Mikrotubuli Plus-End Dynamics Visualisierung im Huntington-Modell basierend auf humanen primären Hautfibroblasten

Zusammenfassung

Dieses Protokoll ist der Mikrotubuli-Plus-End-Visualisierung durch EB3-Proteintransfektion gewidmet, um ihre dynamischen Eigenschaften in der primären Zellkultur zu untersuchen. Das Protokoll wurde an menschlichen primären Hautfibroblasten implementiert, die von Huntington-Patienten gewonnen wurden.

Zusammenfassung

Die Transfektion mit einem fluoreszenzmarkierten Markerprotein von Interesse in Kombination mit der Zeitraffer-Videomikroskopie ist eine klassische Methode zur Untersuchung der dynamischen Eigenschaften des Zytoskeletts. Dieses Protokoll bietet eine Technik für die primäre Fibroblastentransfektion des Menschen, die aufgrund der Besonderheiten der primären Zellkultivierungsbedingungen schwierig sein kann. Darüber hinaus erfordert die Aufrechterhaltung der dynamischen Eigenschaften des Zytoskeletts ein geringes Maß an Transfektion, um ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten, ohne eine Mikrotubuli-Stabilisierung zu verursachen. Es ist wichtig, Maßnahmen zu ergreifen, um die Zellen vor lichtinduziertem Stress und dem Ausbleichen von Fluoreszenzfarbstoffen zu schützen. Im Laufe unserer Arbeit testeten wir verschiedene Transfektionsmethoden und -protokolle sowie verschiedene Vektoren, um die beste Kombination von Bedingungen auszuwählen, die für humane primäre Fibroblastenstudien geeignet sind. Wir analysierten die resultierenden Zeitraffervideos und berechneten die Mikrotubuli-Dynamik mit ImageJ. Die Dynamik der Pluspunkte der Mikrotubuli in den verschiedenen Zellteilen ist nicht ähnlich, daher haben wir die Analyse in Untergruppen unterteilt - die Zentrosomenregion, die Lamelle und den Schwanz der Fibroblasten. Insbesondere kann dieses Protokoll für die In-vitro-Analyse der Zytoskelettdynamik in Patientenproben verwendet werden, was den nächsten Schritt zum Verständnis der Dynamik der verschiedenen Krankheitsentwicklungen ermöglicht.

Einleitung

Die Huntington-Krankheit (HD) ist eine unheilbare neurodegenerative Pathologie, die durch eine Mutation im Gen verursacht wird, das für dasHuntingtin-Protein (HTT) kodiert. HTT ist in erster Linie mit Vesikeln und Mikrotubuli assoziiert und wahrscheinlich an mikrotubuliabhängigen Transportprozessen beteiligt^1,2. Um den Einfluss von mutiertem HTT auf die Dynamik der Mikrotubuli zu untersuchen, verwendeten wir in vitro die Visualisierung des EB3-Proteins, das die dynamischen Eigenschaften von Mikrotubuli durch Bindung und Stabilisierung der wachsenden Plus-Enden reguliert. Um fluoreszierend markiertes EB3 in menschliche Hautfibroblasten zu laden, wurde eine Plasmidtransfektion angewendet. Wir verwendeten die primäre Fibroblastenkultur, die aus der Hautbiopsie der Huntington-Patienten für diese Studie gewonnen wurde.

Die Mutation im HTT-Protein-Gen führt zu einer Verlängerung des Polyglutamintraktes³. HTT spielt eine Rolle bei zellulären Prozessen wie Endozytose^4,Zelltransport^1,2,Proteinabbau⁵usw. Ein wesentlicher Teil dieser Prozesse betrifft verschiedene Elemente des Zellzytoskeletts, einschließlich der Mikrotubuli.

Menschliche Primärzellen sind das beste Modell, um Ereignisse, die in Patientenzellen auftreten, so genau wie möglich zu reproduzieren. Um solche Modelle zu erstellen, muss man Zellen aus menschlichem Biopsiematerial (z.B. aus chirurgischen Proben) isolieren. Die resultierende primäre Zelllinie eignet sich zur Untersuchung der Pathogenese mit verschiedenen genetischen, biochemischen, molekularen und zellbiologischen Methoden. Auch menschliche Primärzellkulturen dienen als Vorläufer für die Schaffung verschiedener transdifferenzierter und transgener Kulturen⁶.

