Entwicklung eines Zell-Co-Kultur-Modells zur Nachahmung von kardialer Ischämie/Reperfusion in vitro

Zusammenfassung

Die räumliche Entfernung ist ein Schlüsselparameter bei der Beurteilung von Hypoxie- / Reoxygenierungsverletzungen in einem Kokulturmodell separater Endothel- und Kardiomyozytenzellschichten, was zum ersten Mal darauf hindeutet, dass die Optimierung der räumlichen Umgebung der Kokultur notwendig ist, um ein günstiges In-vitro-Modell für die Prüfung der Rolle von Endothelzellen beim Schutz von Kardiomyozyten bereitzustellen.

Zusammenfassung

Die ischämische Herzkrankheit ist weltweit die häufigste Ursache für Tod und Behinderung. Reperfusion verursacht zusätzliche Verletzungen über die Ischämie hinaus. Endothelzellen (ECs) können Kardiomyozyten (CMs) durch Zell-Zell-Interaktionen vor Reperfusionsverletzungen schützen. Kokulturen können helfen, die Rolle von Zell-Zell-Interaktionen zu untersuchen. Eine gemischte Kokultur ist der einfachste Ansatz, aber begrenzt, da isolierte Behandlungen und nachgelagerte Analysen einzelner Zelltypen nicht möglich sind. Um zu untersuchen, ob ECs dosisabhängig CM-Zellschäden abschwächen können und ob dieser Schutz durch Variation des Kontaktabstands zwischen den beiden Zelllinien weiter optimiert werden kann, haben wir Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells und Adult Mouse Cardiomyocytes verwendet, um drei Arten von Zellkultureinsätzen zu testen, die in ihrem Abstand zwischen den Zellschichten bei 0,5 variierten. 1,0 bzw. 2,0 mm. Nur bei CMs nahm die Zellschädigung, wie sie durch die Freisetzung von Laktatdehydrogenase (LDH) beurteilt wurde, während der Hypoxie und weiter bei der Reoxygenierung signifikant zu, wenn der Abstand 2,0 mm im Vergleich zu 0,5 und 1,0 mm betrug. Wenn ECs und CMs in nahezu direktem Kontakt standen (0,5 mm), gab es nur eine leichte Abschwächung der Reoxygenierungsverletzung von CMs nach Hypoxie. Diese Dämpfung war signifikant erhöht, wenn der räumliche Abstand 1,0 mm betrug. Mit einem Abstand von 2,0 mm schwächten ECs die CM-Verletzung sowohl während der Hypoxie als auch der Hypoxie/Reoxygenierung ab, was darauf hindeutet, dass eine ausreichende Kulturdistanzierung notwendig ist, damit ECs mit CMs übersprechen können, so dass sezernierte Signalmoleküle zirkulieren und Schutzwege vollständig stimulieren können. Unsere Ergebnisse deuten zum ersten Mal darauf hin, dass die Optimierung der räumlichen Umgebung der EC/CM-Kokultur notwendig ist, um ein günstiges In-vitro-Modell für die Prüfung der Rolle von ECs beim CM-Schutz gegen simulierte Ischämie/Reperfusionsverletzung bereitzustellen. Ziel dieses Berichts ist es, den Ermittlern einen schrittweisen Ansatz zu bieten, um dieses wichtige Modell zu ihrem Vorteil zu nutzen.

Einleitung

Die ischämische Herzkrankheit ist weltweit die häufigste Ursache für Tod und Behinderung ^1,2. Der Behandlungsprozess der Reperfusion kann jedoch selbst zum Tod des Kardiomyozyten führen, der als Myokardischämie / Reperfusionsverletzung (IR) bekannt ist und für die es immer noch kein wirksames Mittel gibt³. Es wurde vorgeschlagen, dass Endothelzellen (ECs) Kardiomyozyten (CMs) durch die Sekretion parakriner Signale sowie Zell-zu-Zell-Interaktionen^{schützen 4}.

