öffnen. Alternativ können Sie das Analyseprogramm auch direkt öffnen.
2. Ob mit einer automatisierten Datenplattform oder manueller Analyse, berechnen Sie die verschiedenen Variablen bei der Analyse einzelner isometrischer Wellenformen.
   HINWEIS: Zu diesen Variablen gehören: maximales Zuckungsmoment, maximales tetanisches Drehmoment und kontraktile Eigenschaften in Bezug auf Zuckungen und Tetanis, z. B. Zeit bis zum Höhepunkt und Halbentspannung. Viele experimentelle Variablen können die Kraft normalisieren, z. B. Körpergewicht, Muskelvolumen, das durch MRT (Magnetresonanztomographie) oder CT (Computertomographie) bestimmt wird, oder terminales Muskelgewicht. Es werden sowohl das absolute Drehmoment (N·m) als auch das auf die Körpermasse (N·m/kg) normierte Drehmoment dargestellt. Das Ruhemoment, das auf die Fußplatte gelegt wird, unterscheidet sich je nach Experiment. Eine Baseline-Korrektur für das Ruhedrehmoment sollte angewendet werden, um sicherzustellen, dass echte maximale Zuckungs- und Tetanmomente aufgezeichnet werden. Das Basisdrehmoment in jedem Gelenkwinkel wird aufgezeichnet und kann Änderungen des passiven Drehmoments anzeigen.

Ergebnisse

Zuverlässigkeit und Optimierung der In-vivo-Testparameter des vorderen Kompartiments des Schweins wurden zuvor berichtet²⁶. Vergleichsdaten über Nagetiere und Schweine für Drehmomentfrequenz wurden ebenfalls gemeldet²⁷.

Während der In-vivo-Bewertung ist eine Visualisierung der Drehmomentwellenform in Echtzeit erforderlich, um eine angemessene Aktivierung des vorderen Kompartiments zu gewährleisten. Die Wellenformen sollten nur die Dorsalflexion widerspiegeln. Die Wellenformen sollten ein glattes, abgerundetes Aussehen und ein scheinbares tetanisches Plateau aufweisen (Abbildung 2A). Inkonsistenzen oder Störungen der Wellenform weisen auf verschiedene experimentelle Einschränkungen hin, wie z. B. unzureichende Stimulation, falsche Elektrodenplatzierung oder unzureichende Anästhesietiefe (Abbildung 2B).

Abbildung 3A ist eine Zuckungs-Drehmoment-Zeit-Nachverfolgung mit einem Pfeil, der ein maximales Drehmoment von 50 % anzeigt. Die Time-to-Peak-Kontraktion sollte bei der Einleitung des Stimulators beginnen und enden, wenn das maximale Zuckungsmoment erreicht ist (repräsentative Zeitbalken sind unter dem Tracing dargestellt). Die halbe Entspannung für ein Zucken sollte mit dem maximalen Zuckungsmoment beginnen und bei 50% maximalem Zuckungsmoment enden (repräsentative Zeitbalken sind unter dem Tracing dargestellt). Abbildung 3B zeigt eine tetanische Drehmoment-Zeit-Ablaufverfolgung mit einem Pfeil, der das maximale Drehmoment von 50 % anzeigt. Im Gegensatz zu Zuckungen, die in Bezug auf ein definitives und rechtzeitiges maximales Drehmoment ideal sind, haben tetanische Kontraktionen eine größere Variabilität beim Timing des maximalen Drehmoments in Bezug auf den Beginn und das Ende des Stimulators, was einen differenzierteren Ansatz für die Analyse kontraktiler Eigenschaften erfordert. Die Time-to-Peak-Kontraktion sollte mit der Initiierung des Stimulators beginnen und irgendwo zwischen 90% -100% des maximalen Drehmoments aufhören. Die Zeitbalken in Abbildung 3B zeigen einen Grenzwert von 95 % maximalem Drehmoment. Dies ist in Fällen wie den ausgewählten repräsentativen Daten hilfreich, da das maximale Drehmoment erst spät in der Plateauphase erreicht wird. Eine ergänzende Analyse zur Zeit bis zum Höhepunkt ist die durchschnittliche Kontraktionsrate. Die gestrichelten Balken am aufsteigenden Ast der Drehmoment-Zeit-Nachführung repräsentieren einen Bereich von 30% -70% maximalem Drehmoment. Die durchschnittliche Kontraktionsrate sollte zu Beginn der Stimulation begonnen werden und die durchschnittliche Geschwindigkeitsänderung zwischen 30% -70% maximalem Drehmoment erfassen. Dies sind empfohlene Bereiche, und einzelne Forschungsgruppen können den idealen Bereich um 50% (z. B. ±10%) bestimmen. Der wichtige Teil besteht darin, innerhalb und über Studien hinweg konsistent zu sein. Im Gegensatz zum Zucken sollte die tetanische Kontraktionshalbrelaxation am Ende der Stimulation anstelle des maximalen Drehmoments beginnen, aus dem gleichen Grund, der oben mit der Zeit bis zum Höhepunkt erwähnt wurde. Die Zeitbalken in Abbildung 3B stellen die Zeit zwischen dem Ende der Stimulation und dem Erreichen einer Entspannung von 50 % dar. Eine komplementäre Analyse zur Halbrelaxation ist die durchschnittliche Entspannungsrate. Die gestrichelten Stäbe an der absteigenden Extremität der Drehmomentverfolgung repräsentieren den gleichen maximalen Drehmomentbereich von 30 % bis 70 % wie der aufsteigende Glied. Die durchschnittliche Entspannungsrate sollte am Ende der Stimulation beginnen und die durchschnittliche Änderungsrate zwischen 30% -70% maximalem Drehmoment erfassen. Auch dies sind empfohlene Bereiche. Ein kritischer Hinweis: Verwechseln Sie die durchschnittliche Kontraktions- / Entspannungsrate nicht mit der maximalen Kontraktions- / Entspannungsrate. Die maximale Rate stellt die bemerkenswerteste Ratenänderung zwischen zwei benachbarten Datenpunkten dar und kann sehr variabel sein.