Im Gegensatz zu immortalisierten Zellkulturen ist der wesentliche Nachteil von Primärzellen jedoch ihre begrenzte Passagefähigkeit. Daher empfehlen wir die Verwendung von Zellen im frühen Passagenstadium (bis zu 15). Ältere Kulturen degenerieren sehr schnell und verlieren ihre einzigartigen Eigenschaften. Daher sollten die neu gewonnenen Primärzellen für die Langzeitlagerung eingefroren gehalten werden.

Primäre Zellkulturen sind anfällig für Kultivierungsbedingungen. Daher erfordern sie oft einzigartige Ansätze und die Optimierung der Wachstumsbedingungen. Insbesondere die primären Fibroblasten der menschlichen Haut, die in unseren Experimenten verwendet werden, stellen hohe Anforderungen an das Substrat. Daher haben wir je nach Versuchstyp verschiedene zusätzliche Beschichtungen (z.B. Gelatine oder Fibronektin) verwendet.

Das Zellzytoskelett bestimmt die Zellform, Beweglichkeit und Fortbewegung. Die Dynamik des Zytoskeletts ist entscheidend für viele intrazelluläre Prozesse sowohl in der Interphase als auch in der Mitose. Insbesondere das aus Tubulin polymerisierte Zytoskelett sind hochdynamische und polare Strukturen, die einen motorproteinvermittelten gerichteten intrazellulären Transport ermöglichen. Die Enden der Mikrotubuli befinden sich in ständiger Neuanordnung, ihre Montagephasen wechseln sich mit den Demontagephasen ab, und dieses Verhalten wird als "dynamische Instabilität"^{bezeichnet 7,8,9}. Verschiedene assoziierte Proteine verschieben das Gleichgewicht der Polymerisationsreaktion, was entweder zur Polymerbildung oder zur Proteinmonomerbildung führt. Die Zugabe von Tubulin-Untereinheiten erfolgt hauptsächlich am Plus-Ende der Mikrotubuli¹⁰. Die Familie der endbindenden (EB) Proteine besteht aus drei Mitgliedern: EB1, EB2 und EB3. Sie dienen als Plus-End-Tracking-Proteine (+TIPs) und regulieren die dynamischen Eigenschaften von Mikrotubuli, indem sie ihre wachsenden Plus-Enden binden und stabilisieren¹¹.

Viele Studien verwenden fluoreszierende Molekül-markierte Tubulin-Mikroinjektion oder Transfektion mit Zeitraffer-Bildgebung und Videoanalyse, um Mikrotubuli in vitrozu visualisieren. Diese Methoden können invasiv und schädlich für Zellen sein, insbesondere für primäre menschliche Zellen. Der schwierigste Schritt besteht darin, Bedingungen für die Zelltransfektion zu finden. Wir haben versucht, das höchstmögliche Maß an Transfektion zu erreichen, ohne die Lebensfähigkeit und die native Zellmorphologie zu beeinträchtigen. Diese Studie wendet die klassische Methode an, um die Unterschiede in der Mikrotubulidynamik in Hautfibroblasten von gesunden Spendern und Patienten mit der Huntington-Krankheit zu untersuchen.

Protokoll

Dieses Protokoll folgt den Richtlinien des Bundesforschungs- und Klinischen Zentrums für Physikalisch-Chemische Medizin des Medizinischen Bundesamtes vom 08. September 2015.

HINWEIS: Abbildung 1 gibt einen Überblick über das Protokoll.

1. Gewinnung einer Primärkultur menschlicher Hautfibroblasten (Abbildung 2)

1. Bringen Sie die Biopsie innerhalb weniger Stunden in Dulbeccos Modified Eagle Media (DMEM) Medium in ein Labor, ergänzt mit 50 μg/ml Penicillin und 50 U/ml Streptomycin.
   HINWEIS: Eine Hautbiopsie muss unter sterilen Bedingungen von einem Arzt durchgeführt werden, nachdem ein Patient eine Einverständniserklärung unterzeichnet hat.
2. Legen Sie das Biopsiegewebe zusammen mit einer kleinen Menge des Mediums in eine 6 cm große Petrischale.
3. Schneiden Sie die Biopsieprobe mit einem sterilen Skalpell in Stücke von etwa 0,5-1 mm Größe. Legen Sie 1-2 erhaltene Fragmente in eine 3,5 cm Petrischale und legen Sie einen sterilen Deckglas über die Biopsiestücke. Fügen Sie langsam 1,5 ml eines Wachstumsmediums zu der folgenden Zusammensetzung hinzu: DMEM, 50 U / ml Penicillin-Streptomycin und 10% fetales Rinderserum (FBS).
4. Kulturfibroblasten im Wachstumsmedium in_einem CO 2-Inkubator, der bei 5%_CO2,37 °C, 80% Luftfeuchtigkeit gehalten wird.
   HINWEIS: Nach 4-7 Tagen beginnen zuerst Keratinozyten, dann Fibroblasten, vom Gewebe zum Boden der Schale zu wandern.