Zell-Co-Kultur-Modelle wurden ausgiebig verwendet, um die Rolle autokriner und / oder parakriner Zell-Zell-Interaktionen auf die Zellfunktion und -differenzierung zu untersuchen. Unter den Kokulturmodellen ist die gemischte Kokultur die einfachste, bei der zwei verschiedene Zelltypen in direktem Kontakt innerhalb eines einzigen Kulturkompartiments mit einem gewünschten Zellverhältnis^{stehen 5}. Getrennte Behandlungen zwischen Zelltypen und nachgelagerte Analysen eines einzelnen Zelltyps sind jedoch angesichts der gemischten Population nicht ohne weiteres durchführbar.

Frühere Studien zeigten, dass hypoxische und ischämische Beleidigungen die Integrität der Zellmembran signifikant schädigen, gemessen an der Freisetzung von Laktatdehydrogenase (LDH). Diese Verletzung wird bei der Reoxygenierung verschlimmert und ahmt die Reperfusionsverletzung ^6,7,8 nach. Ziel des aktuellen Protokolls war es, die Hypothesen zu testen, dass das Vorhandensein von ECs dosisabhängig das durch Hypoxie und Reoxygenierung (HR) verursachte Zellmembranleckage von CMs abschwächen kann und dass die Schutzwirkung von ECs durch Variation des Kontaktabstands zwischen den beiden Zelllinien optimiert werden kann. Daher verwendeten wir drei Arten von Zellkultureinsätzen und Maus-Primär-Koronararterien-Endothelzellen und adulte Maus-Kardiomyozyten. Die von Corning, Merck Millipore und Greiner Bio-One gebrandeten Einsätze ermöglichten es uns, drei verschiedene Zellkultur-Übersprechbedingungen mit Abständen zwischen den Zelllinien von 0,5, 1,0 bzw. 2,0 mm zu erzeugen. Pro Einsatz wurden jeweils 100.000 ECs plattiert.

Um festzustellen, ob die Dichte von ECs in der Kokultur in diesem Modell zur Dämpfung von HR-Verletzungen beiträgt, untersuchten wir außerdem die Dosis-Wirkungs-Beziehung zwischen der EC-Konzentration und der LDH-Freisetzung durch CMs. ECs wurden mit 25.000, 50.000 bzw. 100.000 pro Einsatz im 2,0-mm-Einsatz plattiert.

Dieser Bericht bietet einen schrittweisen Ansatz für Ermittler, um dieses wichtige Modell zu ihrem Vorteil zu nutzen.