Mehrere Zuckungs- und kontraktile Eigenschaften können analysiert werden, um Einblicke in den Fasertyp und die Erregungs-Kontraktions-Kopplungsattribute der Skelettmuskulatur^{zu erhalten 10,32}. Auf eine Überinterpretation der zuckenden und kontraktilen Eigenschaften wird hingewiesen; Sie stellen Vorschläge und Gründe für weitere Verhöre auf zellulärer Ebene dar und sind nicht unbedingt indikativ. Im Allgemeinen können die Kontraktilitätsraten die sarkoplasmatische Retikulumcalciumfreisetzung und die myosinschwere Kettenisoform-Enzymrate widerspiegeln. Im Gegensatz dazu können die Entspannungsraten die sarco(endo)plasmatische Retikulumcalcium-ATPase-Enzymrate und Isoform widerspiegeln. Diese Eigenschaften können durch Müdigkeit, Muskelschäden, Bewegungstraining und zahlreiche Pathologien (z. B. Nichtgebrauchsatrophie) beeinflusst werden.

Abbildung 4 zeigt repräsentative Werte für Drehmoment-Frequenz- und Drehmoment-Gelenkwinkel-Beziehungen für unverletzte Gliedmaßen. Diese Daten sind repräsentativ für eine breite Palette von Schweinegrößen.

Eine repräsentative, experimentelle Analyse des Oberflächen-EMG wurde während der In-vivo-Muskelanalyse durchgeführt (Abbildung 5), um die experimentelle Kontrolle der Ratencodierung und der gesamten Muskelaktivität zu demonstrieren. Klebende EMG-Elektroden wurden am Mittelbauch des Peroneus tertius platziert. Eine Bodenelektrode wurde auf das Knie gelegt, um das Stimulationsartefakt zu minimieren, und Stimulationselektrodennadeln wurden um den Peronealnerv proximal zur Muskelposition gelegt. Simultane Drehmoment- und EMG-Aufnahmen wurden bei Stimulationsfrequenzen von 20, 60 und 100 Hz gemacht. Die Anzahl der Stimulatorimpulse (rote Balken in Abbildung 5) spiegelt den Quotienten aus Stimulationsdauer und Zeit zwischen den Impulsen wider. Zum Beispiel bedeutet eine 20-Hz-Stimulationsfrequenz einen Impuls alle 50 ms; Daher entspricht eine Stimulationsdauer von 400 ms geteilt durch 50 ms zwischen den Impulsen acht gelieferten Impulsen (Abbildung 5A). Die Stimulatorimpulse werden über perkutane Nadelelektrodenplatzierung an das Nervenaxon abgegeben und erzeugen eine ähnliche Anzahl elektrischer Muskelimpulse (d.h. 20 Hz entsprechen 8 EMG-Aufnahmen), was die experimentelle Kontrolle der Aktionspotentialfrequenz der interessierenden Muskelgruppe demonstriert. Die rohen EMG-Aufzeichnungen können per Wurzel-Mittelwert-Quadrat-Analyse (EMG RMS) konvertiert werden, um die gesamte Muskelaktivität mit zunehmender Stimulationsfrequenz zu visualisieren. Die Fläche unter der Kurvenanalyse (AUC) ist eine Möglichkeit, das EMG RMS zu quantifizieren, um Veränderungen der gesamten Muskelaktivität zu bestimmen. Repräsentative AUCs für jede EMG RMS-Stimulationsfrequenz werden bereitgestellt (Abbildung 5A-C).