2. Lagerung, Einfrieren und Auftauen der Primärkultur

1. Zellen aus der Kulturschale entnehmen (siehe Nummern 3.2-3.4).
2. Die Zellsuspension wird für 5 min bei 200 x g in ein konisches 15-ml-Rohr und eine Zentrifuge gegeben. Dann verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Zellpellet in 900 μL gekühltem FBS.
3. Tropfenweise in ein Kryokonservierungsrohr geben und 100 μL Dimethylsulfoxid (DMSO) zugeben.
4. Legen Sie die Kryosonde in einen Niedertemperatur-Gefrierschrank bei -80 °C. Vierundzwanzig Stunden später wird das Kryovial zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff (−196 °C) überführt.
5. Um die kryokonservierten Zellen aufzutauen, entfernen Sie das Kryovial aus dem Stickstoffspeicher und geben innerhalb von 1 min 1 ml des Inhalts in ein 15 mL konisches Röhrchen mit 9 mL des auf 37 °C vorgewärmten Transportmediums.
6. Vorsichtig resuspendieren und dann das Röhrchen für 5 min bei 200 x gzentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand, resuspenieren Sie das Zellpellet im erforderlichen Volumen des Wachstumsmediums und legen Sie es auf eine Petrischale mit dem erforderlichen Durchmesser.

3. Zellkultivierung

1. Den Schalenboden mit autoklavierter 0,1%iger Gelatinelösung bedecken, die in destilliertem Wasser zubereitet wird. 15 Min. inkubieren.
   HINWEIS: Zur Transfektionsvisualisierung sollte Glasbodenplattengeschirr (konfokales Geschirr mit Glasdicke 170 μm) verwendet werden.
2. Bereiten Sie ein Kulturmedium mit folgender Zusammensetzung vor: DMEM ergänzt mit 10% FBS, 2 mM L-Alanyl-L-Glutamin, 50 U/ml Penicillin-Streptomycin. Gründlich mischen und bei 4 °C lagern. Erwärmen Sie das Medium auf 37 °C, bevor Sie es den Zellen hinzufügen.
3. Beurteilen Sie die Kultur unter dem Mikroskop. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Fibroblasten mit Dulbeccos Phosphat-Salz-Lösung (DPBS).
4. Geben Sie 1 ml vorgewärmte 0,25% ige Trypsinlösung zu den Zellen hinzu. Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop, ob sie sich vollständig vom Substrat lösen. Trypsin mit 1 ml des Kulturmediums deaktivieren.
5. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein konisches 15-ml-Rohr. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 200 x g für 5 min, entfernen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Zellpellet in 1 mL des Kulturmediums.
6. Zählen Sie die Anzahl der Zellen. Berechnen Sie die erforderliche Anzahl von Zellen, um sie mit einer Dichte von 8-15 x 10³/^cm2 zu säen und in 2 ml des Kulturmediums zu resuspendieren.
7. Entfernen Sie die Gelatinelösung aus der Kulturschale und fügen Sie sofort 2 ml der Zellsuspension hinzu. Fibroblasten bei 37 °C in einem CO₂ -Inkubator kultivieren.
8. Aktualisieren Sie das Medium alle 2-4 Tage.
   HINWEIS: Verwenden Sie für Experimente die Zellen von 4-11 Passagen.