Protokoll

1. Versuchsvorbereitung/-beschichtung

1. Pflegen Sie CMs und ECs gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   1. Tauen Sie beide Zelllinien auf, wenn sie von Lieferanten ankommen. Platte in T25-Kolben nach dem Waschen mit frischen Medien. Es wird empfohlen, jedes Zellkulturmedium von den gleichen Anbietern zu kaufen, von denen die Zellen gekauft wurden. Erfrischen Sie am nächsten Tag die Zellen mit Medien und verwenden Sie sie, wenn sie zusammenfließen.
   2. Halten Sie den Zellkultur-Inkubator bei 37 °C mit 21% O2, 5% CO₂, 74%_N2 und halten Sie ihn befeuchtet.
      HINWEIS: Die in diesem Protokoll verwendeten primären Koronararterien-Endothelzellen der Maus werden aus Koronararterien von C57BL/6-Mäusen isoliert, und adulte Maus-Kardiomyozyten werden aus adulten C57BL/6J-Mausherzen isoliert und kommerziell gewonnen (siehe Materialtabelle).
2. Platte CMs unter sterilen Bedingungen auf den Boden von 24-Well-Platten (untere Schicht). 24 h später Platte ECs in den Einsatz (oder übergeordneten Teil) des Co-Kultur-Brunnens. 24 h nach der EC-Beschichtung EC-Einsätze auf CM-Plattenböden legen, beginnend mit der Kokulturperiode. Lassen Sie die Zellen vor Gebrauch mindestens 12-24 Stunden lang kokulturieren. Diese Schritte werden im Folgenden ausführlich beschrieben.
   1. Schätzen Sie die Zusammenfluss von CM-Zelllinien unter einem Lichtmikroskop. Wenn Zellen in Kulturflaschen zu 90% -100% konfluent zu sein scheinen, fahren Sie mit der experimentellen Beschichtung fort.
   2. Entfernen Sie das Medium aus den Kolben, die konfluierende Zellkulturen enthalten, und trypsinisieren Sie mit 3-5 ml Trypsin/Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) für T25-Kolben. Den Kolben vorsichtig rühren, bei 37 °C für 2-5 min inkubieren und dann den enzymatischen Fortschritt unter einem Lichtmikroskop beurteilen. Sobald sich die Zellen aufrunden, verwenden Sie einen Zellenabstreifer, um die Zellen von der Oberfläche zu lösen.
   3. Nach dem Ablösen die Trypsinlösung inaktivieren, indem die Trypsin-/Zelllösung in ein 50-ml-Röhrchen mit 10 ml Medien für T25-Kolben gegeben wird. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 120 x g für 2 Minuten, um ein weiches Zellpellet zu erhalten. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 5 ml Medien.
   4. Um die Zellzählung durchzuführen und die Zelllebensfähigkeit zu bestätigen, mischen Sie ein Aliquot von 10 μL resuspendierter Zellen und 10 μL Trypanblaufarbstoff. Zählen Sie die lebenden Zellen mithilfe eines Zellzählers. Verdünnen Sie die Zellen mit frischen regulären Medien, um die gewünschten Aussaatdichten zu erreichen. Die Volumina werden in Abhängigkeit von der gewünschten Samendichte und Zellkonzentration von Stammlösungen berechnet. Alle Beschichtungen sollten unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden.
   5. Platten-CMs mit einer Aussaatdichte von 300.000 pro Bohrloch auf dem Boden einer 24-Well-Platte, die mit extrazellulärer Matrix vorbeschichtet ist. Die Zellen werden über Nacht bei 37 °C mit 21%_{O2 und} 5% CO₂ gehalten.
   6. Nach 24 h Platten-ECs in Einsätze mit einer optimalen Beschichtungsdichte von 100.000 pro Einsatz (Kulturfläche beträgt 33,6 mm²) (Abbildung 1). Nach 24 Stunden EC-Beschichtung EC-Einsätze in die CM-Vertiefungen legen, um die Kokultur einzuleiten. Lassen Sie die Zellen 12-24 Stunden lang kokultivieren, bevor Sie die Experimente durchführen.
   7. Stellen Sie sicher, dass zum Zeitpunkt der Durchführung der Experimente sowohl CMs als auch ECs einen Zusammenfluss von 80 % bis 90 % erreicht haben.

2. Hypoxie/Reoxygenierung zur Simulation von Ischämie/Reperfusionsverletzung in vitro

HINWEIS: Die folgenden Schritte müssen wie beschrieben ausgeführt werden, pausieren Sie nicht dazwischen.

1. Bereiten Sie das hypoxische Medium vor, indem Sie ~ 25 ml Medien in ein konisches 50-ml-Rohr gießen. Versiegeln Sie die Oberseite mit einer Silikonmembran und verwenden Sie eine sterilisierte Pipette, um ein Loch zu stanzen. Erzeugen Sie ein weiteres Loch, diesmal bleibt die Pipette ungefähr 2/3 in das Medium eingetaucht.
2. Spülen Sie das Medium mit hypoxischem Gas (0,0125% O2, 5% CO₂, 94,99%_N2) für 5 min bei einer Durchflussrate von 30 L/min. Dies minimiert_O2, das sich im Medium löst, wenn die Hypoxie beginnt (Schritt 2.5).
3. Entsorgen Sie die Medien der 24-Well-Platten oder Kultureinsätze, die angeschlossene Zellen enthalten, und waschen Sie sie mit 100 μL/Well von 10% phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) sehr vorsichtig. Danach fügen Sie 500 μL der frisch zubereiteten hypoxischen Medien zu jeder Vertiefung der Platten oder Einsätze hinzu.
   HINWEIS: Die Hypoxie in den Medien wird während dieses Schritts so kurz wie möglich unterbrochen, bevor in Schritt 2.5 eine echte Hypoxie für Zellen und Medien beginnt.
   1. Ersetzen Sie in der normoxischen Kontrollgruppe das Originalmedium durch frische, normale Medien, die Glukose und Serum enthalten.
4. Befeuchten Sie die Hypoxiekammer, indem Sie eine mit sterilem Wasser gefüllte Petrischale in die Kammer legen. Als nächstes legen Sie die Platten, die die hypoxischen Gruppen umfassen, in die Kammer.
5. Spülen Sie die Hypoxiekammer mit hypoxischem Gas (0,0125% O2, 5% CO₂, 94,99%_N2) für 5 min bei einem Durchfluss von 30 L/min. Stellen Sie die Kammer für 24 h in den 37 °C Inkubator.
6. Nach Hypoxie CMs und ECs unter normalen Bedingungen kultivieren. Entsorgen Sie dazu das alte Medium der Platten/Einsätze, ersetzen Sie es durch normale Medien (mit Glukose und Serum; 500 μL jeder Vertiefung/Einlage) und lagern Sie es im Inkubator unter normalen Kulturbedingungen (21% O2, 5% CO 2, 74%_N2, 37 °C) für₂ h, um die Reperfusion nachzuahmen.
7. Um die Auswirkungen des Medienersatzes zu kontrollieren, wechseln Sie die Medien der normoxischen Zellen gleichzeitig mit dem Wechsel der hypoxischen Medien.
   HINWEIS: Abbildung 2 bietet eine schematische Übersicht über dieses Protokoll.