Abbildung 2: Repräsentative Wellenformen von hoher und niedriger Qualität. (A) Isometrische Wellenformen, die in einer Rechteckwellenerscheinung mit einem bemerkenswerten Flüssigkeitsplateau vorliegen. (B) Wellenformen von geringer Qualität können auf unzureichende Stimulation oder unsachgemäße Elektrodenplatzierung zurückzuführen sein. In diesen Fällen ist eine Neupositionierung der Elektroden erforderlich. Sowohl für A als auch für B sind die Stimulatorimpulse (rote Balken) angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Analyse von Twitch- und Tetanic-Contractile-Eigenschaften (A) Repräsentative Twitch- (1 Hz) und (B) tetanische (100 Hz) Drehmoment-Zeit-Ablaufverfolgungen werden modifiziert, um die kontraktilen Eigenschaften detailliert darzustellen. Der rote Pfeil in jeder Grafik zeigt 50% maximales Drehmoment. Blaue und schwarze Balken unter den Tracings zeigen die Zeitdauer von der Zeit bis zum Höhepunkt bzw. der halben Entspannung an. Gestrichelte Balken an den aufsteigenden und absteigenden Gliedmaßen der tetanischen Drehmoment-Zeit-Ablaufverfolgung stellen einen Bereich von 30% -70% maximalem Drehmoment dar, der zur Bestimmung der durchschnittlichen Kontraktions- oder Entspannungsrate verwendet werden kann. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Beispieldaten des Drehmoment-Gelenkwinkels und der Drehmoment-Frequenz. Die bereitgestellten Daten stammen aus einer Reihe von weiblichen Yorkshire Cross-Schweinen im Alter von 2,9 bis 6,3 Monaten; 39,4-75,4 kg Körpermasse; Alle betrachteten zum Zeitpunkt der Auswertung eine gesunde Kontrolle. Während aller Tests wurde die Körperkerntemperatur bei 37 °C gehalten. (A) Das auf die Körpermasse normierte Drehmoment wird bei Sprunggelenken von 0-50 ° Plantarflexion bewertet; Beachten Sie, dass das maximale Drehmoment bei 30 ° bestimmt wird. (B) Das auf Körpermasse normierte Drehmoment wird bei verschiedenen Stimulationsfrequenzen von 10-100 Hz bewertet; Beachten Sie, dass diese Bewertungen mit dem Sprunggelenk bei 30 ° Plantarflexion durchgeführt wurden. (C) Für jede der Stimulationsfrequenzen wurden individuelle Drehmomentspuren ausgewertet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Gleichzeitige isometrische In-vivo-Drehmoment - und EMG-Messungen. Simultane EMG- und Drehmomentaufzeichnungen bei repräsentativen Stimulationsfrequenzen von (A) 20, (B) 60 und (C) 100 Hz, die von einem weiblichen Yorkshire-Schwein (~ 90 kg Körpermasse) gesammelt wurden. Stimulatorimpulse (rote Balken) wurden entsprechend der eingestellten Stimulationsfrequenz abgegeben. Rohe EMG-Aufzeichnungen wurden in Root-Mean-Square (EMG RMS) konvertiert, um die gesamte Muskelaktivität mit zunehmender Stimulationsfrequenz zu visualisieren. Repräsentative EMG-RMS-Kurven wurden für den Bereich unter der Kurve (AUC) analysiert, und AUCs werden für jede Stimulationsfrequenz bereitgestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Diskussion

Kritische Schritte, Änderungen und Fehlerbehebung
Um die Datenvariabilität zu minimieren und den Erfolg des Ansatzes zu maximieren, werden die folgenden kritischen Schritte hervorgehoben.