4. Transfektion

1. Ersetzen Sie das Kulturmedium 24 h vor der Transfektion durch ein Frischekulturmedium.
   HINWEIS: Der Zellzusammenfluss sollte 70-80% betragen.
2. Bereiten Sie einen DNA-Lipid-Komplex basierend auf der Fläche und Dichte der Zellaussaat vor. Verwenden Sie Liposomen-basiertes Transfektionsmittel.
   HINWEIS: Verwenden Sie die Zellsaatdichte als 1 x 10⁴ Zellen/cm².
3. Fügen Sie 3 μL handelsübliches Transfektionsreagenz zu 125 μL optimalem minimal essentiellem Medium (Opti-MEM) hinzu, das keine Antibiotika enthält, ohne die Wände des Röhrchens zu berühren. Vorsichtig resuspendieren.
4. Verdünnung der Plasmid-DNA (GFP-EB3) durch Zugabe von 1 μg der Plasmid-DNA zu 125 μL Opti-MEM. Vorsichtig resuspendieren.
   HINWEIS: Ausdrucksvektorkodierung GFP-EB3¹¹ wurde als freundliches Geschenk von Dr. I. Kaverina (Vanderbilt University, Nashville) mit Genehmigung von Dr. A. Akhmanova (Erasmus Universität, Rotterdam)¹¹erhalten.
5. Zu jedem Röhrchen verdünnter Transfektionsreagenz (1:1) verdünnte Plasmid-DNA geben. 30 Min. inkubieren.
6. Den DNA-Lipid-Komplex in die 6 cm große Petrischale geben, die Zellen enthält, und 30 s lang mit einer kreuzförmigen Schaukel vermischen. Inkubieren Sie Zellen mit einem Transfektionsmittel für 24 h und wechseln Sie dann zu frischem Medium. Analysieren Sie die Effizienz der Transfektion nach 24 h und 48 h.
   HINWEIS: 24 h nach der Transfektion betrug der Wirkungsgrad 10-15% und nach 48 h bis zu 40%.

5. Vorbereiten der Bildgebung

1. Wechseln Sie vor der Live-Bildgebung von Zellen das Kulturmedium in ein Medium ohne pH-Indikatorfarbstoff, um die Autofluoreszenz zu reduzieren.
2. Tragen Sie Mineralöl vorsichtig auf die Mediumsoberfläche auf, um das Medium vollständig zu bedecken, und isolieren Sie es von der äußeren Umgebung, um das Eindringen von O₂ und die Verdampfung des Mediums zu reduzieren.
3. Verwenden Sie eine Quecksilberlampe und ein 60-faches oder 100-faches Objektiv mit hoher Ziffernöffnung, um die Bilder aufzunehmen.
   HINWEIS: Für In-vivo-Beobachtungen muss das Mikroskop mit einem Inkubator ausgestattet sein, um die notwendigen Bedingungen für die Zellen aufrechtzuerhalten, einschließlich der Erwärmung des Objekttisches und der Linse auf +37 °C, einer geschlossenen Kammer mit CO_{2 -Versorgung} und feuchtigkeitsabhängiger Unterstützung. Verwenden Sie doppelt destilliertes Wasser, um Feuchtigkeit zu erzeugen. Überprüfen Sie den Gehalt an doppelt destilliertem Wasser vor dem Filmen.
4. Legen Sie die konfokale Schale mit den Zellen vor der Bildgebung in den Mikroskophalter. Stellen Sie sicher, dass die Schüssel und die Kamera sicher an der Halterung befestigt sind, um ein Driften während der Aufnahme von Bildern zu vermeiden.