3. Endpunktbewertung

1. Übertragen Sie die Zellkulturmedien von der 24-Well-Platte in eine 96-Well-Platte. Verwenden Sie 200 μL Medien aus jeder Vertiefung der 24-Well-Platte und verteilen Sie sie entsprechend gleichmäßig auf vier Vertiefungen der 96-Well-Platte. Verwenden Sie jeweils eine Platte für Normoxie versus Hypoxie versus HR.
2. Bestimmen Sie den Grad der Zellschädigung, z. B. durch Messung der Absorption für LDH mit einem Zytotoxizitäts-Assay-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Führen Sie den Assay in einer 96-Well-Platte gemäß den Anweisungen im Assay-Protokoll durch.

4. Statistiken

1. Zeigen Sie die parametrischen Daten als Mittelwert/Standardabweichung und nicht-parametrische Daten als Boxplots mit Median-/Interquartilsbereich an. Es sollten angemessene parametrische und nicht-parametrische Mehrfachvergleiche mit akzeptablen Post-hoc-Tests durchgeführt werden, um die Wahrscheinlichkeit eines Typ-1-Fehlers zu verringern. Die Signifikanz wird typischerweise auf ein Alpha von 0,05 (zweiseitig) festgelegt.
2. Führen Sie für alle Experimente, die in der aktuellen Studie durchgeführt wurden, mindestens drei Well-Replikationen innerhalb eines Experiments durch. Es gab drei bis sechs Wiederholungen jedes Experiments, die für die statistische Analyse verwendet wurden.

Ergebnisse

Alle drei Arten von Einsätzen (A, B, C), die in diesem Experiment verwendet wurden, haben die gleiche Porengröße von 0,4 μm. Der einzige Unterschied zwischen ihnen ist die Insert-to-Base-Höhe, die es ermöglicht, dass die Abstände zwischen den beiden kokultivierten Zellschichten 0,5, 1,0 bzw. 2,0 mm betragen (Abbildung 3) und dass sie von verschiedenen Anbietern stammen (Details siehe Materialtabelle).

Um ein In-vitro-Co-Kulturmodell mit sep...