Optimale Nervenstimulation
Dieser experimentelle Ansatz beginnt mit der Depolarisation des Nervenaxons und beruht auf der korrekten Platzierung der Elektroden und einer optimierten elektrischen Stimulation. Eine Post-mortem-Analyse der Nervenanatomie im Zusammenhang mit Boney-Landmarken kann helfen, die richtige Elektrodenplatzierung während des Tests zu visualisieren. Die Erfassung des maximalen Zuckungsmoments hilft bei der Bestimmung des geeigneten Stroms (in Milliampere; mA), der an das Nervenaxon abgegeben wird. Es gibt zwei Werte, die bei der Optimierung der Nervenstimulation zu Beginn der Prüfung zu beachten sind: (1) das Verhältnis von Zucken zu Tetanen beträgt ~1:5, z. B. entspricht das Zuckungsmoment ~2 N·m einem Tetanmoment von 10 N·m (Abbildung 3); und (2) das typische Drehmoment zur Körpermasse beträgt ~0,3 N·m pro kg Körpermasse (Abbildung 4). Wenn die Spitzenzuckungsmomente niedrig erscheinen, entfernen Sie die Elektroden und versuchen Sie eine andere Platzierung. Überprüfen Sie unbedingt die Stimulatoreinstellungen, BNC-Anschlüsse und Elektrodenanschlüsse. Eine Elektrodenverlegung kann zwischen den Kontraktionen erforderlich sein, wenn sich während der Positionierung der Extremität zwischen den Gelenkwinkeln zu viel Bewegung bewegt, wie oben erwähnt (Abbildung 2). Bitte beachten Sie, dass experimentelle und interventionelle Ansätze diese Werte beeinflussen können.

Richtige biomechanische Ausrichtung
Die beginnende Muskellänge beeinflusst die Muskelkontraktionskraft (die Länge-Spannungs-Beziehung), und die Muskellänge kann sich basierend auf der Ausrichtung von Hüfte, Knie und Sprunggelenk ändern. Die Gelenkwinkel müssen zwischen den Gliedmaßen und zwischen Schweinen standardisiert werden. Ein 90° Sprunggelenkswinkel wird für Hüfte und Knie dringend empfohlen. Eine leicht plantarflexierte Knöchelposition (~30° aus dem neutralen 0° Sprunggelenkwinkel) ist optimal für Spitzenfestigkeit. Es spiegelt die natürliche anatomische Position des Sprunggelenks sowohl bei Schweinen als auch bei Hunden im Stehen wider. Alle Gelenke sollten auch parallel zu den Fußpedal- und Drehmomentaufnehmern verlaufen, um einen Verlust des messbaren Drehmoments durch den Beitrag eines senkrechten Drehmomentvektors zu vermeiden. Es wird dringend empfohlen, die Hüft-Knie-Sprunggelenkswinkel und die Fuß-Pedal-Gelenk-Ausrichtung zu überprüfen, nachdem der Fuß am Fußpedal befestigt und das Kniegelenk mit den Gliedmaßenklemmstangen gesichert wurde (Abbildung 1). Wenn es eine Fehlausrichtung gibt, entriegeln und entfernen Sie die Stangen und positionieren Sie das Schwein auf dem OP-Tisch neu. Während die Standardisierung der Gelenkwinkel über Studien hinweg für die Minimierung der Datenvarianz von entscheidender Bedeutung ist, gibt es Einschränkungen der biomechanischen Ausrichtung, die im Folgenden erörtert werden.