6. Einstellen der Bildgebungsparameter

1. Wählen Sie die niedrigen Expositionswerte, da Licht zellschädigende reaktive Sauerstoffspezies (ROS) induziert.
   HINWEIS: Um die Dynamik von Mikrotubuli in menschlichen Hautfibroblasten zu untersuchen, wurde eine Exposition von 300 ms gewählt.
2. Konzentrieren Sie sich auf das Objekt von Interesse.
   HINWEIS: Verwenden Sie für Langzeit-Zeitrafferaufnahmen das automatische Fokusstabilisierungssystem, um eine mögliche Verschiebung entlang der z-Achse auszugleichen.
3. Wählen Sie die optimalen Bildgebungsbedingungen in Abhängigkeit von der Lichtempfindlichkeit der Zellen und der Rate des Fluorochrom-Fadings.
   HINWEIS: Da Mikrotubuli hochdynamische Strukturen sind, kann ein relativ kurzes Zeitintervall gewählt werden, und die Bildrate muss ausreichend hoch sein. Um die Mikrotubuli-Dynamik in Hautfibroblasten zu untersuchen, verwendeten wir eine Frequenz von 1 Frame/s für 3-5 min.
4. Wenn Sie das nächste Objekt auswählen, um das Bild abzurufen, entfernen Sie sich von dem bereits abgebildeten Bereich. Da dieser Bereich unter Lichteinfluss stand, kommt es zu einer spürbaren Fotobleiche.
   HINWEIS: Da eine relativ hohe Abbildungsfrequenz verwendet wurde, schloss sich der Verschluss zwischen den Bildern nicht und die Lampe wurde während der gesamten Bildgebungsdauer beleuchtet, weshalb das Verblassen zunahm.
5. Wählen Sie das optimale Video für die visuelle Untersuchung der Dynamik der Mikrotubuli unter Berücksichtigung der Qualität der Transfektion, der Qualität der Bilder der Mikrotubuli (optimales Signal-Rausch-Verhältnis) und der Abwesenheit von Drift im Falle der analysierten Zelle (Abbildung 3).
6. Verwenden Sie die ausgewählten Videos, um die Plus-Ends-Dynamik der Mikrotubuli zu untersuchen, indem Sie sie im Programm ImageJ oder Fiji nachzeichnen (Abbildung 4).
   ANMERKUNG: Für Anweisungen zur quantitativen Analyse siehe Ergänzende Abbildung 2 und Ergänzende Akte 1.

Ergebnisse

Die resultierenden GFP-EB3-Filme, die mit dem Protokoll hergestellt wurden (Abbildung 1), veranschaulichen die dynamischen Eigenschaften der Mikrotubuli. Mikrotubuli sind an verschiedenen Zellprozessen beteiligt, und ihre dynamischen Eigenschaften beeinflussen verschiedene Lebenseigenschaften der primären menschlichen Zellkultur aus dem Biopsiematerial des Patienten (Abbildung 2).

Die folgenden Parameter bestimmen die dynamische Inst...

Diskussion

Qualitativ bessere Ergebnisse für die Dynamikanalyse von Mikrotubuli können aus hochwertigen mikroskopischen Bildern gewonnen werden. Es ist wichtig, alle notwendigen Bedingungen für die Zeitraffer-Bildgebung lebender Zellen zu beachten und die Bildgebungsparameter korrekt einzustellen. Die Verwendung spezieller Zellkulturschalen mit Glasboden (konfokale Schalen) ist wichtig, da Glas einen anderen Lichtbrechungsindex aufweist als Kunststoff. Die Dicke des Glases und seine Gleichmäßigkeit über seine gesamte Fläche ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instrumentation
Camera iXon DU897 EMCCD	Andor Technology
Eppendorf Centrifuge 5804 R	Eppendorf Corporate
Fluorescence filter set HYQ FITC	Nikon		Alternative: Leica, Olympus, Zeiss
LUNA-II Automated Cell Counte	Logos Biosystems	L40002
Microscope incubator for lifetime filming	Okolab	Temperature controller H301-T-UNIT-BL-PLUS
		Gas controller CO2-O2-UNIT-BL
Objective lens CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13)	Nikon		Alternative: Leica, Olympus, Zeiss
Widefield fluorescence light microscope Eclipse Ti-E	Nikon		Alternative: Leica, Olympus, Zeiss
Software
Fiji (Image J version 2.1.0/1.53c)	Open source image processing software
NIS Elements	Nikon		Alternative: Leica, Olympus, Zeiss
Additional reagents
Mineral oil (Light white oil)	MP	151694
Cell culture dish
Cell Culture Dish	SPL Lifesciences	20035
Confocal Dish (glass thickness 170 µm)	SPL Lifesciences	211350	Alternative: MatTek
Conical Centrifuge tube	SPL Lifesciences	50015
Cryogenic Vials	Corning-Costar	430659
Microcentrifuge Tube	Nest	615001
Cultivation
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	L3000001
Dimethyl sulfoxide	PanEko	135
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media)	PanEko	C420
DPBS (Dulbecco's phosphate-salt solution)	PanEko	P060
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	K053/SH30071.03
Gelatin (bovine skin)	PanEko	070
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050038
Opti-MEM (1x) + Glutamax	Gibco	519850026
Penicillin-streptomycin	PanEko	A063
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo Fisher Scientific	25200072
Transfection
Plasmid DNA with EB3-GFP	Kind gift of Dr. I. Kaverina [Vanderbilt University, Nashville] with permission from Dr. A. Akhmanova [Erasmus University, Rotterdam]	Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003