Diskussion

Kritische Schritte im Protokoll
Zellkokulturmodelle wurden verwendet, um zelluläre Mechanismen der Kardioprotektion zu untersuchen. Wie man zwei getrennte Schichten mit einem sinnvollen Abstand zwischen ihnen schafft, ist daher entscheidend für die Entwicklung eines geeigneten Co-Kultur-Modells. Eine Herausforderung bei der Untersuchung simulierter IR-, d.h. HR-Verletzungen besteht darin, dass nicht nur Ischämie (Hypoxie) selbst, sondern auch Reperfusion (Reoxygenierung) die zelluläre Dysfunktion ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adult Mouse Cardiomyocytes (CMs)	Celprogen Inc	11041-14	Isolated from adult C57BL/6J mouse cardiac tissue
Automated Cell Counter Countess II	Invitrogen	A27977	Cell counting for calculating cell numbers
Bio-Safety Cabinet	Nuaire	NU425400	Cell culture sterile hood
Cell Culture Freezing Medium	Cell Biologics Inc	6916	Used for cell freezing for long term cell line storage
Cell Culture Incubator	Nuaire	Nu-5500	To provide normal cell living condition (21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37°C, humidified)
Cell Culture Incubator Gas Tank	A-L Compressed Gases	UN1013	Gas needed for cell culture incubator
Cell Culture Inserts A (0.5 mm)	Corning Inc	353095	Used for EC-CM co-culture
Cell Culture Inserts B (1.0 mm)	Millicell Millipore	PIHP01250	Used for EC-CM co-culture
Cell Culture Inserts C (2.0 mm)	Greiner Bio-One	662640	Used for EC-CM co-culture
Centrifuge	Anstel Enterprises Inc	4235	For cell culture plating and passaging
CMs Cell Culture Flasks T25	Celprogen Inc	E11041-14	Used for CMs regular culture, coated by manufacturer
CMs Cell Culture Medium Complete	Celprogen Inc	M11041-14S	CMs culture complete medium
CMs Cell Culture Medium Complete Phenol free	Celprogen Inc	M11041-14PN	CMs culture medium without phenol red used during LDH measurement
CMs Cell Culture Plates 96 well	Celprogen Inc	E11041-14-96well	Used for experiments of LDH measurement, coated by manufacturer
CMs Hypoxia Cell Culture Medium	Celprogen Inc	M11041-14GFPN	CMs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)
Countess cell counting chamber slides	Invitrogen	C10283	Counting slides used for cell counter
Cyquant LDH Cytotoxicity Kit	Thermo Scientific	C20301	LDH measurement kit
ECs Cell Culture Flasks T25	Fisher Scientific	FB012935	Used for ECs regular culture
ECs Cell Culture Medium Complete	Cell Biologics Inc	M1168	ECs culture complete medium
ECs Cell Culture Medium Complete Phenol free	Cell Biologics Inc	M1168PF	ECs culture medium without phenol red used during LDH measurement
ECs Cell Culture Plates 96 well	Fisher Scientific (Costar)	3370	Used for experiments of LDH measurement
ECs Culture Gelatin-Based Coating Solution	Cell Biologics Inc	6950	Used for coating flasks and plates for ECs
ECs Hypoxia Cell Culture Medium	Cell Biologics Inc	GPF1168	ECs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fisher Scientific	MT35011CV	FBS-HI USDA-approved for cell culture and maintenance
Hypoxia Chamber	StemCell Technologies	27310	To create a hypoxic condition with 0.01%O2 environment
Hypoxia Chamber Flow Meter	StemCell Technologies	27311	To connect with hypoxic gas tank for a consistent gas flow speed
Hypoxic Gas Tank (0.01%O2 Cylinder)	A-L Compressed Gases	UN1956	Used to flush hypoxic medium and chamber (0.01%O2/5%CO2/94.99N2)
Microscope	Nikon	TMS	To observe cell condition
Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells (ECs)	Cell Biologics Inc	C57-6093	Isolated from coronary artery of C57BL/6 mice
NUNC 15ML CONICL Tubes	Fisher Scientific	12565269	For cell culture process, experiments, solution preparation etc.
NUNC 50ML CONICL Tubes	Fisher Scientific	12565271	For cell culture process, experiments, solution preparation etc.
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8662	Used for cell washing during culture or experiments
Plate Reader	BioTek Instrument	11120533	Colorimetric or fluorometric plate reading
Reaction 96 Well Palte (clear no lid)	Fisher Scientific	12565226	Used for LDH measurement plate reading
Trypsin/EDTA for CMs	Celprogen Inc	T1509-014	1 x sterile filtered and tissue culture tested
Trypsin/EDTA for ECs	Cell Biologics Inc	6914/0619	0.25%, cell cuture-tested