Bedeutung in Bezug auf bestehende oder alternative Methoden
Alternative Beispiele für klinisch relevante und nicht-invasive Bewertungen der Muskelfunktion, die für Schweinemodelle verwendet werden könnten, sind Laufband-Gehweg, EMG und aktive Muskelscherwellen-Elektrographie. Wie der 6-minütige Gehtest beim Menschen kann ein Laufband-Gehtest das Fortschreiten der Krankheit und den Interventionserfolg bei großen Tieren^{bewerten 33,34,35}. Typischerweise werden Tiere nach einer Akklimatisierungsphase bis zum Ende der Compliance bei verschiedenen Laufbandgeschwindigkeiten und / oder Steigungsniveaus geführt. Essensbelohnungen sind oft notwendig, um maximale Motivation zu erreichen. Die Laufband-Gehergebnisse bieten jedoch nur indirekte Interpretationen der Muskelkontraktilfunktion aufgrund von Einschränkungen wie der Motivation der Probanden, der Rekrutierung nicht maximaler motorischer Einheiten und der inhärenten Co-Abhängigkeit von anderen Körpersystemen wie dem Herz-Kreislauf-, Skelett- und Atmungssystem.

Auf der anderen Seite bietet EMG eine etwas bessere direkte Beurteilung des Skelettmuskelsystems, da EMG-Elektroden direkt auf der interessierenden Muskelgruppe^36,37,38 platziert werden. EMG-Elektroden messen dann die kollektive Muskelaktivität (depolarisierte Muskelfasern). Diese Muskelaktivität basiert auf der Rekrutierung motorischer Einheiten und der Ratencodierung (der Häufigkeit von Aktionspotentialen, die an rekrutierte motorische Einheiten gesendet werden). Es ist jedoch unmöglich, die relativen Beiträge der Rekrutierung motorischer Einheiten von der Ratencodierung mit dem Oberflächen-EMG zu trennen. Darüber hinaus stützt sich EMG auf die Bereitschaft des Subjekts, maximale Kontraktionen zu erzeugen, und dieses Maß an Kooperation ist in Großtiermodellen unwahrscheinlich. Während es informativ sein kann, Veränderungen des EMG während des Gangzyklus zu beurteilen, stellen diese Daten keine maximale Funktionsfähigkeit der interessierenden Skelettmuskelgruppe dar. Ultraschallbasierte Bildgebung mit B-Modus und Scherwellenelastographie ist eine weitere nicht-invasive Modalität, die zur Beurteilung der Muskelfunktion verwendet wird. Es besteht eine gute Korrelation zwischen dem elastographisch gemessenen Elastizitätsmodul von Young und den zunehmenden Muskelbelastungen^39,40. Die Shearwellen-Elastographie wurde validiert und als quantitatives Maß für die passive Gewebesteifigkeit 41,42,43,44,45 verwendet^, einschließlich in einem porcinen volumetrischen Muskelverlustverletzungsmodell ²³. Es kann auch als indirekte Messung der aktiven Muskelkraftproduktion^{verwendet werden 39}. Es gibt jedoch nach wie vor EMG-ähnliche Einschränkungen für die Bereitschaft des Subjekts und die Zusammenarbeit zur Durchführung von Kontraktionen.

Das hier beschriebene In-vivo-Protokoll bietet im Gegensatz zu Laufband-Gehdistanz und EMG eine zuverlässige, reproduzierbare und maximale Beurteilung der Muskelfunktion. Dieses Protokoll ruft Muskelkontraktionen in einer kontrollierten, quantifizierbaren Weise hervor, die unabhängig von der Motivation ist. Insbesondere werden perkutane Elektroden verwendet, um Nervenaxone zu stimulieren, die das zentrale Nervensystem umgehen. Die Depolarisation der Nervenaxone greift alle motorischen Einheiten ein und eliminiert die Variabilität, die mit der Rekrutierung von Motoreinheiten verbunden ist. Zusätzlich kontrolliert der Prüfarzt die Ratencodierung (Stimulationsfrequenz). Die resultierende neuromuskuläre Physiologie, die auf diesen Ansatz angewendet wird, beginnt mit einer spannungsgesteuerten Natriumkanalaktivierung an den Knoten von Ranvier. Die gesamte nachfolgende (oder nachgeschaltete) Physiologie wird einbezogen, einschließlich der Anregungs-Kontraktions-Kopplung und des Cross-Bridge-Cyclings. Ein wesentlicher Vorteil der nicht-invasiven In-vivo-Muskelanalyse besteht darin, dass die kontraktile Muskelfunktion wiederholt gemessen werden kann, beispielsweise wöchentlich, um die Muskelkraft nach einer Verletzung, einem Eingriff oder einem Krankheitsverlauf zu überwachen.

Einschränkungen der Methode
Die in diesem Protokoll beschriebene In-vivo-Ausrüstung ermöglicht ein passives und aktives isometrisches Drehmoment in Abhängigkeit von Gelenkwinkel und Stimulationsfrequenz. Die verwendete Prüfvorrichtung unterstützt nicht die Messung dynamischer Kontraktionen (z. B. isokinetische exzentrische oder konzentrische Kontraktionen). Die Vorrichtung ermöglicht einen Bewegungsbereich von 105° zur Charakterisierung der Drehmoment-Gelenkwinkel-Beziehung und verwendet eine Wägezelle mit einem maximalen Drehmomentbereich von ~50 N·m. Spezifische experimentelle Fragen können Leistungsmerkmale außerhalb dieser Spezifikationen erfordern. Insbesondere kann die Wägezelle dieser beschriebenen Vorrichtung bei Bedarf gegen größere Drehmomentbereiche ausgetauscht werden.

Das hierin beschriebene Protokoll zur Messung der maximalen neuromuskulären Stärke in vivo weist bemerkenswerte Einschränkungen auf. Erstens erfordert diese Methode eine Anästhesie, die je nach Tiereinrichtungsprotokollen und -ressourcen unterschiedlich durchgeführt werden kann. Es ist bekannt, dass Anästhetika unterschiedliche Auswirkungen auf die neuromuskuläre Funktion haben und es wurde gezeigt, dass sie die dorsiflexorische Drehmomentproduktion der Maus in vivo in anästhetischer und dosisabhängiger Weise verändern²⁹. Die unterschiedlichen Wirkungen von Anästhetika auf das In-vivo-Drehmoment von Großtieren sind unklar; Daher müssen Kontroll- und Versuchsgruppen über die gleichen Anästhesiemittel verfügen (z. B. alle Gruppen, denen Ketamin verabreicht wird), um diese Variabilität zu kontrollieren. Zweitens schränkt die Abhängigkeit von In-vivo-Diffusionsmustern die Erforschung zellulärer Mechanismen der kontraktilen Dysfunktion und der akuten Arzneimitteltoxizität ein. Zum Beispiel kann Koffein während des In-vitro-Organbadtests eines isolierten Muskels verwendet werden, um die sarkoplasmatische Retikulum-Kalziumfreisetzung zu stimulieren, wobei die Erregungs-Kontraktions-Kopplung⁴⁶ direkt umgangen wird. Die Menge an Koffein, die diesen Effekt induziert (mM), ist in einer In-vivo-Umgebung tödlich. Arzneimitteleinflüsse auf den gesamten Körper (z. B. Nieren- / Leberstress) und nachfolgende Faktoren, die in den Kreislauf ausgeschieden werden, müssen berücksichtigt werden, wenn dieser Ansatz für das Drogenscreening auf akute Muskelkraft^{verwendet wird 23}. Drittens weicht die Verwendung der maximalen elektrischen Nervenstimulation von freiwilligen Rekrutierungsstrategien ab, wie oben diskutiert, und spiegelt daher keine Kraftveränderungen wider, die auf neuromuskuläre Rekrutierungsanpassungen zurückzuführen sein können.

In-vivo-Drehmomentmessungen können auch im Hinblick auf die Festlegung eines spezifischen Mechanismus für experimentelle Beobachtungen eingeschränkt werden. Zum Beispiel hängt das Drehmoment um das Sprunggelenk nicht nur von der Muskelkraftproduktion ab, sondern auch von der Sehnen- und Gelenk- und Bindegewebseigenschaft. Darüber hinaus wird Kraft von Muskelgruppen erzeugt, insbesondere von den Plantarbeugern (Musculus gastrocnemius, Soleus und Plantais) und den Dorsiflexoren (Peroneus tertius, Tibialis und Digitorummuskeln) bei Schweinen. Daher erfordern Interpretationen von maximalen In-vivo-Drehmomentdaten die Berücksichtigung potenzieller muskulotendinöser und anatomischer Veränderungen und beschränken sich auf Muskelgruppen, nicht auf einzelne Muskeln. In diesem Zusammenhang bestehen Muskelgruppen oft aus einer Mischung von überwiegend schnellen und langsamen Muskelfasern, wie dem Gastrocnemius- bzw. Soleus-Muskel der Plantarbeuger. Kontraktile Eigenschaften wie Kontraktions- und Entspannungsrate (oder Time-to-Peak-Kontraktion und Halbrelaxationszeit) sind keine zuverlässigen Indikatoren für die Faserphysiologie, die in vivo im Vergleich zu isolierten Muskelpräparaten wie In-vitro- oder In-situ-Testprotokollen ^{verwendet wird 47}. Isolierte Muskelpräparate sind auch beim Verständnis des Einflusses biomechanischer Parameter auf die Muskelfunktion überlegen, da Eigenschaften wie die Muskellänge präzise gesteuert werden können. Es ist wichtig zu betonen, dass die Gelenkwinkel-Drehmoment-Beziehung nicht direkt äquivalent zur Muskellänge-Kraft-Beziehung ist, da die Eigenschaften von Sehnen (z. B. Slack), Muskeln (z. B. Pennationswinkel, Sarkomerüberlappung) und Gelenken (z. B. Momentarm), die zur Drehmomentproduktion beitragen, vom Gelenkwinkel abhängen. Zu diesem Zweck könnten In-situ-Funktionstests⁴⁸ für Großtiere eine wertvolle Ergänzung zu In-vivo-Tests sein, wenn man bedenkt, dass In-situ-Tests ein terminales Experiment sind. Andere Weiterentwicklungen des aktuellen Protokolls, die in Zukunft untersucht werden könnten, um die mechanistischen Erkenntnisse experimenteller Ergebnisse zu verbessern, umfassen die Verwendung von Ultraschall-B-Mode-Bildgebung zur Messung der architektonischen Eigenschaften von Muskeln und Sehnen und die Implantation eines Sehnenkraftwandlers zur Messung der Muskelkraft während freiwilliger und elektrisch stimulierter Kontraktionen⁴⁹.

Bedeutung und Anwendungsmöglichkeiten der Methode
Dieses Protokoll bewertet die in vivo Drehmomentproduktionskapazität der porcinen Dorsalflexor-Muskelgruppe und demonstriert eine nicht-invasive Methode zur Beurteilung der Zunahme oder des Verlusts der Muskelfunktion in einer physiologischen Umgebung. Da die Methodik für das Schwein nicht terminal ist, kann sie auch verwendet werden, um die Muskelfunktion bei denselben Probanden längsschnittlich während des Fortschreitens einer Krankheit oder vor, während und nach einer Behandlungsstrategie zu bewerten. Daher kann ein Versuchsdesign mit wiederholten Messungen robuste statistische Vergleiche mit größerer Aussagekraft und weniger Tieren im Vergleich zu unabhängigen Messungen ermöglichen. Darüber hinaus ist die Skelettmuskeldysfunktion ein herausragender Bestandteil verschiedener Krankheitsprozesse und -zustände, wie chronischer krankheitsbedingter Muskelschwund (z. B. Herzinsuffizienz, Nierenversagen, AIDS, Krebs usw.), Muskeldystrophie, neurodegenerative Erkrankungen (z. B. SMA oder amyotrophe Lateralsklerose; ALS), Altern (d. H. Sarkopenie) und Arzneimitteltoxizitäten. Die funktionelle Kapazität der Skelettmuskulatur ist ein kritisches primäres Endergebnis für Interventionen wie Bewegung, Ernährung sowie medikamentöse und regenerative Medizintherapien. Daher kann das hierin beschriebene Protokoll zur zuverlässigen Bewertung der Schweinmomenterzeugungskapazität in vivo in zahlreichen Studienanwendungen verwendet werden. Es kann bei der Gewinnung umfangreicher Tierdaten für die Translation von Entwicklungstherapien hilfreich sein.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
615A Dynamic Muscle Control LabBook and Analysis Software Suite	Aurora Scientific Inc.	615A	Compatible Win Vista/7/10
892A Swine Isometric Footplate Test Apparatus	Aurora Scientific Inc.	892A	Includes Isometric Load Cell, Pig Footplate, Goniometer stage and positioners
Calibration Weights	Ohaus or similar	80850116
Computer	Aurora Scientific or any vendor	601A	Computer must include data acquisition card and interface for software
Gauze pad	Various vendors		4 by 4 squares or similar
Monopolar Needle Electrodes	Chalgren, Electrode Store,  or similar vendor	242-550-24TP, or DTM-2.00SAF
Non-adhesive Flexiable Tape	3M, Coflex, or similar		4 inch by 5 yard role
Stimulator	Aurora Scientific or comparable	701C	Must include constant current stimulation mode